Способы получения функционального белка из днк, имеющей нонсенс-мутацию, и лечения нарушений, ассоциированных с ней

Способы получения функционального белка из днк, имеющей нонсенс-мутацию, и лечения нарушений, ассоциированных с ней

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По данной заявке испрашивается приоритет по условной заявке США с серийным No. 60/787333, поданной 30 марта 2006 года, и условной заявке США с серийным No. 60/813085, поданной 12 июня 2006 года, описания которых включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.

1. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к функциональным белкам, кодируемым последовательностями нуклеиновых кислот, содержащими нонсенс-мутацию. Также настоящее изобретение относится к способам получения функциональных белков, кодируемых последовательностями нуклеиновых кислот, содержащими нонсенс-мутацию, и к применению таких белков для профилактики, управления течением и/или лечения заболеваний, обусловленных нонсенс-мутацией(ями) в гене.

2. ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Экспрессия генов в клетках зависит от последовательных процессов транскрипции и трансляции. Совместно, эти процессы обеспечивают продукцию белка из нуклеотидной последовательности соответствующего ему гена.

Транскрипция вовлекает синтез РНК из ДНК РНК-полимеразой. Транскрипция начинается в промоторной области гена и продолжается до индукции терминации, например, посредством образования структуры стебель - петля в образующейся РНК или связывания продукта гена rho.

Затем с мРНК продуцируется белок посредством процесса трансляции, происходящей на рибосоме, с помощью тРНК, тРНК-синтетаз и различных других видов белков и РНК. Трансляция включает три фазы: инициации, элонгации и терминации. Трансляция инициируется образованием инициирующего комплекса, состоящего из белковых факторов, мРНК, тРНК, кофакторов и субъединиц рибосом, которые распознают сигналы на мРНК, которые направляют трансляционный аппарат на начало трансляции мРНК.

После образования инициирующего комплекса происходит рост полипептидной цепи посредством многократного добавления аминокислот вследствие активности пептидилтрансферазы рибосомы, а также тРНК и тРНК-синтетаз. Наличие одного из трех кодонов терминации (UAA, UAG, UGA) в A-участке рибосомы дает сигнал факторам высвобождения (RF) полипептидной цепи к связыванию и распознаванию сигнала терминации. После этого происходит гидролиз сложноэфирной связи между 3'-нуклеотидом тРНК, расположенной в P-участке рибосомы и образующейся полипептидной цепью. Завершенная полипептидная цепь высвобождается, и субъединицы рибосом повторно используются для другого раунда трансляции.

Мутации последовательности ДНК, при которых происходит изменение количества оснований, относят к инсерционным или делеционным мутациям (мутациям со сдвигом рамки считывания), и они могут приводить к значительным нарушениям в геноме. Мутации ДНК, которые заменяют одно основание на другое, называют миссенс-мутациями, и их подразделяют на классы транзиций (одного пурина на другой пурин или одного пиримидина на другой пиримидин) и трансверсий (пурина на пиримидин или пиримидина на пурин).

Мутации в виде инсерций, делеций, транзиций и трансверсий могут приводить к нонсенс-мутации, или мутации с терминацией цепи, в которой мутация основания со сдвигом рамки считывания или в пределах рамки считывания приводит к замене кодона аминокислоты на один из трех стоп-кодонов. Три преждевременных стоп-кодона могут приводить к аберрантным белкам в клетках в результате преждевременной терминации трансляции. Нонсенс-мутация в гене может приводить к ряду заболеваний, таких как злокачественные опухоли, лизосомальные нарушения накопления, мышечные дистрофии, кистозный фиброз и гемофилия, чтобы назвать немногие из них.

В бактериальных и эукариотических штаммах с нонсенс-мутациями может возникать супрессия нонсенс-мутации в результате мутации в одной из молекул тРНК, так что мутантная тРНК может распознавать нонсенс-кодон, в результате мутаций в белках, которые вовлечены в процесс трансляции, в результате мутаций в рибосоме (либо в рибосомальной РНК, либо в рибосомальных белках), или посредством добавления соединений, которые изменяют процесс трансляции. Результатом этого является то, что в полипептидную цепь включается аминокислота в участке нонсенс-мутации, и трансляция не терминируется преждевременно в нонсенс-кодоне. Встроенная аминокислота не обязательно будет идентична исходной аминокислоте белка дикого типа; однако множество аминокислотных замен не оказывают значительного эффекта на структуру или функцию белка. Таким образом, белок, продуцированный посредством супрессии нонсенс-мутации, вероятно, будет обладать активностью, сходной с белком дикого типа. Этот сценарий обеспечивает возможность лечения заболеваний, обусловленных нонсенс-мутациями, посредством избежания преждевременной терминации трансляции через супрессию нонсенс-мутации.

