Зонд и набор (варианты) для детекции целевой нуклеиновой кислоты, спейсер, подходящий для присоединения к специфической к мишени последовательности зонда и способ детекции любого взаимодействия между зондом и целевой нуклеиновой кислотой

Зонд и набор (варианты) для детекции целевой нуклеиновой кислоты, спейсер, подходящий для присоединения к специфической к мишени последовательности зонда и способ детекции любого взаимодействия между зондом и целевой нуклеиновой кислотой

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к анализу взаимодействий между молекулами.

Предшествующий уровень техники

Однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphism, SNP) общепризнаны в качестве важной причины варьирования биологических функций. Хотя SNP могут оказывать важное влияние, наибольшее генетическое разнообразие наблюдается в некодирующих последовательностях ДНК. Кроме важности SNP в генетике человека, обнаружение SNP является важным также в области инфекционных заболеваний. Генотипирование является важным индикатором инфекций, вызываемых вирусом папилломы человека (HPV). В настоящее время семейство HPV содержит более тысячи генотипов, которые можно классифицировать в различные группы, включающие в себя важные для человека патогены (de Villiers et al, 2004). В частности, известно, что типы HPV высокого риска индуцируют рак шейки матки. Поэтому распознавание этих типов высокого риска требует надежных способов диагностики, делающих возможным наиболее адекватное лечение.

Анализы нуклеиновых кислот основаны на детекции специфических последовательностей ДНК или РНК. Целевые нуклеиновые кислоты, например полученные из клинических образцов, можно распознавать мечеными детекторными зондами. Специфичность анализа определяется специфичностью процесса гибридизации между мишенью и зондом. Однако обнаружение SNP требует максимального уровня специфичности. Кроме того, в настоящее время имеется много методик обнаружения SNP (например, гибридизация, секвенирование и масс-спектрометрический анализ), но ни один из них не объединяет эффективно высокую производительность и скрининг SNP с высокой плотностью. Тем не менее необходимость в таких способах растет.

Применение гранул (или микрогранул), таких как сферические гранулы, также обозначенные в данном описании как микросферы, в мультиплексном анализе было описано ранее, например, в Dunbar SA (Заявки на технологию под торговой маркой Luminex™(R) xMAP для быстрой высокопроизводительной мультиплексной детекции нуклеиновых кислот. Clin Chim Acta. 2005 Aug 15); [опубликовано в электронном виде до выхода из печати], Clin Chim Acta. 2006 Jan; 363(1-2):71-82, см.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=16102740&query h1=1) и веб-сайт информации о продуктах Luminex^ТМ (www.Luminex^ТМcorp.com). Система Luminex^ТМ представляет собой мультиплексную (матричную) технологию на основе гранул, которая оказалась очень эффективной для анализа множественных параметров или аналитов в одном образце (Dunbar et al, 2005). Она выдает результаты для многих биоаналитических форматов, включая анализы нуклеиновых кислот, анализы лиганд-рецепторных взаимодействий, иммуноанализы и ферментативные анализы.

Применение микроматриц на гранулах в жидкой фазе (liquid bead microarrays) для детекции HPV обсуждается в Wallace J et al, ("Facile, comprehensive, high-throughput genotyping of human genital papillomaviruses using spectrally addressable liquid bead microarrays." J Mol Diagn. 2005 Feb; 7(1)72-80).

Хотя протоколы и материалы для систем типа Luminex^ТМ известны и опубликованы и приведены на веб-сайте Luminex, существует дополнительная потребность в улучшении таких методик и материалов. Например, авторы изобретения обнаружили, что некоторые стандартные протоколы для применения микроматриц на гранулах в жидкой фазе не эффективны для разных SNP в маленьких мишенях или для систем, где имеются множественные точечные мутации, которые не всегда находятся в середине зонда. Для системы ТМАС, обычно используемой в Luminex, также рекомендуется постоянная длина зонда в пределах данной мультиплексной реакции. Более того, ТМАС является токсичной и нестабильной при повышенных температурах.

Настоящее изобретение направлено на такую потребность в улучшениях зонда и протокола, подходящих для применения с системами анализа на основе гранул, такими как Luminex.

Изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способу детекции любого взаимодействия между зондом и целевой нуклеиновой кислотой, включающему следующие стадии:

1) денатурация любой двухцепочечной полинуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в образце;

2) гибридизация денатурированной мишени с зондом в условиях, которые позволяют осуществиться специфической гибридизации между зондом и мишенью;

3) возможно жесткая промывка;

4) добавление репортерной молекулы и инкубация с ней, делающие возможным детекцию связывания зонда с мишенью;

5) возможно промывка; и

6) детекция связывания зонда с мишенью,

где указанный способ включает одну или более из следующих дополнительных стадий:

а) поддержание температуры гибридизация после стадии гибридизации между зондом и мишенью после стадии (2);

б) применение стадии разведения-промывки сразу после стадии гибридизации (2);

в) поддержание температуры гибридизации во время любой жесткой промывки на стадии (3);

г) встряхивание или перемешивание при нагревании на стадии (2), например, с использованием термомиксера на стадии (2);

е) поддержание температуры гибридизации во время инкубации с репортерной молекулой на стадии (4);

В одном из аспектов температуру гибридизации поддерживают, начиная со стадии (2) до тех пор, пока не завершится реакция с репортерной молекулой на стадии (4).

В одном из аспектов осуществляют стадии (а) и (в), т.е. температуру гибридизации поддерживают после стадии гибридизации между зондом и мишенью и во время стадии жесткой промывки на стадии (3).

В другом аспекте зонд связывают с подложкой в виде частиц, такой как гранула.

Изобретение также относится к зонду, подходящему для связывания с подложкой в виде частиц, такой как гранула, содержащей:

а) связывающую группу (такую как группа NH₂), которая делает возможным связывание (такое как ковалентное связывание) зонда с поверхностью подложки в виде частиц;

б) спейсер; и

в) мишень-специфическую олигонуклеотидную последовательность зонда,

где спейсер содержит:

1) олигонуклеотидный спейсер из по меньшей мере 15 нуклеотидов, такой как спейсер из повторов тимина или спейсер, содержащий повторяющийся блок TTG, между мишень-специфической последовательностью зонда и связывающей группой; и возможно

2) углеродный спейсер из 3-50 или 13-50 углеродных звеньев, соответственно С₁₈-спейсера, между мишень-специфической последовательностью зонда и связывающей группой.

В одном из аспектов спейсер находится на 3′-конце мишень-специфической последовательности зонда.

В другом аспекте спейсер находится на 5′-конце мишень-специфической последовательности зонда.

Изобретение также относится к набору зондов, описанных в данной заявке, который содержит по меньшей мере две разные, мишень-специфические последовательности зонда, связанные с разными подложками в виде частиц, отличающимися друг от друга, например, благодаря разным меткам, таким как флуоресцентные метки или штрих-коды.

Изобретение также относится к набору от 2 до 1000, например от 2 до 50 разных мишень-специфических зондов, где каждый зонд содержит:

а) связывающую группу, которая делает возможным связывание зонда с твердой подложкой;

б) спейсер; и

в) мишень-специфическую олигонуклеотидную последовательность зонда,

где спейсер содержит один или оба из следующего:

1) углеродный спейсер из 13-50 углеродных звеньев между мишень-специфической последовательностью зонда и группой, связывающейся с подложкой; и

2) олигонуклеотидный спейсер из по меньшей мере 15 нуклеотидов между мишень-специфической последовательностью зонда и группой, связывающейся с подложкой, где этот олигонуклеотидный спейсер не гибридизуется с мишенью или с фланкирующим участком данной мишени.

Изобретение также относится к спейсерным последовательностям как таковым, как определено в любом аспекте данного изобретения.

Изобретение также относится к наборам, содержащим спейсерную молекулу по изобретению и подложку в виде частиц, такую как гранула.

Изобретение также относится к набору, содержащему спейсерную молекулу по изобретению и инструкции по связыванию с подложкой в виде частиц, такой как гранула.

Изобретение также относится к подложке в виде частиц, такой как гранула, связанной с зондом, как определено в данном описании.

Изобретение также относится к набору, содержащему подложку в виде частиц, такую как гранула, связанная со спейсерной молекулой по изобретению, и инструкции для применения в детекции молекулы-мишени.

Изобретение также относится к набору, содержащему подложку в виде частиц, такую как гранула, связанную с зондом по изобретению, и инструкции для применения в детекции молекулы-мишени.

Изобретение также относится к набору, содержащему зонд, где указанный зонд содержит:

а) связывающую группу, которая делает возможным связывание зонда с поверхностью подложки в виде частиц;

б) спейсер; и

в) мишень-специфическую олигонуклеотидную последовательность зонда,

где спейсер содержит один или оба из следующего:

1) углеродный спейсер из 13-50 углеродных звеньев между мишень-специфической последовательностью зонда и группой, связывающейся с подложкой; и

2) олигонуклеотидный спейсер из по меньшей мере 15 нуклеотидов между мишень-специфической последовательностью зонда и группой, связывающейся с подложкой;

и подложку в виде частиц, такую как полистирольные гранулы.

