Эпигенетический регуляторный комплекс для контроля экспрессии генов

Эпигенетический регуляторный комплекс для контроля экспрессии генов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к области эпигенетической регуляции экспрессии генов. В частности, данное изобретение относится к композициям и способам, включающим гистон-метилтрансферазную активность, которые нацелены на контроль экспрессии генов in vivo и in vitro.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Эпигенетика относится к передаче информации от клетки или многоклеточного организма к ее или его потомкам при отсутствии кодирования этой информации в нуклеотидной последовательности генов. Эпигенетический контроль обычно осуществляется через химическую модификацию структуры ДНК или хроматина. Экспрессию гена можно замедлять, например, метилированием и ацетилированием гистонов, которые ассоциируются с геномной ДНК. Метилирование и ацетилирование гистонов, как правило, осуществляются в "хвосте" гистонов, домене, который находится на поверхности и имеет результирующий положительный заряд вследствие распространенности таких аминокислотных остатков, как аргинин (R) и лизин (K). Химическая модификация "хвоста" гистона замедляется ферментом, имеющим гистон-метилтрансферазную активность (HMTase) и гистон-ацетилтрансферазную активность (HAT).

Эпигенетическая модификация может происходить в различные периоды нормального развития организма, а также в ходе превращения нормальных клеток в раковые клетки. Такие модификации часто приводят к сайленсингу или к активации некоторых генов. Документальными доказательствами убедительно подтверждено, что при раковом заболевании большинство опухолевых клеток имеют аномальные эпигенетические импринты ДНК (Feinberg АР & Vogelstein В, (1983) Nature 1(5895): 89-92).

Стволовые клетки представляют собой клетки, способные как к интенсивному самообновлению, так и к дифференцировке в клетки-предшественники. Стволовые клетки сами по себе являются также возможной первопричиной (возможным первоисточником) возникновения раковых заболеваний. Стволовые клетки могут иметь большую продолжительность жизни, в течение которой они приобретают генетические мутации и эпигенетические модификации, которые могут повышать склонность к злокачественному новообразованию. Предполагают, что так как стволовые клетки занимают нишу, которая так тонко балансирует между участием в конкурентной пролиферации и дифференцировке, то небольшие, но принципиальные эпигенетические изменения могут резко сдвинуть равновесие в сторону фенотипа раковых стволовых клеток. Понимание того, почему и как регулируются эпигенетические модификации, является решающим для понимания, обнаружения и лечения рака и, в частности, лечения (обработки) раковых стволовых клеток. На самом деле полагают, что одной из особенностей рецидивирующих и агрессивных раковых заболеваний, которые трудно поддаются лечению, является то, что опухоли могут содержать раковые стволовые клетки, которые не реагируют на обычные лекарственные средства.

Перенос ядра соматической клетки (SCNT) используют для получения животных в животноводстве (для клонирования или для терапии стволовыми клетками), биопроизводства белков и для моделирования заболевания (Wilmut I, Beaujean N, de Sousa PA, Dinnyes A, King TJ, Paterson LA, Wells DN, Young LE. (2002) Nature. Oct 10; 419(6907): 583-6). Одной из проблем, связанных с эффективностью и результативностью попыток SCNT, является то, что геном соматических клеток содержит интенсивные и устойчивые эпигенетические метки, которые могут препятствовать успешному перепрограммированию. Кроме того, реципиентная яйцеклетка может содержать факторы, вызывающие эпигенетический эффект, которые могут также вносить вклад в неудачу процесса. Следовательно, необходимо создать композиции и способы для повышения эффективности SCNT и, значит, тех применений в биопроцессинге, которые упрощаются с помощью этой операции.

Спецификация примордиальных (первичных половых) зародышевых клеток (ПЗК, PGC) у мыши предоставляет привлекательную экспериментальную модель для анализа влияния эпигенетических модификаций in vivo. Популяцию клеток-"основательниц" (специальных клеток, founder-cells), примерно, из 45 PGC (ПЗК) сначала обнаруживают в Е7.5 в эмбрионах мыши (Ginsburg, М., Snow, М.Н. & McLaren, А. (1990) Development 110, 521-8). Затем эти PGC мигрируют и входят в половые бугорки из Е10.5 впереди, где продолжается дальнейшее экстенсивное эпигенетическое программирование зародышевых клеток. К Е13.5 зародышевые клетки входят в профазу мейоза.