Остается необходимость в данной области в способах лечения, управления течением и/или профилактики заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией(ями) в гене(ах) у субъекта-человека посредством введения соединения, которое осуществляет супрессию преждевременной терминации трансляции у человека (людей), опосредуя ошибочное считывание нонсенс-кодона и продуцируя белок (белки) не дикого типа in vivo в количестве, достаточном для лечения, управления течением и/или профилактики заболевания.

3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, частично, на открытии средств для супрессии нонсенс-кодонов, которые можно системно вводить субъекту (включая человека) для супрессии нонсенс-кодона в РНК, транскрибируемой с гена(ов), содержащего нонсенс-мутацию(и), обеспечивая прохождение считывания через нонсенс-кодон и встраивание аминокислоты в участке нонсенс-кодона. В определенных вариантах осуществления для продукции функционального белка с "прочитанным" терминатором встроенная аминокислота представляет собой аминокислоту, отличную от аминокислоты, которая встречается в соответствующей области в белке дикого типа. Функциональный белок с "прочитанным" терминатором, продуцированный посредством супрессии нонсенс-кодона в РНК, транскрибированной с гена(ов), содержащего нонсенс-мутацию, является пригодным для лечения, профилактики и/или управления течением заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией(ями) в гене(ах).

Продукция функционального белка с "прочитанным" терминатором у субъекта (включая человека) посредством супрессии нонсенс-кодона в РНК, транскрибированной с гена(ов), содержащего нонсенс-мутацию, с использованием средства для супрессии нонсенс-кодона, обладает некоторыми преимуществами относительно других способов терапии, предусмотренных для профилактики, лечения и/или управления течением заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией в гене(ах). Например, продукция функционального белка с "прочитанным" терминатором с использованием средства для супрессии нонсенс-кодона не вовлекает введение чужеродного генетического материала субъекту, как в случае генной терапии. Таким образом, устраняется риск встраивания чужеродного генетического материала в неправильную область хромосомной ДНК, риск сверхэкспрессии белка, кодируемого чужеродным генетическим материалом, введенным субъекту, и риск передачи вектора, такого как вирус, используемый для введения чужеродного материала субъекту, другим субъектам.

Настоящее изобретение относится к способам продукции у субъекта (предпочтительно, человека), нуждающегося в этом, эффективного количества функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей нонсенс-мутацию, при этом способы включают ведение субъекту эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона. В частности, настоящее изобретение относится к способам лечения, управления течением и/или профилактики заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией в гене(ах), при этом способы включают введение субъекту (предпочтительно, человеку), нуждающемуся в этом, эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, где эффективное количество средства (средств) представляет собой количество, достаточное для продукции эффективного количества функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого геном, содержащим нонсенс-мутацию. Неограничивающие примеры заболеваний, обусловленных нонсенс-мутацией в гене(ах), которые можно подвергать лечению, управлению течением и/или профилактике, в соответствии со способами по этому изобретению, включают: амилоидоз, LINCL, гемофилию, болезнь Альцгеймера, атеросклероз, гигантизм, карликовость, гипотиреоз, гипертироидизм, кистозный фиброз, старение, ожирение, болезнь Паркинсона, болезнь Неймана-Пика, семейную гиперхолестеринемию, пигментный ретинит, мышечную дистрофию (например, мышечную дистрофию Дюшенна), спинальную мышечную атрофию и синдром Марфана.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к средству для супрессии для нонсенс-кодона, которое можно перорально вводить субъекту (предпочтительно, человеку) для профилактики, лечения и/или управления течением заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией в гене. Средства для супрессии нонсенс-кодонов, вводимые перорально, не оказывают никаких неблагоприятных побочных эффектов, или оказывают незначительные (при их наличии) неблагоприятные побочные эффекты в дозировке(ах), которая приводит к эффективному количеству функционального белка с "прочитанным" терминатором. В конкретном варианте осуществления средства для супрессии нонсенс-кодонов не приводят к почечной недостаточности и/или потере слуха при пероральном введении субъекту (предпочтительно, человеку) в дозировке(ах), которая приводит к эффективному количеству функционального белка с "прочитанным" терминатором. Таким образом, средства для супрессии нонсенс-кодонов можно длительно вводить системно (например, перорально) без токсичности, такой как почечная недостаточность и потеря слуха.

