Применение моноклональных антител, специфичных к о-ацетилированной форме ганглиозида gd2, для лечения некоторых форм рака

Применение моноклональных антител, специфичных к о-ацетилированной форме ганглиозида gd2, для лечения некоторых форм рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область исследовании

Данное изобретение имеет целью создание новых средств для диагностики и терапии форм рака, при котором клетки экспрессируют O-ацетилированную форму ганглиозида GD2. Эти средства в основном включают применение моноклональных рекомбинантных антител, фрагменты которых распознают O-ацетилированный GD2 и не распознают здоровые клетки и нервные волокна периферической нервной системы. Эти новые средства будут более специфичными в отношении раковых клеток и снизят токсичность лечения по сравнению с антителами и производными, применявшимися ранее в лечении таких форм рака.

Предшествующий уровень техники

Опухолевые клетки имеют на своей поверхности определенное количество антигенных детерминант. Среди этих антигенных детерминант некоторые являются специфичными в отношении опухоли. Эти опухолевые антигены экспрессируются преимущественно или исключительно на поверхности раковых клеток.

Эти опухолевые антигены индуцируют выработку иммунной системой различных животных, например мышей, молекул, обозначаемых антителами, отличающихся способностью точно распознавать молекулы антигенов, вызвавших их выработку.

Такое специфическое распознавание между моноклональным антителом и его антигеном человеческой опухоли представляет главный интерес для иммунного фокусирования опухолей. Действительно, оно позволяет сконцентрировать на уровне пораженных органов или тканей детектирующие агенты с целью диагностики или токсические агенты с целью лечения опухолей. Эти детектирующие или токсические агенты могут быть химическими или биологическими соединениями, возможно радиоактивными, искусственным образом присоединенными к антителам до или после их введения. Эти агенты могут также быть биологическими соединениями, естественным образом присутствующими у пациентов (компоненты комплемента, хемокины, цитокины, цитотоксические клетки, например, Т или NK лимфоциты), направляемыми к опухолевым клеткам при помощи антител.

Ганглиозиды представляют собой компоненты клеточной мембраны, и некоторые из них были охарактеризованы как опухолевые антигены. Было продемонстрировано, что ганглиозид GD2 усиленно экспрессируется у человека раковыми клетками нейроэктодермального происхождения, например при меланомах, глиобластомах, мелкоклеточных карциномах легких и нейробластомах. Перечень опухолевых патологий, приведенный здесь, не является исчерпывающим. Ретинобластомы и остеосаркомы также экспрессируют ганглиозид GD2. Определенные формы рака яичников также экспрессируют ганглиозид GD2. Ганглиозид GD2 является кислым гликолипидом, образованным керамидом, связанным с олигосахаридом, последовательность которого представляет собой глюкозу, галактозу и М-ацетил-галактозамин. К молекуле галактозы присоединены две молекулы сиаловых кислот. Концевая сиаловая кислота может быть модифицирована путем присоединения O-ацетильной группировки с образованием O-ацетилированного GD2. С помощью специфических антител к GD2, распознающих также его O-ацетилированную форму, было показано, что определенные формы рака, а именно опухоли нейроэктодермального происхождения, экспрессируют GD2 и его O-ацетилированную форму O-ацетилированный GD2 в различных пропорциях.

Были описаны различные моноклональные антитела к GD2, полученные на мышах. Терапевтическое применение моноклональных антител к GD2, 14.G2a и 3F8, относящихся соответственно к иммуноглобулинам мышей класса lgG2a и lgG3, было протестировано в клинических исследованиях.

Данные исследования показали существование ряда отрицательных побочных эффектов, присущих моноклональным мышиным антителам. Одним из таких отрицательных эффектов является аллергическая или анафилактическая реакция, которая может являться следствием иммунного ответа, развиваемого человеческим организмом против антител мыши.