Значительные эпигенетические модификации происходят сразу же после спецификации PGC, включая метилирование и ацетилирование "хвостов" гистонов с помощью HMTase (НМТаз) и HAT, соответственно (Surani et al., 2004 (CSH Symposium); Seki et al., 2004; Lachner, M., O'Sullivan, R.J. & Jenuwein, T. (2003) J Cell Sci 116, 2117-24, и Vaquero, A., Loyola, A. & Reinberg, D. (2003) Sci Aging Knowledge Environ 2003, RE4). Среди кандидатных генов, предположительно, участвующих в регуляции этих эпигенетических изменений в PGC, имеются HMTase (НМТазы), которые относятся к семейству белков с консервативным SET/PR доменом.

Следовательно, существует потребность в создании реагентов и способов улучшения контроля эпигенетических регуляторных механизмов в клетке. В частности, необходимы композиции (составы) и способы, позволяющие лучше контролировать экспрессию генов таким образом, чтобы влиять на решение судьбы клеток в стволовых клетках и в раковых клетках.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый аспект изобретения включает выделенный полипептидный комплекс, содержащий, по меньшей мере, первый домен, имеющий сайт - специфическую ДНК-связывающую активность, и, по меньшей мере, второй домен, имеющий аргинин-метилтрансферазную активность, причем второй домен способен метилировать аргининовый остаток, локализованный в хвостовой области гистона Н2А.

В специфическом варианте изобретения второй домен имеет аргинин-метилтрансферазную активность, которая обеспечивает симметричное NG,N'G-диметилирование аргининового остатка, надлежащим образом локализованного в положении 3 в хвостовой области гистона Н2А (H2AR3). Необязательно, второй домен способен, кроме того, метилировать аргининовый остаток, локализованный в области "хвоста" гистона Н4, аргининовый остаток, надлежащим образом локализованный в положении 3 в хвостовой области гистона Н4 (H4R3). В одном варианте изобретения аргинин-метилтрансферазная активность содержится в Prmt5 аргинин-метилтрансферазном домене, или в его производном, или в его гомологе.

Согласно изобретению первый домен можно специфически направлять на связывание с одной или более консенсусных последовательностей в геномной ДНК млекопитающего, которые участвуют в контроле экспрессии генов. Обычно, но не исключительно, такие сайты могут находиться в некодирующих промоторных областях, нетранслируемых областях или интронах. В специфическом варианте изобретения ДНК-связывающий домен по изобретению способен связываться с сайтом связывания типа PRDI/Blimp1, имеющим консенсусную последовательность из четырех мотивов GGGAAAG, два находятся в 5' промоторной области целевого гена, а два расположены 3' от сайта начала транскрипции. Соответственно, ДНК-связывающий домен содержит белок Blimp1, ДНК-связывающий участок полипептида PRDI/Blimp1 или его гомолог или производное.

Второй аспект изобретения включает нуклеотидную экспрессирующую векторную конструкцию, которая применима для индукции экспрессии полипептидного комплекса в клетке млекопитающего, причем вектор содержит:

одну или более кодирующих последовательностей, функционально связанных с промоторной последовательностью,

где одна или более кодирующих последовательностей кодируют, по меньшей мере, первый полипептидный домен, имеющий сайт-специфическую ДНК-связывающую активность и, по меньшей мере, второй полипептидный домен, имеющий аргинин-метилтрансферазную активность, при этом первый домен специфически направлен на связывание с одной или более консенсусных последовательностей в геномной ДНК млекопитающего, которые участвуют в контроле экспрессии генов, а второй домен имеет аргинин-метилтрансферазную активность, которая обеспечивает симметричное NG,N'G-диметилирование аргининового остатка, локализованного в полипептидном субстрате.

Согласно особому варианту изобретения полипептидный субстрат представляет собой гистон. Необязательно, второй полипептидный домен способен метилировать аргининовый остаток, локализованный в положении 3 в "хвостовой" области гистона Н2А (H2AR3), а также аргининовый остаток, находящийся в "хвостовой" области гистона Н4.

Подходящие экспрессирующие векторы включают плазмиды, космиды, вирусные векторы и искусственные хромосомы, такие как YAC. Необязательно, промоторную последовательность можно выбирать либо из конститутивного промотора, либо из индуцибельного промотора. Подходящие индуцибельные промоторы включают хорошо описанные Tet- или Тамоксифен-регулируемые системы. Альтернативные системы могут включать промоторы, чувствительные к тепловому шоку.