Пероральное введение средства для супрессии нонсенс-кодона позволяет субъекту принимать назначенную ему/ей дозировку средства для супрессии нонсенс-кодонов без необходимости в медицинских специалистах для введения средства. Это снижает медицинские затраты, обусловленные профилактикой, лечением и/или управлением течением заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией в гене(ах), вследствие устранения затрат на введение средства медицинским специалистом. Пероральное введение средства для супрессии нонсенс-кодона также повышает качество жизни субъекта, поскольку субъект не ограничен и/или не обременен посещением медицинских специалистов для введения его/ее дозировки средства для супрессии нонсенс-кодона. Кроме того, пероральное введение средства для супрессии нонсенс-кодона позволяет доставку системного лекарственного средства во все пораженные заболеванием области органа.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к средствам для супрессии нонсенс-кодонов, которые не проявляют значительную антибактериальную активность против грамотрицательного микроорганизма и/или грамположительного микроорганизма. В противоположность средствам для супрессии нонсенс-кодонов с антибактериальной активностью применение средств для супрессии нонсенс-кодонов, которые не проявляют значительную антибактериальную активность против грамотрицательного микроорганизма и/или грамположительного микроорганизма, не приводит к бактериальной устойчивости к лекарственным средствам с антибиотической активностью. Кроме того, применение средств для супрессии нонсенс-кодонов, которые не проявляют значительной антибактериальной активности против грамотрицательного микроорганизма и/или грамположительного организма, вероятно, не будет индуцировать осложнения, связанные с патологическим ростом нормальной микробной флоры, который может произойти в случае многих длительно вводимых антибиотиков.

Таким образом, настоящее изобретение относится к функциональным белкам с "прочитанным" терминатором, кодируемым последовательностями нуклеиновых кислот, содержащими нонсенс-мутацию, которую получают способами, включающими введение средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, которое является хорошо переносимым у субъектов и не обладает значительной антибактериальной активностью против грамотрицательного микроорганизма и/или грамположительного микроорганизма.

4. ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

ФИГ 1. Схема мРНК, образованной из люциферазных репортерных конструкций.

ФИГ. 2(A-E). мРНК, образованная из репортера люцифераза-CD40 в конструкциях мРНК.

ФИГ 3. Схема мРНК β-тубулина мыши.

5. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, частично, на открытии средств для супрессии нонсенс-кодонов, которые можно системно вводить субъекту (включая человека) для супрессии нонсенс-мутации в РНК, транскрибируемой с гена(ов), содержащего нонсенс-мутацию(и), обеспечивающих прохождение считывания через нонсенс-мутацию и встраивание аминокислоты в область нонсенс-кодона. В определенных вариантах осуществления для продукции функционального белка не дикого типа, встраиваемая аминокислота является аминокислотой, отличной от аминокислотного остатка, который встречается в соответствующей области белка дикого типа. Функциональный белок с "прочитанным" терминатором, полученный посредством супрессии нонсенс-кодона в РНК, транскрибируемой с гена(ов), содержащего нонсенс-мутацию, пригоден для лечения, профилактики и/или управления течением заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией(ями) в гене(ах).

Настоящее изобретение относится к способам продукции у субъекта (предпочтительно, человека), нуждающегося в этом, эффективного количества функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей нонсенс-мутацию, при этом способы включают ведение субъекту эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона. В соответствии с этим изобретением функциональный белок (белки) с "прочитанным" терминатором обладает одной или несколькими функциями полноразмерного белка(ов) дикого типа. В конкретных вариантах осуществления функциональный белок (белки) с "прочитанным" терминатором, продуцируемый способами по этому изобретению, представляет собой функциональный белок (белки) не дикого типа. В другом варианте осуществления функциональный белок не дикого типа является полноразмерным. В других вариантах осуществления функциональный белок (белки) не дикого типа является не полноразмерным. Продукцию функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором можно оценивать посредством анализа in vitro и/или в модели на животных. Например, для определения того, происходит ли продукция функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, можно использовать репортерный анализ. Альтернативно для определения того, происходит ли продукция функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, можно использовать модель на животных, таких как мышь mdx.