Для решения данной проблемы иммуногенности моноклональных антител, полученных на мышах, возможно разработать химерные антитела с помощью генной инженерии. «Химерным» антителом называется антитело, модифицированное генетически, в котором более или менее важная часть генетической информации, кодирущей мышиное антитело, заменена на соответствующую часть человеческого антитела. Как правило, вариабельные участки легких и тяжелых цепей антител грызунов (V_H и V_L) оставляются неизмененными, тогда как остальная часть молекулы берется от человеческого антитела. Такие химерные антитела сохраняют способность специфически распознавать опухолевые антигены, присущую моноклональным антителам мыши, в то же время обладая физическими и эффекторными свойствами, присущими человеческому антителу. Так, клинические исследования показали, что химерные антитела ch.14G2a и ch.14.18 обладают сниженной иммуногеностью и увеличенным периодом полужизни в сыворотке по сравнению с моноклональными антителами мыши, на основе которых они получены. Кроме того, было показано, что моноклональные антитела мыши к GD2 при их химеризации приобретают повышенную способность рекрутировать эффекторные клетки человека, тогда как мышиные антитела обладают только ограниченной способностью рекрутировать эффекторные клетки человека.

Можно продвинуться еще дальше в отождествлении антител грызунов с антителами человека, если от антитела грызунов взять только аминокислоты участков, обозначаемых CDR (от англ. complementary determining regions), формирующих сайт связывания антигена и таким образом определяющих специфичность антител. Генетически модифицированные антитела, в которых сохранены только аминокислоты, расположенные вблизи таких участков CDR исходного антитела мыши, а остальная часть молекулы происходит от антитела человека, обозначаются «гуманизированые».

Недостатки предшествующего уровня техники.

Терапевтическое или диагностическое применение in vivo моноклональных антител требует, чтобы они одновременно обладали определенными показателями специфичности, аффинности и нетоксичности. Однако клинические исследования, проведенные на моноклональных и химерных антителах к GD2, выявили основной отрицательный побочный эффект, не устраняемый при химеризации или гуманизации, а именно нейротоксичность анти-GD2 антител. Действительно, пациенты, имеющие рак нейроэктодермального происхождения, которым вводили анти-GD2 антитела, испытывали боли на фоне введения антител, а у некоторых из этих пациентов развилась нейропатия периферической нервной системы. Данный эффект объясняется присутствием ганглиозида GD2 на поверхности клеток нервных волокон периферической системы.

Такая нейротоксичность, свойственная антителам к GD2, ограничила распространение в клинике иммунотерапии с применением этих антител. В то же время большое число антигенных мишеней GD2 остается фактором, вызывающим большой интерес для иммунного фокусирования опухолей нейроэктодермального происхождения.

Одним из подходов, который бы позволил разрешить проблему нейротоксичности, является использование антител, распознающих опухолевый антиген, ассоциированный с раком нейроэктодермального происхождения, отличный от ганглиозида GD2, и не распознающих нервные волокна периферической системы.

Несколько лет назад изобретатели провели серию иммунизации мышей для получения антител к GD2. Был выделен ряд анти-GD2 антител и их характеризация позволила идентифицировать одно антитело класса lgG3 мыши, обозаченное 8В6, специфически распознающее молекулу ганглиозида GD2, слегка модифицированную благодаря наличию O-ацетильной группы. Данные работы и, в частности, антитело 8В6 описаны в публикации « Variable Region Gene Segments of Nine Monoclonal Antibodies Specific to Disialogangliosides (CG2, GD3) and their O-Acetylated Derivatives », Cerato et al, Hybridoma Volume 16, Number 4, 1997, 307-316, включенной сюда во всей ее полноте путем ссылки.

Была изучена структура этого антитела, но работы над ним не были продолжены. Действительно, это антитело не представляло никакого особенного интереса по сравнению с другими антителами к GD2. В отличие от неацетилированных форм GD2, распределение в тканях человеческого организма O-ацетилированного GD2 остается очень мало документированным по причине отсутствия чувствительных методов определения, таких как иммунологические методы, которые основаны на использовании моноклональных антител, специфичных к ацетилированной форме GD2. Было предположено, что клиническое применение этого нового антитела будет вероятно представлять аналогичные проблемы с нейротоксичностью, как и применение моноклональных антител к GD2. Кроме того, не было выявлено никакой цитотоксической активности антитела 8В6, а антитела lgG3 не являются удобными в обращении из-за их склонности к агглютинации.