Изобретение также относится к набору, содержащему зонд, где указанный зонд содержит:

а) связывающую группу, которая делает возможным связывание зонда с поверхностью подложки в виде частиц;

б) спейсер; и

в) мишень-специфическую олигонуклеотидную последовательность зонда,

где спейсер содержит один или оба из следующего:

1) углеродный спейсер из 13-50 углеродных звеньев между мишень-специфической последовательностью зонда и группой, связывающейся с подложкой; и

2) олигонуклеотидный спейсер из по меньшей мере 15 нуклеотидов между мишень-специфической последовательностью зонда и группой, связывающейся с подложкой;

и инструкции по связыванию с подложкой в виде частиц, такой как полистирольные гранулы.

Графические материалы

На Фиг.1а и 1б дана общая схема конструкции зонда и спейсера.

На Фиг.1в она дополнительно разработана.

На Фиг.2 дана схема протокола анализа для системы детекции на основе гранул.

Подробное описание

В настоящем изобретении предложены улучшения в протоколах и реагентах, используемых в стандартном анализе на основе суспензии гранул для детекции нуклеиновых кислот, таком как анализ на основе Luminex™.

Подложки в виде частиц для применения в настоящем изобретении включают, в частности, гранулы, которые включают, например, сферические гранулы или цилиндрические гранулы. Гранулы можно обозначать также как микрогранулы или гранулы для применения в микрочипах. Описание данного изобретения в отношении гранул также применимо к другим подложкам в виде частиц для применения в данном изобретении.

Гранулы для применения в настоящем изобретении, которые включают описанные в данной заявке микросферы, соответственно представляют собой гранулы, которые подходят для применения в проточном цитометрическом анализе. Эти гранулы соответственно способны связываться с зондом для детекции взаимодействия между зондом и мишенью. В одном из аспектов гранулы мечены уникальной флуоресцентной молекулой или комбинацией молекул. Соответственно, мета на гранулах или в гранулах может быть идентифицирована с использованием лазерного возбуждения одного или более флуорохромов в грануле. В одном из аспектов гранула представляет собой полистирольную гранулу. В другом аспекте гранула представляет собой стеклянную гранулу.

Например, система Luminex хМАР включает 5,6 мкм полистирольные микросферы, которые окрашиваются внутри двумя спектрально различными флуорохромами (см. выше Dunbar et al). Такие гранулы подходят для применения в настоящем изобретении.

Другие системы мечения гранул для применения в данном изобретении включают в себя штрих-коды или цифровые голографические элементы, например меченые штрих-кодом цилиндрические гранулы от Illumina Inc. Штрих-коды или цифровые голографические элементы можно использовать в качестве альтернативы флуоресцентным меткам.

Например, система Illumina VeraCode включает цилиндрические стеклянные микрогранулы размером 240 мкм в длину на 28 мкм в диаметре, которые имеют встроенные в них цифровые голографические элементы для создания уникальных типов гранул. При возбуждении лазером каждая гранула VeraCode излучает уникальное кодовое изображение, которое может быть специфически обнаружено.

В одном из аспектов данного изобретения гранулы также могут иметь магнитные или парамагнитные свойства.

Обычно гранулы являются подходящими для применения в мультиплексной системе для одновременной детекции любого взаимодействия между множеством возможных мишеней и множеством зондов.

В примерах в данном описании использованы мишени, представляющие собой вирус папилломы человека (HPV), и зонды к нему, но разработанные принципы могут быть по существу использованы для детекции полинуклеиновой кислоты из любого источника.

Стандартные методики молекулярной биологии раскрыты в Sambrook et al, (Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Press, third edition). Детали, например, принципов и параметров, относящихся к гибридизации между зондами и мишенью, и амплификации полинуклеиновой кислоты-мишени раскрыты в ЕР1012348, включенном в данное описание посредством ссылки.

Зонды

Зонд обычно содержит (1) связывающую группу (такую как группа NH₂), которая делает возможным (соответственно ковалентное) связывание зонда с поверхностью гранулы, (2) спейсер, который служит для создания расстояния между поверхностью гранулы и специфической последовательностью зонда, и (3) мишень-специфическую олигонуклеотидную последовательность зонда (которую также можно обозначить в данном описании как мишень-специфическую последовательность зонда).

