Способ диагностики стадии атопического дерматита у детей

Способ диагностики стадии атопического дерматита у детей

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии. Оно может быть использовано в клинике для диагностики стадии атопического дерматита у детей.

Известен способ диагностики атопического дерматита по клиническим признакам, согласно которому атопический дерматит дифференцируют от хронической экземы, себорейного дерматита, контактного простого дерматита и других заболеваний.

Атопический дерматит - это хроническое аллергическое заболевание кожи, которое, как правило, развивается у лиц с генетической предрасположенностью к атопии, имеет рецидивирующее течение с возрастными особенностями клинических проявлений и характеризуется экссудативными и/или лихеноидными высыпаниями, повышением уровня IgE и гиперчувствительностью к специфическим и неспецифическим аллергенам (Шабалов Н.П. «Детские болезни» 6-е издание, т.1, с.528).

Патологический кожный процесс может быть нескольких видов. Острый процесс характеризуется эритематозно-папуллезными или эритематозно-везикулезными высыпаниями на фоне эритемы, множественными экскориациями и эрозиями с серозным экссудатом, а хронический - утолщением кожи (лихенификацией) в очагах поражения и фиброзными папулами. Причем нередко у пациентов с хроническим процессом можно наблюдать одновременно все три вида кожных реакций (Н.Г.Гамаюнов, Б.Н.Короткий, А.А.Тихомиров «Современные аспекты патогенеза и лечения атопического дерматита у детей» 2008 г.). Поэтому иногда сложно определить переход острой стадии процесса в хроническую.

Для постановки диагноза в Российской программе по атопическому дерматиту у детей рекомендовано ориентироваться на следующие признаки:

- начало заболевания в раннем детском возрасте;

- наличие аллергических заболеваний у родителей и/или родственников пробанда;

- зуд кожных покровов различной интенсивности;

- типичная морфология кожных высыпаний в виде стойкой гиперемии или переходящей эритемы, папуло-везикулезных высыпаний на эритематозном фоне с экссудацией или инфильтрацией, сухость кожи, шелушения, лихенификации;

- типичная локализация поражения кожных покровов;

- хроническое рецидивирующее течение;

- высокий уровень IgE и аллергенспецифических IgE-антител в сыворотке крови.

Необходимо установить связь клинических проявлений с определенным сезоном года, местом пребывания ребенка. Атопию устанавливают на основании симптомов заболевания и положительных кожных проб или повышенного уровня специфических антител (аллергенспецифических IgE). Эти показатели позволяют с большей достоверностью установить наличие атопического дерматита (Ревякина В.А. «Атопический дерматит у детей», Педиатрия №1 2008, с.28-32; «Атопический дерматит у детей: диагностика, лечение и профилактика»; Научно-практическая программа).

Сложность состоит в отличии острой стадии процесса от хронической, т.к. и в хронической стадии патологический кожный процесс может быть представлен теми же высыпаниями, что и в острой стадии.

Задача данного изобретения состоит в повышении точности и ускорении диагностики перехода острой стадии атопического дерматита у детей в хроническую для своевременного прогнозирования течения заболевания и его лечения.

Сущность предложенного способа диагностики состоит в том, что у детей в периферической крови определяют уровень маркеров CD95⁺ лимфоцитов и при CD95⁺ выше 60,09% диагностируют острую стадию заболевания, а при CD95⁺ от 20,33% до 60,09% - хроническую. Уровень экспрессии молекул CD95⁺ лимфоцитами периферической крови можно считать высоко чувствительным маркером при переходе острой стадии атопического дерматита в хроническую и использовать с целью прогнозирования течения атопического дерматита у детей и вероятности перехода его в хроническую форму.

Способ осуществляется следующим образом: из пробы (4-5 мл) гепаринизированной крови, взятой натощак у больных атопическим дерматитом и у детей контрольной группы, выделяют лимфоциты на градиенте фиколл-верографина, затем 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD95) и инкубируют 30-45 мин при +4°С. Затем добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. После удаления супернатанта вносят 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендируют, добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab~)₂ - фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100 (для разведения использовали раствор Хенкса, содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия). Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4°С, затем клетки 2 раза отмывают, как указано выше. Окрашенные клетки анализируют с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки суспендируют, переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и препарат просматривают под иммерсией с увеличением (×3; объектив ×90). Количество антигенпозитивных клеток определяют как % флюоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, но без обработки моноклональными антителами. Определяют уровень маркеров CD95⁺ лимфоцитов и при CD95⁺ выше 60,09% диагностируют острую стадию заболевания, а при CD95⁺ от 20,33% до 60,09% - хроническую.

ПРИМЕР №1.

Девочка А., 5 лет. Кожные покровы сухие. На щеках, сгибательных поверхностях верхних и нижних конечностей, за ушами - гиперемия, шелушение, эритематозно-везикулезные высыпания, множественные экскориации и эрозии с серозным экссудатом. Беспокоит зуд кожных покровов. В легких везикулярное дыхание. ЧДД 24 в 1 мин. Тоны сердца удовлетворительной звучности. Пульс 120 в 1 мин, АД 100/60 мм рт.ст. Живот мягкий, безболезненный. Стул и диурез в норме.

Из анамнеза: мать страдает холодовой аллергией в виде крапивницы, отец пищевой аллергией в виде сыпи на клубнику, шоколад, киви. У самой А. аллергия проявлялась с раннего возраста (на первом месяце жизни) при погрешностях в диете матери при кормлении грудью. В общем анализе крови количество эозинофилов - 17. Общий анализ мочи, биохимия крови в пределах нормы. Копроскопия - детрит. Соскоб на яйца глистов - отрицательный. Уровень IgE в сыворотке крови 260 МЕ/л (в норме до 60 МЕ/л). Проведенные выше исследования не позволяют определить стадию заболевания. При определении уровня экспрессии маркеров CD95⁺ лимфоцитами периферической крови 66,09%, т.е. выше 60,09%, следовательно, процесс находится в острой стадии.