Задачи изобретения

Моноклональные антитела, специфичные к O-ацетилированному ганглиозиду GD2, которые не распознают ганглиозид GD2, могут обладать преимуществом нераспознавания нервных волокон периферической системы и, следовательно, не вызывать нейротоксичность. Такие антитела могут представлять большое преимущество по сравнению с моноклональными антителами анти-CD2 при иммунном фокусировании определенных типов злокачественных опухолей человека, таких как злокачественных опухолей нейроэктодермального происхождения, экспрессирующих ганглиозид GD2 в O-ацетилированной форме.

Такие антитела могут быть получены разными способами, известными специалистам. Часть таких методик начинается с иммунизации животных, в частности грызунов, и среди них - мышей, крыс или хомячков, зайцеобразных, и в частности кроликов, верблюдовых, и среди них - лам. Иммуноген, композиция, содержащая антиген, против которого требуется получить антитело, может быть либо собственно гликолипидом, очищенным или содержащимся в неочищенной или частично очищенной смеси, либо гликолипидом или одной из его частей, а именно гидрофильной гликозилированной частью, связанными ковалентной или нековалентной связью с белками или липидами, служащими «носителем», стимулирующим иммунный ответ. При другой процедуре иммунизации иммуноген может быть приготовлен из клеток, экспрессирующих антиген, полученных при культивировании клеток линий опухолевых клеток или первичных клеток, полученных из опухолевой ткани. Среди подходящих клеточных линий можно упомянуть, в частности, линии клеток животных, например, тимомы грызунов EL-4, или человека, например, нейобластомы человека IMR32, глиобластомы человека U87MG, мелкоклеточной карциномы человека HCI-Н82 и меланомы человека М21. Эти клетки могут вводиться в целом виде, фиксированными или живыми, или подвергаться фракционированию для введения, например, только частично очищенной фракции, содержащей компоненты клеточной мембраны или цитоплазмы.

Эти иммуногены могут вводиться животным различными способами, в частности подкожно, интраперитонеально или внутримышечно, самостоятельно или в присутствии адъюванта, в частности адъюванта на основе алюминия или адъюванта Фрейнда. Иммунизации могут повторяться с частотой от нескольких дней до нескольких месяцев.

Для получения антител для использования в промышленном применении существует 3 основных способа. Первый состоит во взятии крови иммунизированных животных и выделении из нее с помощью известных специалистам способов фракций, содержащих более или менее очищенные антитела (сыворотки или плазмы, общих иммуноглобулинов). Антитела могут быть далее очищены с помощью хроматографии или иммуноадсорбции. Второй способ заключается в том, чтобы взять клетки, способные синтезировать антитела, в частности клетки селезенки или лимфоузлов, и их обессмертить, в частности путем вирусной трансформации или соматической гибридизации согласно известным специалистам способам. Среди обессмерченных клеток с помощью клонирования можно селекционировать клетки, продуцирующие антитело, представляющее интерес, а при культивировании клеток выделить из культуральной жидкости антитела и очистить их в больших количествах. Наконец, третий способ состоит в изоляции РНК клеток, способных синтезировать антитела, в частности клеток селезенки, лимфоузлов или периферических лимфоцитов, выделенных у иммунизированных или неиммунизированных животных, или даже человека, и создании библиотек кДНК, из которых путем скрининга согласно методам, известным специалистам, в частности путем экспрессии этих библиотек на поверхности бактериофагов, известной под названием системы экспрессии фаговый дисплей, будут выбраны последовательности антител, представляющих интерес. Создание комбинаторных библиотек участков VH и VL человека, экспрессируемых на поверхности нитевидных фагов («phage display») в форме одноцепочечных фрагментов (scFv, от англ. «single chain Fv»), соединяющих участок VH и участок VL или в форме фрагментов F(ab), состоящих из легкой цепи, связанной с пептидным отрезком VH-CH1, где СН1 соответствует первому домену константного участка.