В одном варианте изобретения экспрессирующий вектор содержит кассету экспрессии, в которой первая кодирующая последовательность кодирует первый полипептидный домен, а вторая кодирующая последовательность кодирует второй полипептидный домен. Необязательно, первая кодирующая последовательность кодирует полипептид PRDI/Blimp1, а вторая кодирующая последовательность кодирует полипептид Prmt5. В особых вариантах изобретения может быть предпочтительно, чтобы первая и вторая кодирующие последовательности были разделены одной или более промежуточными последовательностями. Одна или более промежуточных последовательностей может содержать, по меньшей мере, один участок внутренней посадки рибосом (IRES) с тем, чтобы содействовать бицистронной экспрессии первой и второй кодирующих последовательностей в клетке. Экспрессирующие векторы по изобретению могут также содержать одну или более нуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептид, выбранных из: селективного маркера; маркера устойчивости к антибиотикам; и гена-репортера.

Третий аспект изобретения включает способ контроля экспрессии генов в клетке млекопитающего, заключающийся в индукции образования в клетке полипептидного комплекса, содержащего, по меньшей мере, первый домен, имеющий сайт-специфическую ДНК-связывающую активность, и, по меньшей мере, второй домен, имеющий аргинин-метилтрансферазную активность, причем второй домен способен метилировать аргининовый остаток, локализованный в "хвостовой" области гистона Н2А. В особом варианте изобретения образование полипептидного комплекса индуцируется в клетке индукцией экспрессии полипептида PRDI/Blimp1, или его гомолога или производного, в клетке.

В особом варианте изобретения экспрессия полипептида PRDI/Blimp1 индуцируется в клетке с помощью трансфекции клетки экспрессирующим вектором, который кодирует полипептид Blimp1, или его производное или гомолог. Необязательно, экспрессия полипептида PRDI/Blimp1 индуцируется в клетке с помощью трансфекции клетки экспрессирующим вектором, описанным ранее. Обычно клетка млекопитающего представляет собой человеческую клетку ткани или представлена в виде линии клеток. В особом варианте изобретения клетка млекопитающего представляет собой опухолевую или раковую клетку или линию клеток. Способ по данному аспекту изобретения можно осуществлять in vitro или in vivo.

В конкретном варианте изобретения контроль экспрессии генов представляет собой контроль экспрессии одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из: с-Мус; Dhx38; Pcdh7; Q8C9T7; Xylt1; DnaH1; Baip2; Nek7; Dusp2; ENSMUSG00000027041; Sirt4; и Blimp1. Индукция полипептидного комплекса в клетке может привести к снижению экспрессии одного или более из этих генов.

Четвертый аспект изобретения включает способ стимуляции самообновления и ингибирования дифференцировки стволовой клетки, заключающийся в ингибировании образования комплекса Blimp1/Prmt5 в стволовой клетке. Необязательно, стволовая клетка представляет собой стволовую клетку млекопитающего, предпочтительно, человеческую стволовую клетку. В особых вариантах изобретения стволовую клетку выбирают из группы, состоящей из взрослой стволовой клетки; стволовой клетки-предшественника; и плюрипотентной стволовой клетки. Понятно, что изобретение никоим образом не относится к репродуктивному клонированию человека или к манипуляции с человеческими эмбрионами и их использованию для репродуктивного клонирования человека.

В специфическом варианте этого аспекта изобретения ингибирование образования комплекса Blimp1/Prmt5 в стволовой клетке осуществляется экспозицией клетки с соединением, ингибирующим (ингибитором) Blimp1, с соединением, ингибирующим Prmt5, и/или с соединением, ингибирующим комплекс Blimp1/Prmt5. Предпочтительно, ингибитор можно выбирать из низкомолекулярного ингибитора; молекулы siPHK (малой интерферирующей РНК), которая связывается с мРНК Blimp1 или Prmt5; антисмыслового олигонуклеотида, который связывается с мРНК Blimp1 или Prmt5; и доминантно-негативного варианта полипептида Blimp1 или Prmt5.

Следующий аспект изобретения включает способ контроля локализации Prmt5 в клетке, обычно локализации эндогенного Prmt5, заключающийся в индукции экспрессии в клетке полипептида Blimp1, тем самым индукции образования комплекса Blimp1/Prmt5 в клетке. Blimp1, индуцируемый в клетке, может быть либо экзогенным Blimp1, либо эндогенным Blimp1. Предпочтительно, клетка может быть стволовой клеткой млекопитающего.