В определенных вариантах осуществления эффективное количество средства для супрессии нонсенс-кодона, вводимого субъекту, в соответствии с этим изобретением эквивалентно количеству, которое обеспечивает супрессию нонсенс-кодона в анализе с репортерным геном, включающем стадии: (a) контактирования средства с клеткой, обладающей последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей репортерный ген, где репортерный ген содержит преждевременный стоп-кодон; и (b) детекции экспрессии и/или активности функционального белка с "прочитанным" терминатором, кодируемого репортерным геном. В других вариантах осуществления эффективное количество средства для супрессии нонсенс-кодона эквивалентно количеству, которое обеспечивает супрессию нонсенс-кодона в анализе с репортерным геном, включающем стадии: (a) контактирования средства с клеточным лизатом и последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей репортерный ген, где репортерный ген содержит преждевременный стоп-кодон; и (b) детекции экспрессии и/или активности функционального белка с "прочитанным" терминатором, кодируемого репортерным геном. См. раздел 5,4 для более подробного описания этих анализов.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам продукции у субъекта (предпочтительно, человека), нуждающегося в этом, эффективного количества функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты (кислот), содержащей нонсенс-мутацию, при этом способы включают пероральное введение субъекту эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона. В определенных вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, вводимого перорально, составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, вводимого перорально, составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг, которые вводят в качестве одной дозы, двух доз, трех доз, четырех доз или более. В конкретном варианте осуществления эффективное количество средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, вводимого перорально, составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки, которые разделены на три дозы, при этом первая и вторая дозы составляют по 25% от общего вводимого количества и третья доза составляет 50% от общего вводимого количества. В других вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, вводимого перорально человеку, составляет менее 35 мг/кг в сутки. В конкретных вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, вводимого перорально человеку, составляет между 0,1 мг/кг и 30 мг/кг в сутки. В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам продукции у субъекта (предпочтительно, человека), нуждающегося в этом, эффективного количества функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого последовательностью(ями) нуклеиновой кислоты, содержащей нонсенс-мутацию, при этом способы включают ведение субъекту эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, где эффективное количество средства (средств) является достаточным для обеспечения концентрации в плазме от 0,5 мкг/мл до 500 мкг/мл средства (средств) в течение 2 часов, 2,5 часов, 3 часов или более. В определенных вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки. В конкретном варианте осуществления эффективное количество средства (средств) составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки, которые разделены на три дозы, при этом первая и вторая дозы составляют по 25% от общего вводимого количества и третья доза составляет 50% от общего вводимого количества. В некоторых вариантах осуществления средство(а) для супрессии нонсенс-кодона вводят субъекту перорально.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам продукции у субъекта (предпочтительно, человека), нуждающегося в этом, эффективного количества функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого последовательностью(ями) нуклеиновой кислоты, содержащей нонсенс-мутацию, при этом способы включают ведение субъекту эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, где средство(а) для супрессии нонсенс-кодона не проявляет значительную антибактериальную активность против грамотрицательного микроорганизма и/или грамположительного микроорганизма. В некоторых вариантах осуществления средство(а) для супрессии нонсенс-кодона вводят перорально. В определенных вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки. В конкретных вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки, которые разделены на три дозы, при этом первая и вторая дозы составляют по 25% от общего вводимого количества и третья доза составляет 50% от общего вводимого количества. В некоторых других вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) является достаточным для обеспечения концентрации в плазме от 0,1 мкг/мл до 500 мкг/мл средства (средств) в течение 2 часов, 2,5 часов, 3 часов или более.

Продукция функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей нонсенс-мутацию, посредством введения средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона субъекту, является пригодным для лечения, управления течением и/или профилактики заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией в гене(ах). Неограничивающие примеры заболеваний, которые можно подвергать лечению, управлению течением и/или профилактике посредством продукции функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого геном(ами), содержащем нонсенс-мутацию(и), включают: амилоидоз, LINCL, гемофилию, болезнь Альцгеймера, атеросклероз, гигантизм, карликовость, гипотиреоз, гипертиреоидизм, кистозный фиброз, старение, ожирение, болезнь Паркинсона, болезнь Неймана-Пика, семейную гиперхолестеринемию, пигментный ретинит, мышечную дистрофию (например, мышечную дистрофию Дюшенна), спинальную мышечную атрофию и синдром Марфана.