Антитела согласно данному изобретению могут быть выбраны из группы антител, полученных тем или иным описанным выше способом, отличающихся способностью распознавать в качестве антигена O-ацетилированный GD2, но не GD2, не прошедший O-ацетилирование, это свойство будет обозначено необходимой специфичностью. Такая селекция может быть проведена в ходе выделения антител, например, при размножении исключительно клеток, производящих антитела, обладающие необходимой специфичностью. В альтернативном варианте можно выбирать среди уже выделенных антител те, которые обладают такой специфичностью. С этой целью можно использовать различные способы, в частности непрямую иммунофлуоресценцию клеток для того, чтобы отличить те антитела, которые распознают клетки, известные способностью экспрессировать O-ацетилированный GD2, например IMR32, от антител, которые распознают также клетки, экспрессирующие GD2, но не O-ацетилированный GD2, например Neuro 2A. Можно также использовать иммуноферментный тест ELISA на высушенных клетках, для селекционирования антител, фиксирующихся исключительно на клетках, экспрессирующих O-ацетилированный GD2, но не на клетках, экспрессирующих только GD2. Можно также селекционировать антитела, обладающие необходимой специфичностью, путем тонкослойной хроматографии на силикагеле для разделения компонентов гликолипидов клеток, экспрессирующих как O-ацетилированный GD2, так и GD2, в частности IMR32, и отбора антител, маркирующих исключительно полосу, соответствующую O-ацетилированному GD2. Результаты можно подтвердить путем разрушения O-ацетилированного GD2 в липидном экстракте при алкилировании и исчезновении маркировки. Примеры внедрения таких способов проверки специфичности антител согласно данному изобретению приведены ниже в подробном описании изобретения. Специалистами могут быть разработаны и другие способы, нацеленные на аналогичный результат.

Антитела согласно данному изобретению могут быть модифицированы с помощью ряда методик, известных специалистам, для адаптации к различным способам применения. Известные способы предшествующего уровня техники также могут быть использованы для получения одноцепочечных антител scFv, a также ряда гибридных белков, сохраняющих способность связывать антиген. В частности, известно, что участки антител, обозначаемые константными, могут быть полностью модифицированы, например с целью замены константных участков грызунов на константные участки человеческих антител без потери распознавания антигена. Создание химерного антитела состоит в выделении ДНК, кодирующей участок VH и участок VL моноклонального антитела мыши, и ее слиянии с ДНК, кодирующей константные участки Н и L иммуноглобулина человека. Подобная генетическая конструкция позволяет произвести гибридное антитело, у которого константная часть человеческая и является неиммуногенной или слабоиммуногенной в организме человека (как правило, подразумевается константный участок lgG1 человека и участок Скаппа человека). Возможно также консервировать исключительно участки незаменимые для распознавания антигена, называемые гипервариабельными участками, участки, определяющие комплементарность, или CDR, и заменять все остальные, чтобы произвести так называемую «гуманизацию» антител. Для упрощения описания совокупность таких белков будет обозначаться как «искусственно модифицированные антитела».

Некоторые из таких белков представляют особенный интерес в качестве антител согласно данному изобретению. Например, искусственно модифицированные антитела к O-ацетилированному GD2, сохраняющие способность распознавать O-ацетилированный ганглиозид GD2, но не распознающие ганглиозид GD2, могут представлять большое преимущество по сравнению с моноклональными мышиными антителами к O-ацетилированному ганглиозиду GD2 по своим улучшенным физическим и эффекторным характеристикам.

Искусственно модифицированные антитела, специфичные к O-ацетилированному GD2, должны обладать достаточной для соответствующего антигена аффинностью, чтобы максимально предотвращать диффузию в нормальные ткани этого антитела, возможно несущего токсическое или терапевтическое соединение. В рамках настоящего изобретения, аффинность к ганглиозиду GD2 должна превосходить 10^-7 молекул/литр. Аффинность данных антител может быть повышена способами, известными специалистам. Так, экспрессия фрагментов антител на поверхности бактериофагов представляет собой важное средство для поиска высокоаффинных мутантов исходного scFv. Возможно также воспроизводить усиление аффинности, наблюдающееся в ходе развития иммунного ответа. Способы получения случайных мутаций или направленных мутаций, после которых следует селекция путем повторяющихся циклов иммуноадсорбции/элюции, были также успешно воплощены и позволили получить фрагменты антител, обладающие аффинностью, почти в 10 раз большей по сравнению с исходным фрагментом.