Диагноз: атопический дерматит, период обострения, младенческая форма, распространенный, среднетяжелое течение.

ПРИМЕР №2.

Мальчик М., 7 лет. Жалобы на высыпания на коже, зуд кожных покровов. Из анамнеза известно, что проявления атопического дерматита отмечались с рождения. Обострения кожного процесса 3-4 раза в год. Отмечалась четкая связь между приемом в пищу сладкого, цитрусовых и обострением кожного процесса. Последнее ухудшение в течение 3 месяцев. Периодически принимает антигистаминные средства, со слов - чаще тавегил, эффекта нет. Объективно: кожные покровы сухие. На коже задней и внутренней поверхности бедер, на сгибательных поверхностях конечностей лихенификация, экскориации, эритема, сухость кожных покровов. ЧДД 22 в 1 мин. Тоны сердца удовлетворительной звучности. Пульс 92 в 1 мин, АД 110/60 мм рт.ст. Общий анализ мочи, биохимия крови в пределах нормы. Копроскопия - детрит. Соскоб на яйца глистов - отр. Уровень IgE в сыворотке крови 230 МЕ/л (в норме до 60 МЕ/л). Уровень экспрессии маркеров CD95⁺ лимфоцитами периферической крови 30,22%, т.е. в пределах от 20,33% до 60,09%, следовательно, процесс находится в хронической стадии.

Диагноз: атопический дерматит, хроническое течение, детская форма, распространенный, среднетяжелое течение.

У здоровых детей маркеры CD95⁺ экспрессируют не более 20,33% лимфоцитов периферической крови. Данные показывают, что уровень маркеров CD95⁺ лимфоцитов периферической крови может служить дополнительным критерием в дифференцировке стадии течения атопического дерматита у детей, кроме клинического обследования, данных анамнеза, положительных кожных проб или повышенного уровня специфических антител (аллергенспецифических IgE).

Способ диагностики стадии атопического дерматита у детей по уровню экспрессии маркеров CD95⁺ лимфоцитами периферической крови был апробирован на 40 детях с диагнозом атопический дерматит, из них 31 - с острым процессом, 9 - с хроническим. Всем обследованным производился забор крови и определение уровня экспрессии маркеров CD95⁺лимфоцитами периферической крови перечисленным выше способом.

Результаты проведенного исследования представлены в таблице. Для обработки полученного материала и проведения статистического анализа в исследованных группах была использована программа статистической обработки информации «STATGRAPHICS PLUS». Вычисляли среднюю и ошибку средней (M±m). Сравнение в исследованных группах проводили попарно при помощи параметрических методов, так как изучаемые выборки могли быть аппроксимированы нормальным законом распределения. Сравнение осуществляли с помощью критериев Стьюдента (t) (сравнение средних) и Фишера (сравнение средних квадратических отклонений). Уровень достоверности оценивали значением p. Различия при сравнении считали достоверными с вероятностью более 95% при P<0,05.

CD95⁺ (FasR) относится к рецепторным белкам семейства факторов некроза опухолей - ФНО. Основная функция системы Fas-рецептор-Fas-лиганд (FasL) - индукция апоптоза в клетках. При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков, в результате чего активируется апоптозоспецифическая протеаза (каспаза-8) и развиваются характерные для апоптоза процессы. Нарушение иммунологического надзора и нарушение регуляции механизмов апоптоза может являться одним из патогенетических механизмов развития ряда заболеваний. Чрезмерная активация иммунокомпетентных клеток при иммунодефицитных состояниях заканчивается гибелью клеток (негативная активация, апоптоз).

Полученные данные показали, что в острой стадии атопического дерматита (клинически проявляющейся преимущественно серозной экссудацией, экземой) уровень маркеров CD95⁺ лимфоцитов периферической крови достоверно увеличивался по сравнению с уровнем у детей с хронической стадией (клинически проявляющейся преимущественно лихенификацией). Следовательно, уровень экспрессии молекул CD95⁺ лимфоцитами периферической крови можно считать высоко чувствительным маркером при переходе острой стадии атопического дерматита в хроническую и использовать с целью прогнозирования течения атопического дерматита у детей и вероятности перехода его в хроническую форму.

Использование предложенного способа диагностики имеет следующие преимущества:

1) высокую информативность для дифференциальной диагностики двух стадий процесса;

2) является информативным методом определения количественного маркера нарушений механизмов апоптоза при атопическом дерматите в динамике (CD95⁺);

3) быструю диагностику;

4) обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.

Способ диагностики стадии атопического дерматита у детей
	CD95 (%)
	M±m (min, max)
Хроническая стадия	30,22±0,55*
(n=9)	(21,31-29,59)
Острая стадия	60,09±0,62*
(n=31)	(11,44-16,96)
Здоровые	20,33±0,19*
(n=30)	(7,36-8,64)
Примечание: * - p<0,05 - достоверность различия в группах при сравнении.

Способ диагностики стадии атопического дерматита у детей, включающий иммунологическое исследование периферической крови, отличающийся тем, что определяют степень экспрессии лимфоцитами маркеров CD95⁺ и при CD95⁺ выше 60,09% диагностируют острую стадию заболевания, а при CD95⁺ от 20,33% до 60,09% - хроническую.