В определенных вариантах осуществления заболевание, подвергаемое лечению, управлению течением и/или профилактике посредством продукции функционального белка с "прочитанным" терминатором, кодируемого геном(ами), содержащим нонсенс-мутацию(и), представляет собой не желудочно-кишечное нарушение. В других вариантах осуществления заболевание, подвергаемое лечению, управлению течением и/или профилактике посредством продукции функционального белка с "прочитанным" терминатором, кодируемого геном(ами), содержащим нонсенс-мутацию(и), представляет собой не кожное нарушение. В некоторых вариантах осуществления заболевание, подвергаемое лечению, управлению течением и/или профилактике посредством продукции функционального белка с "прочитанным" терминатором, кодируемого геном(ами), содержащим нонсенс-мутацию(и), представляет собой не один или более или все из следующих заболеваний: синдром базально-клеточного невуса (например, ген PTCH), спорадическая базально-клеточная карцинома (например, ген PTCH), меланома (например, ген CDKN2a), пограничный буллезный эпидермолиз (например, гены LAMB3, LAMC2, LAMA3), генерализованный атрофический доброкачественный буллезный эпидермолиз (например, ген COL17A1), дистрофический буллезный эпидермолиз (например, ген COL7A1), болезнь Хейли-Хейли (например, ген ATP2C1), болезнь Дарье (например, ген ATP2A2), чешуйчатый ихтиоз (например, ген TGM1), X-сцепленный ихтиоз (например, ген STS), пигментная ксеродерма (например, гены XPA, XPC, XPG), синдром Блума (например, ген BLM), полосатая ладонно-подошвенная кератодерма (например, гены DSP, DSG1), Синдром Кокейна (например, ген ERCC6), окулокутанный альбинизм (например, гены TYR, TYRP1), синдром Германски-Пудлака (например, гены HPS1, HPS4), атаксия-телеангиэктазия (например, ген ATM), синдром Грисцелли (например, гены RAB27A, MY05A) и эктодермальная дисплазия/слабость кожи (например, ген PKP1). В некоторых вариантах осуществления заболевание, подвергаемое лечению, управлению течением и/или профилактике посредством продукции функционального белка с "прочитанным" терминатором кодируемого геном(ами), содержащим нонсенс-мутацию(и), представляет собой не один или более или все из следующих заболеваний: спорадические злокачественные опухоли пищевода (ген p53) и толстого кишечника (APC, гены p53), пищевод Барретта (ген p53), наследственные синдромы со злокачественными опухолями, такие как аденоматозный полипоз толстого кишечника (ген APC), наследственный неполипозный рак толстого кишечника (гены MLH1, MSH2), синдром Пейтца-Турена (ген STK 11) и синдром Коудена (ген PTEN).

Настоящее изобретение относится к способам лечения, управления течением и/или профилактики заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией в гене(ах), при этом способы включают введение субъекту (предпочтительно, человеку), нуждающемуся в этом, эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, где эффективное количество средства (средств) представляет собой количество, достаточное для продукции эффективного количества функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого геном, содержащим нонсенс-мутацию. В определенных вариантах осуществления эффективное количество функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором представляет собой количество белка(ов), необходимое для профилактики начала, развития и/или прогрессирования заболевания или его симптома. В других вариантах осуществления эффективное количество функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором представляет собой количество белка(ов), необходимое для снижения длительности и/или тяжести заболевания или его симптома. В определенных вариантах осуществления эффективное количество функционального белка с "прочитанным" терминатором эквивалентно количеству, продуцируемому в модели на животных для представляющего интерес заболевания. В других вариантах осуществления эффективное количество функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором представляет собой количество, которое продуцируется в модели заболевания на животных, обладающее терапевтической и/или профилактической пользой.