Отдельная задача данного изобретения, которая не должна быть лимитирована данным примером, касается искусственно модифицированных антител, произведенных на основе антитела 8В6, о котором известно, что оно обладает необходимой специфичностью, а также рекомбинантных белков, имеющих последовательности CDR, описываемые SEQ ID NO: 3-8.

Также задачей изобретения является предложение модификаций антител, обладающих необходимой специфичностью, для придания им свойств, необходимых для диагностики или лечения некоторых форм рака. Для некоторых воплощений требуется введение антител или их производных больным, страдающим определенными формами рака. В этом случае производные, последовательность которых в большей мере приближается к последовательности человеческого антитела, будут предпочтительными, поскольку они в состоянии ограничить выработку лечащимся пациентом антител против вводимой молекулы, таким образом повышая толерантность и позволяя проведение повторных инъекций. Такие производные также способны облегчать выработку антител к специфическим детерминантам вводимого антитела, так называемых анти-идиотипических антител, представляющих терапевтическое значение.

Для терапевтического применения предпочтительными модификациями являются те, которые позволяют вызвать цитотоксическую активность против опухолевых клеток, экспрессирующих интересующий антиген, в данном случае O-ацетилированный GD2.

Известно, что только некоторые классы иммуноглобулинов обладают способностью активировать комплемент или индуцировать клеточную цитотоксичность. Например, антитело 8В6 распознает O-ацетилированный GD2, но не способно индуцировать достаточно эффективно такую цитотоксичность. Таким образом, еще одна задача данного изобретения заключалась в том, чтобы предложить антитела, распознающие O-ацетилированный GD2 и обладающие цитотоксической активностью. Этого можно добиться при замещении константных участков антител константными участками антител, способными вызывать такую цитотоксичность, а именно константными участками иммуноглобулинов человека класса 1. Цитотоксическая активность далее может быть усилена, в частности, при продукции антител, особым образом гликозилированных и незначительно фукозилированных, например, при их продукции специально отобранными или трансформированными клетками. Для получения аналогичного эффекта в последовательность антител также могут быть введены специфические мутации, описанные в литературе.

Другой способ получения терапевтических антител согласно данному изобретению заключается в связывании производного антитела, обладающего необходимой специфичностью, с цитотоксическим агентом. Указанный цитотоксический агент может являться токсическим химическим агентом, антисмысловыми РНК, и в частности противоопухолевым цитотоксическим препаратом, среди которых можно упомянуть таксаны, алкалоиды барвинка и их производные, антрациклины, алкилирующие агенты, биологическим токсическим агентом, в частности растительными или бактериальными токсинами, среди которых можно назвать рицин или токсин псевдомонад, или даже радиоактивным изотопом, испускающим бета-частицы, например йод-131, иттрий-90, лютеций-177, рений-186 или медь-67, или Оже-электроны, например индий-111, или альфа-частицы, например висмут-213, висмут-212 или астат-211, данные примеры ни в коей мере не должны лимитировать пределы изобретения. Антитела могут также быть получены с помощью методов молекулярной инженерии, известных специалистам, в форме гибридного белка, связанного с цитокином. Используемые цитокины в основном являются представителями семейства интерлейкинов, такими как интерлейкин-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 и IL-18, гематопоэтических ростовых факторов, такими как ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) или Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), фактор некроза опухоли (ФНО), хемокинов. Полученный при слиянии антитела и цитокина белок обладает биологическими свойствами цитокина и специфичностью антитела, на основе которых он получен.

Антитела согласно данному изобретению могут также иметь преимущества при применении в диагностике, как при использовании in vitro для детекции присутствия антигена O-ацетилированного GD2 в образцах клеток или биологических жидкостей согласно любой методике, известной специалистам, так и при использовании in vivo при введении производного антитела, модифицированного для возможной детекции с помощью одной из медицинских визуализирующих методик, например сцинтиграфии или позитронной эмиссионной томографии. В таком случае производное антитела должно быть связано с радиоактивным изотопом, испускающим гамма-фотоны, таким как йод-131, йод-123, индий-111 или технеций-99 для сцинтиграфической визуализации или томографии одиночных фотонов, или с изотопом, испускающим позитроны, таким как фтор-18, йод-124, иттрий-86, медь-64, скандий-44, при позитронной эмиссионной томографии, причем данные примеры не должны ограничивать область изобретения.