Еще один аспект изобретения относится к применению полипептидных комплексов по изобретению для лечения рака и к клеткам - предпочтительно, клеткам млекопитающего/человека, - содержащим описанные выше экспрессирующие векторные конструкции.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг.1 представлены (а) краткое изложение основных событий в процессе спецификации и развития мышиной зародышевой клетки от Е7.5 до Е12.5, и (b) анализ экспрессии кандидатных генов домена SET/PR с помощью ПЦР кДНК единичной клетки от 2 репрезентативных клеток-основательниц (специальных клеток, founder cells) PGC (серые) и 2 соматических клеток (белые). Черные области показывают детекцию экспрессии в PGC и соматических клетках.

На Фиг.2 показано, что осажденный иммунопреципитацией комплекс мышиного Blimp1 проявляет аргинин-метилтрансферазную активность, (а) Меченный Myc мышиный Blimp1 или соответствующий контроль экспрессируют как указано в клетках 293Т. Мус иммунопреципитаты анализируют Вестерн-блоттингом, используя антитела против белка Мус; (b) те же самые иммунопреципитаты используют в HMTase анализах в отношении очищенного гистона Ну; Н2А и рекомбинантного Н2А (rН2А). Для каждого показана флуорограмма (F) и мембрана, окрашенная раствором Понсо (Р); (с) микросеквенирование меченного радиоизотопной меткой rН2А, по оси x показаны аминокислоты 1-14 rН2А, по оси у показано [³Н]- включение отдельных аминокислотных остатков в виде числа импульсов в минуту (cmp); и (d) выравнивание, показывающее сохранение последовательности крайнего N-конца Н4 и Н2А.1;

На Фиг.3 показано, что перекрывающаяся экспрессия Blimp1 и Prmt5 в зародышевых клетках приводит к специфическому паттерну H2A/H4R3me, (a, b, c) Паттерн экспрессии Blimp1, Prmt5 и Prmt1 в PGC на различных стадиях обнаруживают иммуноокрашиванием антителами, специфическими к Blimp1 (a), Prmt5 (b) и Prmt1, (с) зародышевые клетки детектируют как показано, используя антитела против stella/PGC7, Oct4 или TG1/SSЕА1, объединенные (слитые) изображения показаны с ДНК, окрашенной с помощью DAPI; (d, е) Меченный Myc мышиный Blimp1 или соответствующие контроли экспрессируют как указано в клетках 293Т, Мус, Prmt5 или Prmt1 иммунопреципитаты анализируют Вестерн-блоттингом, используя антитела против Prmt5, Мус или Prmt1, звездочкой показан неспецифический сигнал; и (f) Метилирование Н2А/Н4 R3 в зародышевых клетках оценивают иммуноокрашиванием в клетках PGC на различных указанных стадиях развития H4R3me2s антителами, зародышевые клетки совместно окрашивают антителами против стадиеспецифических маркеров, а именно, Oct4 или TG1/SSEA1, объединенные (слитые) изображения показаны с ДНК, окрашенной с помощью DAPI, масштаб: 10 мкм (масштаб идентичен во всех рисунках).

На Фиг.4 показана in vivo идентификация Blimp1/Prmt5 связывающих элементов с геномным локусом Dhx38, (а) положения предполагаемых сайтов связывания Blimp1 близ Dhx38 начала транскрипции (TS) и стартового кодона (ATG), также показаны амплифицируемые последовательности для ChIP анализа (А, В, С, D), (b) Взаимодействие эндогенного Prmt5 с геномной ДНК локуса Dhx38 с помощью ChIP анализа, фракцию супернатанта (s) или ядерную фракцию (n) клеточных экстрактов выделенных клеток половых бугорков Е10.5 эмбрионов осаждают иммунопреципитацией антителами либо к Prmt5, либо к IgG, в качестве контроля используют геномную ДНК "хвоста" (+) и воду (-).

На Фиг.5 показано, что экспрессия Dhx38 активируется в зародышевых клетках при транслокации Blimp1 и Prmt5 из ядра в цитоплазму, что приводит к снижению уровней модификации H2A/H4R3me2s, иммуноокрашивание (a) Dhx38, (b) Blimp1 и Prmt5, и (с) H2A/H4R3me2s осуществляют на криосрезах половых бугорков на указанных стадиях развития, зародышевые клетки детектируют, используя специфические антитела: stella/Pgc7, Oct4 или TG1/SSEA1, объединенные изображения показаны с ДНК, окрашенной с помощью DAPI, масштаб: 10 мкм (масштаб идентичен во всех рисунках).