В определенных вариантах осуществления эффективное количество функционального белка с "прочитанным" терминатором эквивалентно количеству, продуцируемому в анализе с репортерным геном, включающем стадии: (a) контактирования средства для супрессии нонсенс-кодона с обладающей последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей репортерный ген, где репортерный ген содержит преждевременный стоп-кодон; и (b) определения продуцируемого количества функционального белка с "прочитанным" терминатором, кодируемого репортерным геном. В других вариантах осуществления эффективное количество функционального белка с "прочитанным" терминатором эквивалентно количеству, продуцируемому в анализе с репортерным геном, включающем стадии: (a) контактирования средства для супрессии нонсенс-кодона с клеточным лизатом и последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей репортерный ген, где репортерный ген содержит преждевременный стоп-кодон, и (b) определения продуцируемого количества функционального белка с "прочитанным" терминатором, кодируемого репортерным геном. Количество функционального белка с "прочитанным" терминатором можно определять измерением уровня экспрессии функционального белка с "прочитанным" терминатором с использованием, например, иммунологического анализа или посредством измерения активности функционального белка с "прочитанным" терминатором.

В определенных вариантах осуществления эффективное количество функционального белка с "прочитанным" терминатором представляет собой количество, продуцируемое клеткой, содержащей ген(ы), ассоциированный с заболеванием (т.е. ген(ы) содержит нонсенс-мутацию(и), ассоциированную с заболеванием). В некоторых вариантах осуществления количество, продуцируемое клеткой, составляет приблизительно 0,1%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5%, приблизительно 7% или приблизительно 10% (в других вариантах осуществления приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 75% или приблизительно 90% и в других вариантах осуществления 0,1-25%, 0,1-50%, 10-50%, 10-90%, 0,1-98%, 5-98% или 10-98%)

от количества, продуцируемого клеткой того же вида и типа, которая содержит нормальный ген(ы) (т.е. ген, который не содержит нонсенс-мутацию), кодирующий соответствующий белок (белки) дикого типа. Количество функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором и количество белка(ов) дикого типа можно определять с использованием любого анализа, известного специалисту в данной области, при условии, что способы, которые используют для измерения обоих белков, являются единообразными. В определенных вариантах осуществления количество функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором и количество белка(ов) дикого типа измеряют посредством иммунологического анализа (например, ELISA). В конкретном варианте осуществления создают клетку, чтобы она содержала ген(ы). В альтернативном варианте осуществления клетка естественным образом содержит ген(ы).

В определенных вариантах осуществления эффективное количество функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором представляет собой количество, продуцируемое клеткой от пациента с заболеванием, ассоциированным с геном(ами), содержащим нонсенс-мутацию(и). В некоторых вариантах осуществления количество, продуцируемое клеткой пациента составляет приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5%, приблизительно 7% или приблизительно 10% (в других вариантах осуществления приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 75%, приблизительно 90% и в других вариантах осуществления 0,1-25%, 0,1-50%, 0,1-90%, 10-90%, 5-25%, 5-90%, 10-98%, 0,1-98% или 5-98%) от количества, продуцируемого клеткой того же вида и типа от субъекта, который не имеет заболевания, при этом клетка содержит ген(ы), кодирующий соответствующий белок (белки) дикого типа. Количество функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором и количество белка(белков) дикого типа можно измерять с использованием любого анализа, известного специалисту в данной области, при условии, что способы, которые используют для измерения обоих белков, являются единообразными. В определенных вариантах осуществления количество функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором и количество белка(ов) дикого типа измеряют посредством иммунологического анализа (например, ELISA). В конкретном варианте осуществления клетка пациента представляет собой клетку от пациента, которому вводят или будут вводить дозы средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона.