Антитела согласно данному изобретению могут быть связаны с токсичными или радиоактивными компонентами. Токсические соединения связываются химически ковалентным образом с антителами при помощи ряда химических связей, например эфирными, амидными, дисульфидными или тиоэфирными связями. Радиоактивные атомы связываются либо непосредственно путем электрофильного замещения (в случае изотопов йода) или нуклеофильного замещения (в случае фтора-18) или посредством радиоактивно меченого реактивного синтона, в частности реактива Болтона и Хантера для изотопов йода или станнилированных активированных эфиров в случае изотопов йода или астата-211, или также при помощи хелатирующего агента в случае радиоактивного металла. В последнем случае специалисты могут выбрать хелатирующий агент, образующий с металлом стабильный комплекс в биологических жидкостях. Так, DTPA может использоваться преимущественно с индием-111, a DOTA будет предпочтителен для маркировки иттрием-90.

Антитела согласно данному изобретению могут применяться в методах, известных специалистам, в которых токсический или детектируемый агент не связан с антителом непосредственно, а напротив, связан с низкомолекулярной молекулой, вводимой на втором этапе после введения пациенту производного антитела, способного распознавать in vivo эту мелкую молекулу. В этом случае производное антитела представляет собой биспецифичное антитело или иммуноконъюгат или белок, образованный при слиянии производного антитела и авидина. Такой подход может применяться предпочтительно с антителами согласно данному изобретению для диагностики in vivo и лечения опухолей.

Антитела согласно данному изобретению, а также «производные», «производные антител» или «производные соединения» могут быть преимущественно использованы в диагностике и лечении опухолей. Среди них можно отметить опухоли нейроэктодермального происхождения, и в частности меланомы, мелкоклеточный рак легких, глиомы и нейробластомы. Соединения согласно данному изобретению могут предпочтительно использоваться для детекции или лечения таких опухолей, в частности, когда они являются диссеминированными или не поддаются существующим способам лечения.

Краткое описание изобретения.

Данное изобретение описывает применение антител для иммунного фокусирования опухолей человека нейроэктодермального происхождения, например меланом, глиобластом, мелкоклеточных карцином легких и нейробластом.

В ряду различных аспектов данного изобретения, описанных ниже, наиболее удивительным является тот факт, что одно из моноклональных антител, специфичных к O-ацетилированному GD2, не фиксируется на нервных волокнах, экспрессирующих GD2, тогда как оно распознает опухолевые клетки, экспрессирующие ганглиозид GD2 и его O-ацетилированную форму. Такие антитела обладают специфичностью исключительно в отношении опухолевых клеток нейроэктодермального происхождения и не распознают нервные волокна периферической системы. Следствием такой повышенной специфичности является снижение токсичности при терапевтическом применении, что приводит, в частности, к отсутствию фиксации на нормальной периферической нервной ткани, наблюдающейся у антител, распознающих ганглиозид GD2. Данное исследование включает применение таких антител для диагностики и лечения рака с повышенной специфичностью и сниженной токсичностью по сравнению с антителами, распознающими GD2.

Антитела согласно данному изобретению имеют цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам, которые они распознают, либо по своей сущности (это одна из причин, по которой антитела химеризуют или гуманизируют), либо поскольку их используют в качестве векторов для токсических агентов, в частности радиоактивных.

Данное изобретение таким образом включает все моноклональные антитела, химерные или гуманизированные, которые распознают исключительно O-ацетилированную форму ганглиозида GD2 или фрагмент этого антитела, указанные антитела или указанный фрагмент распознают молекулы O-ацетилированного GD2, экспрессируемые опухолевыми клетками, и не распознают молекулы GD2, экспрессируемые на поверхности периферических нервов.

Данное изобретение также включает антитела, у которых некоторые аминокислоты были заменены на другие с помощью методов молекулярной генетики, известных специалистам, в частности для модификации свойств исходного антитела, а именно для снижения его иммуногенности или повышения его токсической активности или даже для ускорения или замедления его выведения после инъекции.