В одном из аспектов зонды имеют первичную аминогруппу, подходящую для связывания с карбоксильной группой на грануле или другой подложке.

В одном из аспектов изобретение относится к зондам, которые содержат специфические к мишени, представляющей собой HPV, последовательности зонда, такие как опубликованные наборы зондов SPF10 (см. ЕР1012348, включен в данное описание посредством ссылки), например, к HPV, или к любому зонду или комбинации зондов, описанному(ых) в данной заявке, в частности в Примере 13, возможно связанному(ых) с полиуглеродным повтором.

В одном из аспектов изобретение является подходящим для идентификации SNP, имеющих место в пределах короткого фрагмента целевой нуклеиновой кислоты, обычно фрагмента ДНК, амплифицированной из образца, такого как фрагмент длиной 20-50 оснований, такой как 20-30 оснований, такой как 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 оснований.

В другом аспекте изобретение способно различать ошибочные спаривания, которые находятся в иных, чем середина зонда, положениях. В одном из аспектов изобретение можно использовать для различения ошибочных спариваний, которые находятся на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 оснований или даже более от центра зонда. В одном из аспектов изобретение можно использовать для различения ошибочных спариваний, которые находятся на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 оснований или даже более от любого конца зонда, соответственно на 3-10 оснований.

Зонды по настоящему изобретению делают возможным различение мишени и не-мишени в сайтах, близких к концу зонда, что делает возможным зондирование коротких целевых фрагментов на присутствие множества разных SNP.

Спейсеры на основе атомов углерода и комбинации с олигонуклеотидными спейсерами

В одном из аспектов данного изобретения зонд содержит углеродный спейсер из 3-50 или 13-50 углеродных звеньев, в одном из аспектов С20-С50 спейсер, такой как С20-С40 спейсер или такой как С20-С30 спейсер, между мишень-специфической последовательностью зонда и связывающей группой. Можно использовать любой подходящий спейсер, такой как С13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или С50 спейсер. Соответствующий спейсер может быть выбран с использованием стандартных методов по эффекту на специфичность связывания и интенсивность сигнала для получения оптимального результата.

В одном из аспектов данного изобретения зонд содержит олигонуклеотидный спейсер, дополнительно к углеродному спейсеру, где олигонуклеотидный спейсер содержит по меньшей мере 15 нуклеотидов или по меньшей мере 20 нуклеотидов, таких как из 15-150 или 20-150 нуклеотидов, например 25-100 нуклеотидов, 30-75 нуклеотидов, включая 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 и 45-50 нуклеотидов. Олигонуклеотидный спейсер может представлять собой, например, гомополимер или гетерополимер. В одном из аспектов олигонуклеотидный спейсер представляет собой политиминовый (поли-Т) спейсер или спейсер, содержащий другие подходящие повторяющиеся нуклеотидные звенья, такой как (TTG) повторяющийся спейсер, или поли-А (аденин) спейсер, или поли-G спейсер, или поли-С спейсер. Другие гетерополимерные спейсеры, которые могут быть подходящими, включают в себя повторы TTTG, AAG, AAC, AAAG или АААС. Разные спейсеры могут быть протестированы для оптимизации взаимодействий зонд-мишень с использованием рутинных способов, хорошо известных в данной области.

Таким образом, в одном из аспектов в данном изобретении в общем предложен зонд, содержащий как углеродный спейсер, так и олигонуклеотидный спейсер.

В одном из аспектов олигонуклеотидный спейсер находится между углеродным спейсером и специфической последовательностью зонда. В таком случае углеродный спейсер может быть короче в длину, чем 13 атомов углерода, таким как С12, или даже короче.

В одном из аспектов олигонуклеотидный спейсер выбран так, что он не гибридизуется с последовательностью-мишенью или фланкирующим участком данной последовательности-мишени. В одном из аспектов олигонуклеотидный спейсер выбран так, что он не гибридизуется с последовательностью-мишенью или с фланкирующим участком данной последовательности-мишени при использовании в описанном в данной заявке способе.

В одном из аспектов олигонуклеотидный спейсер выбран так, что участок спейсера, который фланкирует мишень-специфический зонд, не гибридизуется с последовательностью-мишенью или с фланкирующим участком данной последовательности-мишени. Это проиллюстрировано на Фиг.1в.