Это изобретение относится к способам лечения, управления течением и/или профилактики заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией(ими) в гене(ах), при этом способы включают пероральное введение субъекту (предпочтительно человеку), нуждающемуся в этом, эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, где эффективное количество средства (средств) является достаточным для продукции эффективного количества функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого геном(ами), содержащим нонсенс-мутацию(и). В определенных вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки. В конкретном варианте осуществления эффективное количество средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки, которые разделены на три дозы, при этом первая и вторая дозы составляют по 25% от общего вводимого количества и третья доза составляет 50% от общего вводимого количества. В других вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) представляет собой количество средства (средств), которое приводит к концентрации в плазме, составляющей 0,1 мкг/мл, 2 мкг/мл или более (в некоторых вариантах осуществления 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл, 20 мкг/мл, 25 мкг/мл, 30 мкг/мл, 35 мкг/мл, 40 мкг/мл, 45 мкг/мл, 50 мкг/мл, 75 мкг/мл, 100 мкг/мл, 125 мкг/мл, 150 мкг/мл, 175 мкг/мл, 200 мкг/мл, 225 мкг/мл, 250 мкг/мл, 275 мкг/мл, 300 мкг/мл, 325 мкг/мл, 375 мкг/мл, 400 мкг/мл, 425 мкг/мл, 450 мкг/мл, 475 мкг/мл или 500 мкг/мл) средства в течение, по меньшей мере, 2 часов, по меньшей мере, 2,5 часов, по меньшей мере, 3 часов или более. В определенных вариантах осуществления средство(а) для супрессии нонсенс-кодона не проявляет значительную антибактериальную активность против грамотрицательного микроорганизма и/или грамположительного микроорганизма. Это изобретение относится к способам лечения, управления течением и/или профилактики заболевания, обусловленного нонсенс-мутацией в гене(ах), при этом способы включают введение субъекту (предпочтительно человеку), нуждающемуся в этом, эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, где эффективное количество средства (средств) является достаточным для обеспечения концентрации в плазме от 0,1 мкг/мл до 500 мкг/мл средства (средств) в течение 2 часов, 2,5 часов, 3 часов или более. В определенных вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки. В конкретном варианте осуществления, эффективное количество средства (средств) составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки, которые разделены на три дозы, при этом первая и вторая дозы составляют по 25% от общего вводимого количества и третья доза составляет 50% от общего вводимого количества. В некоторых других вариантах осуществления средство(а) не обладает значительным антибактериальным эффектом против грамположительного микроорганизма и/или грамположительного микроорганизма.

Это изобретение относится к способам лечения, управления течением и/или профилактики заболевания, обусловленного нонсенс-кодоном в гене(ах), при этом способы включают введение субъекту (предпочтительно человеку), нуждающемуся в этом, эффективного количества средства для супрессии нонсенс-кодона, которое не проявляет значительную антибактериальную активность против грамотрицательного микроорганизма и/или грамположительного микроорганизма. В определенных вариантах осуществления эффективное количество средства (средств) составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки. В конкретном варианте осуществления эффективное количество средства (средств) составляет между 0,1 мг/кг и 500 мг/кг в сутки, которые разделены на три дозы при этом первая и вторая дозы составляют по 25% от общего вводимого количества и третья доза составляет 50% от общего вводимого количества.

Продукция функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей нонсенс-мутацию, является пригодным: (i) у субъектов, у которых отсутствует экспрессия достаточного количества соответствующего белка(ов) дикого типа, и/или (ii) у субъектов, для которых экспрессия конкретного функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором является полезной. В одном аспекте это изобретение относится к способам продукции у субъекта (предпочтительно человека), нуждающегося в этом, функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей нонсенс-мутацию(и), при этом способы включают ведение субъекту эффективного количества средства (средств) для супрессии нонсенс-кодона, где субъект был создан, чтобы он содержал последовательность нуклеиновой кислоты. В конкретном варианте осуществления функциональный белок (белки) с "прочитанным" терминатором соответствует белку дикого типа, который оказывает благоприятный эффект у субъекта. В определенных вариантах осуществления субъект, которому вводят средство(а), не продуцирует достаточное количество белка(ов) дикого типа, который соответствует функциональному белку(ам) с "прочитанным" терминатором. В конкретном варианте осуществления субъект, которому вводят средство(а), имеет заболевание, обусловленное недостаточной продукцией белка(ов) дикого типа, который соответствует функциональному белку с "прочитанным" терминатором. В некоторых вариантах осуществления этого изобретения субъекта, которому намереваются вводить средство(а) для супрессии нонсенс-кодона, подвергают скринингу перед введением средства (средств). В конкретном варианте осуществления субъекта подвергают скринингу для определения того, будет ли средство(а) приводить к продукции функционального белка(ов) с "прочитанным" терминатором. В другом варианте осуществления субъекта подвергают скринингу для определения эффективного количества средства (средств) для введения субъекту. В разделе 5.6, ниже, представлены способы скрининга субъектов. Это изобретение охватывает применение средства для супрессии нонсенс-кодона в целях продукции функционального белка с "прочитанны