Предпочтительно, искусственно модифицированное антитело или его фрагмент согласно изобретению характеризуются тем, что являются IgG каппа с аффинностью выше 10^-7 моль/литр по отношению к O-ацетилированному GD2 и аффинностью по меньшей мере в 10 раз ниже по отношению к самому GD2, указанное антитело или указанный фрагмент могут быть моно- или биспецифичными.

В частности, но не исключительно, изобретение включает любое моноклональное искусственно модифицированное антитело или его фрагмент, в котором участки, определяющие комплементарность вариабельного участка цепи Н, имеют аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, а участки, определяющие комплементарность вариабельного участка цепи L, имеют аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.

В частности, но не исключительно, изобретение включает любое монокпональное искусственно модифицированное антитело или его фрагмент, в котором тяжелая цепь получена путем слияния кДНК, кодирующей вариабельный участок тяжелой цепи антитела, полученного не у человека, и кДНК, кодирующей константный участок иммуноглобулина человека, а легкая цепь получена путем слияния кДНК, кодирующей вариабельный участок легкой цепи того же самого антитела, полученного не у человека, и кДНК, кодирующей константный участок легкой цепи иммуноглобулина человека, характеризующееся тем, что указанное антитело, полученное не у человека, является моноклональным антителом мыши 8В6, а указанное антитело, модифицированное искусственным образом, направлено против O-ацетилированной формы ганглиозида GD2 и не распознает нервные волокна периферической системы.

В частности, но не исключительно, изобретение включает любое моноклональное искусственно модифицированное антитело или его фрагмент, у которого вариабельный участок тяжелой цепи имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:1, а вариабельный участок легкой цепи имеет последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ID NO:2.

Предпочтительно, моноклональное искусственно модифицированное антитело или его фрагмент согласно п.5 является антителом КМ8В6, которое можно получить с помощью клеточной линии СНО, или его фрагментом.

Изобретение также включает любую фармацевтическую молекулу, производную искусственно модифицированного антитела или его фрагмента согласно изобретению, в которой антитело или его фрагмент связаны с молекулой X, где Х является токсической молекулой, лекарством, предшественником лекарства или вторым антителом с любой специфичностью.

В одном воплощении указанная токсическая молекула является химической, биологической или радиоактивной токсической молекулой, указанная молекула предназначена для разрушения опухолевых клеток, экспрессирующих O-ацетилированный ганглиозид GD2.

Предпочтительно указанные опухолевые клетки, против которых направлены фармацевтические молекулы согласно изобретению, представляют собой клетки нейробластомы, меланомы, глиобластомы или мелкоклеточного рака легких.

Предпочтительно фармацевтические молекулы согласно данному изобретению изменены на уровне участка Fc путем присоединения Сахаров, для модулирования таким образом активации иммунных клеток и молекул системы комплемента.

Изобретение также включает любую молекулу для диагностики рака, обнаруживающую экспрессию O-ацетилированного ганглиозида GD2 на поверхности опухолевых клеток, указанная молекула является производной искусственно модифицированного антитела или его фрагмента согласно данному изобретению, в которой указанное антитело или указанный фрагмент связан с агентом, обусловливающим детекцию антитела или указанного фрагмента с помощью флуоресценции или радиоактивности.

Изобретение касается любого применения искусственно модифицированного антитела или его фрагмента согласно изобретению и/или молекулы согласно изобретению для производства лекарственных препаратов для лечения рака, при котором клетки экспрессируют O-ацетилированную форму ганглиозида GD2, или для производства соединения для диагностики такой формы рака.

Данное изобретение также включает любое применение моноклонального антитела 8В6 (описанного в публикации « Variable Region Gene Segments of Nine Monoclonal Antibodies Specific to Disialogangliosides (CG2, GD3) and their O-Acetylated Derivatives », Cerato et al, Hybridoma Volume 16, Number 4, 1997, 307-316) для производства фармацевтических молекул, в которых указанное антитело связано с химическим, биологическим или радиоактивным токсическим агентом, указанная молекула предназначена для разрушения опухолевых клеток, экспрессирующих O-ацетилированный ганглиозид GD2.

В частности, но не исключительно, изобретение включает такое применение, при котором указанные клетки являются клетками нейробластомы, меланомы, глиобластомы или мелкоклеточного рака легких.