На Фиг.6 показан анализ Blimp1, Prmt5 и Dhx38 в плюрипотентных EG клетках и клетках эмбриональной карциномы (ЕС) (а) Иммуноокрашивание на Blimp1, Prmt5 и Dhx38 осуществляют на EG клетках, объединенные изображения показаны с ДНК, окрашенной DAPI, обратите внимание на обратное соотношение между экспрессией Dhx38 и Blimp1; (b) Вестерн-блоттинг ES, EG или ЕС (Р19) экстрактов для Blimp1 и Oct4; (с) Меченный Myc мышиный Blimp1 экспрессируют как указано в Р19 плюрипотентных ЕС клетках, Prmt5 иммунопреципитаты анализируют Вестерн-блоттингом, используя антитела к Prmt5, Blimp1 или Dhx38, причем уровни тубулина, показывающие равную нагрузку на дорожке ввода, обнаруживают, используя антитело против тубулина, следует отметить репрессию Dhx38, когда Blimp1 вводят в ЕС (Р19) клетки; (d) Повышенные уровни H4R3me2s на Dhx38 локусе в Myc-Blimp1 трансфецированных ЕС (Р19) клетках анализируют с помощью ChIP, клеточные экстракты Р19 клеток осаждают иммунопреципитацией антителами либо к Myc, либо к H4R3me2s, А, В, С, D относятся к областям в Dhx38 локусе, содержащем сайты связывания Blimp1, как объясняется на Фиг.4.

На Фиг.7 показаны (а) Иммунофлуоресцентный анализ кандидатных генов домена SET/PR при использовании скрининга экспрессии методом ПНР в Е7.5, показанном на Фиг.1; иммуноокрашивание выделенных клеток из Е8.5 эмбрионов специфическими антителами против специфических гистоновых метилтрансфераз, как указано, зародышевые клетки детектируют, используя антитела, специфические к зародышевым клеткам, Oct4 или Stella/PGC7; (b) совместное иммуноокрашивание Blimp1 и Prmt5 с применением соответствующих антител в Е8.5 PGC, зародышевые клетки метят с применением экспрессии тканенеспецифической щелочной фосфатазы (АР), объединенные изображения показаны с ДНК, окрашенной с помощью DAPI, масштаб: 10 мкм (масштаб идентичен во всех рисунках).

На Фиг.8 дается характеристика Н4 R3me2s антител, аргинин может быть модифицирован единственной метальной группой (а), или двумя метильными группами, которые расположены симметрично (b) или асимметрично (с); антитело против Н4 R3me2s (Abeam™) сначала получают, используя Н4 синтетический пептид с R3 симметричным ди(е?)метилированием, для проверки его специфичности проводят Вестерн-блоттинг; (d) против гистонов из тимуса теленка (Н4, Н3, Н2А, Н2В) инкубируют в присутствии и в отсутствие осажденного иммунопреципитацией Myc-Blimp1, и (е) согласно конкурентному анализу в отношении Н4 пептидов, включая немодифицированные, R3me2s и R3me2a, антитело четко узнает симметрично диметилированный пептид.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перед тем, как давать подробное описание изобретения, приводится ряд определений, которые помогут понять изобретение. Все ссылочные материалы, цитируемые в данном описании, вводятся ссылками во всей полноте. Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют то значение, которое оно обычно имеет для рядовых специалистов в той области техники, к которой относится данное изобретение.

Термин "перепрограммирование" по данному описанию относится к стадии изменения или удаления эпигенетических модификаций из ядра клетки. Перепрограммирование способствует редукции при коммитировании клеток и, следовательно, состоянию дифференцировки клетки в целом и, в частности, ядра. По сути перепрограммирование состоит из возврата ядра соматической дифференцированной или коммитированной клетки к экспрессии гена, эпигенетическому и функциональному состоянию, характерному для эмбриональной, зародышевой или стволовой клетки. Перепрограммирование ядер соматических клеток представляет собой предпочтительную первую стадию в таких методах, как SCNT, но оно также представляет интерес для других методов, в которых важен контроль дифференцировки клеток, т.е. способность к дифференцировке, дифференцировочные потенции.