Полиуглеродные спейсеры раскрыты в Cowan et al (Transfer of a Mycobacterium tuberculosis genotyping method, Spoligotyping, from a reverse line-blot hybridization, membrane-based analysis to the Luminex multianalyte profiling system. J Clin Microbiol. 2004 Jan; 42(1):474-7) и Taylor et al (Taylor JD, Briley D, Nguyen Q, Long K, lannone MA, Li MS, Ye F, Afshari A, Lai E, Wagner M, Chen J, Weiner MP. Flow cytometric platform for high - throughput single nucleotide polymorphism analysis. Biotechniques. 2001 Mar; 30(3):661-6, 668-9).

Углеродные спейсеры представляют собой соответственно (СН₂)_n-спейсеры.

Олиго-спейсеры

Таким образом, в одном из аспектов в данном изобретении предложен зонд, содержащий только олигонуклеотидный спейсер между группой, связывающейся с гранулой, и мишень-специфической последовательностью зонда (т.е. в отсутствие углеродного спейсера).

В одном из аспектов этот спейсер содержит по меньшей мере 15 нуклеотидов или по меньшей мере 20 нуклеотидов. В одном из аспектов этот спейсер состоит из 15-150 или 20-150 нуклеотидов, например 25-100 нуклеотидов, 30-75 нуклеотидов, включая 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 и 45-50 нуклеотидов.

Олигонуклеотидный спейсер может быть, например, гомополимером или гетерополимером. В одном из аспектов олигонуклеотидный спейсер представляет собой политиминовый спейсер (поли-Т) или спейсер, содержащий другие подходящие повторяющиеся нуклеотидные блоки, такой как спейсер, представляющий собой повторы (TTG), или спейсер, представляющий собой поли-А (аденин), или спейсер, представляющий собой поли-G, или спейсер, представляющий собой поли-С. Другие гетерополимерные спейсеры, которые могут быть подходящими, включают в себя повторы TTTG, AAG, ААС, AAAG или АААС. Разные спейсеры могут быть протестированы для оптимизации взаимодействий зонд - мишень с использованием рутинных способов, хорошо известных в данной области.

Таким образом, в одном из аспектов в данном изобретении предложен зонд, содержащий олигонуклеотидный спейсер между группой, связывающейся с гранулой, и мишень-специфической последовательностью зонда, где олигонуклеотидный спейсер представляет собой политиминовый (поли-Т) спейсер.

Таким образом, в одном из аспектов в данном изобретении предложен зонд, содержащий олигонуклеотидный спейсер между группой, связывающейся с гранулой, и мишень-специфической последовательностью зонда, где олигонуклеотидный спейсер представляет собой спейсер с повторами TTG или поли-А спейсер.

В одном из аспектов спейсер (либо углеродный+олигонуклеотидный спейсер, либо только олигонуклеотидный спейсер) находится на 3′-конце мишень-специфической последовательности зонда. В другом аспекте спейсер находится на 5′-конце мишень-специфической последовательности зонда.

В одном из аспектов олигонуклеотидный спейсер выбран так, что он не гибридизуется с последовательностью-мишенью или фланкирующим участком данной последовательности-мишени. В одном из аспектов олигонуклеотидный спейсер выбран так, что он не гибридизуется с последовательностью-мишенью или с фланкирующим участком данной последовательности-мишени при использовании в описанном в данной заявке способе.

В одном из аспектов олигонуклеотидный спейсер выбран так, что область спейсера, которая фланкирует мишень-специфический зонд, не гибридизуется с последовательностью-мишенью или с фланкирующим участком данной последовательности-мишени. Это проиллюстрировано на Фиг.1в.

В другом аспекте изобретение относится к набору зондов, содержащему по меньшей мере 2 зонда, соответственно включающему любой зонд или любые зонды по настоящему изобретению, где по меньшей мере один зонд связан с гранулой или спейсером через 5′-конец зонда и где по меньшей мере один зонд связан с гранулой или спейсером через 3′-конец зонда.

Спейсерные последовательности

Изобретение также относится к спейсерным последовательностям, подходящим для применения с жидкостными системами детекции на основе гранул. Спейсеры согласно изобретению могут представлять собой любые спейсеры, описанные в данной заявке. Спейсеры могут содержать, например, полиуглеродный повтор (например, С₁₂-С₃₀) и олигонуклеотидный повтор (например, поли-Т, или поли-(TTG), или поли-А длиной 15-150 или 20-150 нуклеотидов), связанные вместе и подходящие для присоединения к мишень-специфической последовательности зонда, или состоять из них.