В частности, но не исключительно, изобретение включает такое применение, при котором указанная терапевтическая молекула изменена на уровне участка Fc путем присоединения сахаров, для модулирования таким образом активации иммунных клеток и молекул системы комплемента.

Изобретение также включает любое применение моноклонального антитела 8В6 для производства молекулы для диагностики рака, демонстрирующей экспрессию O-ацетилированного ганглиозида GD2 на поверхности опухолевых клеток, указанная молекула является производной указанного антитела, в которой указанное антитело связано с агентом, обусловливающим детекцию антитела с помощью флуоресценции или радиоактивности.

Изобретение включает также любую последовательность ДНК, кодирующую искусственно модифицированное антитело согласно данному изобретению, а также любой вектор экспрессии, содержащий такую последовательность ДНК, связанную эффективно с промотором.

Изобретение включает также любую клетку, в частности животную, содержащую такой вектор экспрессии, а также любой трансформант не из организма человека, продуцирующий искусственно модифицированное антитело согласно изобретению.

Наконец, изобретение включает любой способ продукции искусственно модифицировнного антитела против O-ацетилированного ганглиозида GD2, включающий экспрессию последовательности ДНК в клетке или трансформанте не из организма человека в соответствующих условиях и получение антитела.

Предпочтительно, клетку или трансформант культивируют в условиях, при которых происходит накопление антитела.

Краткое описание графического материала.

Фиг.1 отображает конструкцию плазмиды pcDNA3®60C3 L-VL.

Фиг.2 отображает конструкцию плазмиды pcDNA3®60C3 L.

Фиг.3 отображает конструкцию плазмиды pcDNA3® KM8B6L.

Фиг.4 отображает нуклеотидную последовательность и последовательность аминокислот легкой цепи искусственно модифицированного антитела КМ8В6.

Фиг.5 отображает конструкцию плазмиды pBluescript® II SK (+) 60С3 L-VH.

Фиг.6 отображает конструкцию плазмиды pBluescript® II SK (+) КМ60С3-Н.

Фиг.7 отображает конструкцию плазмиды pBluescript® II SK (+) КМ8В6-Н.

Фиг.8 отображает конструкцию плазмиды pcDNA3.1/Hygro© (+) КМ8В6-Н.

Фиг.9 отображает нуклеотидную последовательность и последовательность аминокислот тяжелой цепи искусственно модифицированного антитела КМ8В6.

Фиг.10 отображает SDS-электрофорез в ПААГ искусственно модифицированного очищенного антитела КМ8В6, направленного против O-ацетилированного GD2. Анализ проведен в редуцирующих условиях (слева) и нередуцирующих условиях (справа). Слева направо, маркер молекулярного веса, КМ8В6, lgG3 8B6 (редуцирующие условия), высокомолекулярный маркер, КМ8В6, и lgG3 8B6 (нередуцирующие условия).

Фиг.11 представляет график, отображающий реактивность антитела 8B6 и антитела КМ8В6 в отношении клеток IMR 32 и NeuroA, соответственно имеющих или не имеющих антигены O-ацетилированного GD2, зарегистрированную при помощи иммунофлуоресценции с отложенным по оси ординат количеством детектированных клеток, а по оси абсцисс - интенсивности флуоресценции. Голубой график соответствует реактивности контроля, а красный график соответствует реактивности продуктов.

Фиг.12 представляет график, отображающий реактивность антител 8B6 и КМ8В6 в отношении клеток IMR 32 и NeuroA, проанализированную с помощью теста ELISA.

Фиг.13 показывает результаты иммуноокрашивания ганглиозидов мозга крысы, разделенных тонкослойной хроматографией на силикагеле, выполненного с применением антитела КМ8В6. Панель А - окраска резорцином миграции различных ганглиозидов мозга крысы.

Фиг.14 отображает результаты иммуногистохимического анализа клеток нейробластомы нервных волокон человека.

Фиг.15 отображает результаты экспериментов по измерению цитотоксичности (ADCC, от англ. antibody-dependent cellular cytotoxicity, антитело-зависимая клеточная цитотоксичность). Процентное выражение активности ADCC искусственно м