Спейсеры по изобретению также могут содержать олигонуклеотидный повтор общей длиной 15-150, или 20-150, или 25-150 нуклеотидов или состоять из них.

Спейсеры соответственно содержат связывающую группу, такую как первичная аминогруппа, подходящая для присоединения к грануле.

Настоящее изобретение также относится к спейсерной молекуле по изобретению, связанной с гранулой.

Изобретение также относится к спейсерной молекуле по изобретению, связанной с мишень-специфической последовательностью зонда и, возможно, также связанной с гранулой.

Наборы

Изобретение также относится к набору, содержащему спейсерную молекулу по изобретению и подложку в виде частиц, такую как гранула.

Изобретение также относится к набору, содержащему спейсерную молекулу по изобретению и инструкции по связыванию с подложкой в виде частиц, такой как гранула.

Изобретение также относится к набору, содержащему спейсерную молекулу по изобретению, связанную с подложкой в виде частиц, такой как гранула, с инструкциями по связыванию с мишень-специфической последовательностью зонда.

Изобретение также относится к набору, содержащему зонд по настоящему изобретению, связанный с подложкой в виде частиц, такой как гранула, и инструкции по применению в детекции мишени.

Способ

Настоящее изобретение также относится к некоторым улучшениям способа, внесенным в существующие протоколы для детекции взаимодействий зонд - мишень на уровне нуклеиновой кислоты при использовании технологии на основе гранул.

Технологии на основе гранул, такие как технология Luminex, хорошо описаны в данной области и литературе. Гранулы, также обозначаемые как микросферы, соответственно представляют собой полистирольные гранулы, как описано в Dunbar et al и в ссылках там, которые все, таким образом, включены в данное описание посредством ссылки.

Общий способ по изобретению представляет собой стандартную схему детекции любого взаимодействия между зондом, соответственно таким зондом, как определено в данном описании, и целевой нуклеиновой кислотой. Этот способ соответственно содержит следующие стадии:

1) денатурация любой полинуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в образце;

2) гибридизация мишени с зондом в условиях, которые позволяют осуществиться специфической гибридизации между зондом и мишенью;

3) возможно жесткая промывка для удаления по существу всех несвязанных веществ;

4) добавление репортерной молекулы и инкубация с ней, чтобы сделать возможным детекцию связывания зонда с мишенью;

5) возможно промывка; и

6) детекция связывания зонда с мишенью.

Подробный пример такого протокола дан в содержащихся в данном описании примерах.

Общие стадии являются соответственно последовательными, но в одном из аспектов некоторые стадии можно осуществлять вместе, например зонд подвергают взаимодействию одновременно с мишенью и репортерной молекулой.

Специфическая гибридизация зонда с целевой нуклеиновой кислотой обычно означает, что указанный зонд формирует дуплекс с частью этой целевой области или со всей целевой областью в используемых экспериментальных условиях, и что в тех же условиях указанный зонд не образует дуплекс с другими областями полинуклеиновых кислот, присутствующих в анализируемом образце.

Жесткие условия промывки хорошо известны в данной области и включают, например, 3×SSC, 0,1% саркозила при 50°С и те условия, которые описаны в данной заявке в примерах.

Промывку на стадии (5) осуществляют в любых подходящих условиях, хорошо известных в данной области, что позволяет удалять избыток репортерной молекулы, например. В одном из аспектов изобретения промывку осуществляют в присутствии пониженной концентрации SSC по сравнению с концентрацией, используемой на стадии промывки, такой как по существу 2×SSC, 1,5×SSC или по существу 1×SSC.

Детекцию можно проводить любым подходящим способом, где в одном из аспектов данного изобретения для детекции взаимодействия мишени с зондом используют проточный цитометрический анализ на основе флуоресцентных свойств гранул, таких как система гранул Luminex, описанная в Dunbar (см. выше). В частности, в этой статье указано, например, что система Luminex хМАР включает 5,6 мкм полистирольные микросферы, которые окрашены внутри двумя спектрально различными флуорохромами. При использовании точных количеств каждого из этих флуорохромов создают матрицу, состоящую из разных наборов микросфер со специфическими спектральными адресами. Каждый набор микросфер может обладать отличающимся реагентом на своей поверхности. Поскольку наборы микросфер могут различаться их спектральными адресами, их можно объединять, что делает возможным, например, измерение 100 или более разных аналитов одновременно в одном реакционном сосуде. Третий флуорохром, связанный с репортерной молекулой, дает количественную оценку биомолекулярного взаимодействия, которое произошло на поверхности микросферы. Микросферы исследуют индивидуально в потоке быстро текущей жидкости при их прохождении мимо двух отдельных лазеров в анализаторе Luminex^® 100™. Диодный красный лазер, работающий при 635 нм и 10 мВт, возбуждает два флуорохрома, содержащихся в микросферах; лазер на алюмоиттриевом гранате (YAG), работающий при 532 нм, 13 мВт, возбуждает репортерный флуорохром (R-фикоэритрин, Alexa 532 или Су3), связанный с поверхностью микросфер. Высокоскоростная обработка цифрового сигнала классифицирует микросферу на основании ее спектрального адреса и количественно характеризует реакцию на поверхности. Тысячи микросфер исследуют в секунду, что дает систему анализа, способную анализировать и регистрировать, например, 100 или более различных реакций в одном реакционном сосуде всего за несколько секунд на образец.

В одном из аспектов данного изобретения гранулы могут представлять собой парамагнитные гранулы. В одном из аспектов гранулы можно смешивать с мишенью и/или репортером с использованием механического перемешивания, основанного на магнитных свойствах гранул.

В одном из аспектов способ по изобретению включает поддержание температуры гибридизации после стадии гибридизации между зондом и мишенью после стадии (2). В одном из аспектов имеет место поддержание температуры гибридизации до по меньшей мере жесткой промывки на стадии (3). В одном из аспектов способ по изобретению включает поддержание температуры гибридизации во время инкубации с репортерной молекулой на стадии (4).

Как таковое, настоящее изобретение относится к процессу, описанному выше, детекции любого взаимодействия между зондом и целевой нуклеиновой кислотой, где температуру реакции гибридизации между мишенью и зондом поддерживают до тех пор, пока реакция с репортерной молекулой по существу не завершится.

В одном из аспектов способ по изобретению также включает применение стадии разведения-промывки сразу после стадии гибридизации (2). Такая стадия увеличивает объем реакции между мишенью и зондом и, по-видимому, снижает возможность неспецифической гибридизации. Разведение можно осуществлять с помощью буфера для промывки, используемого для удаления любых несвязавшихся веществ на стадии (2) этого способа.

В одном из аспектов способ по изобретению включает встряхивание или перемешивание при нагревании, например, с использованием термомиксера на стадии (2). Термомиксер обычно представляет собой любое устройство, которое обеспечивает перемешивание образца при заданной температуре. В данном описании перемешивание соответственно происходит при температуре гибридизации, обычно 50°С или выше, такой как 50-55°С, такой как 50°С, 52°С, 54°С и 55°С.

В одном из аспектов способ по изобретению включает промывку конечного комплекса зонд-мишень в 1×SSC перед детекцией сигнала после стадии (6). Такая промывка может быть осуществлена при комнатной температуре.

В одном из аспектов способ по изобретению включает встряхивание конечного комплекса зонд-мишень перед детекцией сигнала после стадии (6).

В другом аспекте этот способ включает дополнительную стадию связывания гранулы с зондом перед стадией (1). Таким образом, реакция между мишенью и зондом происходит в контексте твердой подложки.

В другом аспекте изобретение относится к способу, описанному выше, при котором зонд связан с гранулой, соответственно полистирольной гранулой, имеющей флуорохром.

В другом аспекте изобретение относится к способу, описанному выше, при котором по меньшей мере 2 зонда используют одновременно для детекции разных мишеней. Такие реакции обычно обозначают как мультиплексные реакции. В одном из аспектов зонды по настоящему изобретению, имеющие разные специфичности к мишеням, присоединены к гранулам, где каждая гранула является специфической для каждого типа конкретного зонда.

В другом аспекте изобретение относится к мультиплексной реакции, содержащей по меньшей мере 2 типа специфических зондов, где эти зонды присоединены к гранулам, которые соответственно мечены различными флуорохромами, и где длина зонда у разных зондов в мультиплексной реакции являются не одинаковой. Например, если определенный полинуклеотидный фрагмент (например, ДНК) будет подвергаться одновременному зондированию с использованием множественных специфических зондов разного типа, то в одном из аспектов настоящее изобретение не требует того, чтобы все зонды имели равную длину, и в одном из аспектов зонды различаются по длине.

В другом аспекте гибридизацию между зондом и мишенью осуществляют в присутствии цитрата натрия (SSC) или эквивалента, такого как 2-4×SSC или 3×SSC, соответственно для обеспечения ионной среды для того, чтобы происходили взаимодействия между зондом и мишенью.

Настоящее изобретение проиллюстрировано со ссылкой на следующие примеры, которые не ограничивают данное изобретение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Стандартная процедура гибридизации (по стадиям) в соответствии с Wallace и др. (2005), см. выше, представляет собой нижеследующее:

1. Выбирают соответствующий набор микросфер, связанных с олигонуклеотидами.

2. Ресуспендируют микросферы с помощью встряхивателя и обработки ультразвуком в течение приблизительно 20 секунд.

3. Приготавливают рабочую смесь микросфер путем разведения исходных препаратов связанных микросфер до 150 микросфер на каждый набор в 1 мкл гибридизационного буфера 1,5×ТМАС (1×ТМАС=2 моль/л ТМАС / 0,15% саркозила / 75 ммоль/л Трис, 6 ммоль/л ЭДТА) (Примечание: для каждой реакции требуется 33 мкл рабочей смеси микросфер).

4. Перемешивают рабочую смесь микросфер с помощью встряхивателя и обработки ультразвуком в течение приблизительно 20 секунд.

5. В каждый образец или фоновую лунку добавляют по 33 мкл рабочей смеси микросфер.

6. В каждую фоновую лунку добавляют по 17 мкл dH₂O.

7. В каждую лунку с образцом добавляют амплифицированную биотинилированную ДНК и dH₂O до суммарного объема 17 мкл (Примечание: для детекции используют 7 мкл реакционной среды для ПЦР).

8. Среду в лунках осторожно перемешивают посредством пипетирования вверх-вниз несколько раз.

9. Инкубируют при 99°С в течение 5 минут для денатурации амплифицированной биотинилированной ДНК в термоциклере.

10. Инкубируют реакционный планшет при температуре гибридизации (55°С) в течение 15 минут.

11. Во время инкубации приготавливают фильтр-планшет путем промывания два раза ледяным 1×ТМАС. Затем каждую лунку фильтр-планшета заполняют ледяным 1×ТМАС.

12. Во время инкубации приготавливают свежую репортерную смесь путем разведения стрептавидин-R-фикоэритрина до 2 мкг/мл в 1× гибридизационном буфере ТМАС (Примечание: для каждой реакции требуется 75 мкл репортерной смеси) и помещают ее в термостат или водяную баню при температуре гибридизации.

13. Прекращают реакцию гибридизации путем переноса всей реакционной среды на фильтр-планшет, содержащий ледяной буфер для промывки.

14. После переноса фильтр-планшет два раза хорошо промывают ледяным 1×ТМАС буфером для промывки, чередуя с вакуумной фильтрацией.

15. Добавляют 75 мкл репортерной смеси в каждую лунку и перемешивают осторожно посредством пипетирования вверх-вниз несколько раз.

16. Планшет оставляют стоять в течение приблизительно 30 минут для достижения комнатной температуры.

17. Реакционный планшет инкубируют при температуре гибридизации в течение 30 минут.

18. Инкубацию прекращают посредством вакуумной фильтрации.

19. Промывают дважды 1×ТМАС буфером для промывки, чередуя с вакуумной фильтрацией.

20. Разбавляют реакционную среду 1×ТМАС буфером для промывки, чередуя с вакуумной фильтрацией.

21. Анализируют при комнатной температуре на анализаторе Luminex™100 в соответствии с руководством к системе.

[См. Фиг.2. Общая схема последовательности рабочих операций, как описано Wallace и др. (2005)]

Чувствительность и специфичность теста основаны на специфической гибридизации между последовательностями нуклеиновых кислот зонда и мишени. Поэтому гибридизация и промывка, а также инкубация с РЕ, по-видимому, являются критическими стадиями в процедуре. Протокол адаптировали для максимизации специфичности и чувствительности реакции путем оптимизации различных параметров, таких как температуры и кинетика диффузии. Эти адаптации указаны в оптимизированном протоколе гибридизации (см. ниже).

Материалы:

А. Буферы

0,1 MES pH 4,5 (буфер для связывания)
Реагент	Номер по каталогу	Конечная концентрация	Количество/ 250 мл
MES (2-[N -Морфолино]этансульфоновая кислота)	Sigma М-2933	0,1 М	4,88 г
dH2O	-	-	вплоть до 250 мл
5 н. NaOH	Fisher SS256-500	-	~5 капель
Фильтр (45 мкм) стерилизу