Термин "рак" применяется в данном описании для обозначения ткани, локализованной в новообразовании (неоплазме, опухоли) или обладающей свойствами, ассоциированными с новообразованием (неоплазмой, опухолью). Новообразования обычно обладают характеристиками, которые отличают их от нормальной ткани и нормальных клеток. Такие характеристики включают, но без ограничения: степень анаплазии, изменения морфологии клеток, неправильность формы, пониженную адгезивность, способность к метастазированию, повышенные уровни ангиогенеза, повышенная инвазивность клеток, пониженные уровни клеточного апоптоза и, как правило, повышенную злокачественность клеток. Термины, соответствующие термину "рак", а часто являющиеся его синонимами, включают саркому, карциному, опухоль, эпителиому, лейкоз (лейкемию), лимфому, полип, перерождение, неоплазму (новообразование) и т.п.

Термин "эпигенетическая модификация" относится к химическому мечению (маркировке) генома. Эпигенетические метки могут включать метилирование ДНК (импринты), а также метилирование и ацетилирование белков, ассоциированных с ДНК, таких как гистоны. Экспрессию генов, специфических в отношении родных родителей (либо из материнской, либо из отцовской хромосомы), часто наблюдается у млекопитающих и является результатом эпигенетических модификаций. В родительских зародышевых линиях эпигенетическая модификация может привести к стабильному сайленсингу или к стабильной активации генов.

"Биопроцессинг" относится к методам, в которых живые клетки или их компоненты используют для получения нужного конечного продукта. В контексте настоящего изобретения эпигенетические модификации в клетках можно использовать для повышения этой способности клеток с целью применения в биопроцессинге. Обычно методы биопроцессинга включают SCNT.

Термины "производные или гомологи" доменов ДНК-связывания и/или аргинин-метилтрансфераз по данному описанию относятся к мРНК и полипептидам, которые обладают идентичностью последовательностей, практически аналогичной молекулам по изобретению, соответственно. Полагают, что производные и гомологи включают ортологи последовательностей из других видов и мутанты, у которых, тем не менее, наблюдается высокий уровень функциональной эквивалентности. Под практически аналогичной (сходной) идентичностью последовательностей понимают уровень сходства последовательностей, примерно, от 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, примерно, до 99% идентичности. Процент идентичности последовательностей можно определить, используя обычные методы (Henikoff and Henikoff, Pros. Natl. Acad. Sci. USA 1992; 89: 10915, и Altschul et al. Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402). Или же гомологи полипептидов по изобретению могут представлять собой такие последовательности, которые могут демонстрировать способность гибридизоваться с последовательностями по данному описанию в условиях высокой, средней или низкой жесткости.

Термин "экспрессирующий (экспрессионный) вектор" ("вектор экспрессии") применяют для обозначения молекулы ДНК, являющиеся либо линейной, либо кольцевой, в которую может быть интегрирован фрагмент последовательности другой ДНК. Такой (такие) фрагмент(ы) ДНК могут включать дополнительные сегменты, которые обеспечивают транскрипцию гена, кодированного фрагментом последовательности ДНК. Дополнительные сегменты могут включать, но без ограничения: промоторы, терминаторы транскрипции, энхансеры, участки внутренней посадки рибосом, нетранслируемые области, сигналы полиаденилирования, селективные маркеры, ориджины репликации и тому подобное. Экспрессирующие векторы часто получают из плазмид, космид, вирусных векторов и искусственных хромосом дрожжей; векторы часто представляют собой рекомбинантные молекулы, содержащие последовательности ДНК из нескольких источников.

Выражение "функционально связанный", в применении к последовательностям ДНК, например, в экспрессирующем векторе, указывает, что последовательности расположены таким образом, что для достижения определенных целей они действуют совместно, а именно, промоторная последовательность содействует инициации транскрипции, которая происходит с помощью связанной кодирующей последовательности до сигнала терминации транскрипции.

"Полинуклеотид" представляет собой одно- или двухнитевую (тяжевую, цепочечную) ковалентно связанную последовательность нуклеотидов, в которых 3' и 5' концы каждого нуклеотида соединены фосфодиэфирными связями. Полинуклеотид может состоять из дезоксирибонуклеотидных оснований или рибонуклеотидных оснований. Полинуклеотиды включают ДНК и РНК и могут быть получены синтетически in vitro или выделены из природных источников. Размеры полинуклеотидов обычно выражаются в виде числа пар (нуклеотидных) оснований (пар нуклеотидов, п.н., bp) для двухнитевых полинуклеотидов, или, в случае однонитевых полинуклеотидов, в виде числа нуклеотидов (nt). Одна тысяча п.н. или nt равна килобазе (kb). Полинуклеотиды длиной менее примерно 40 нуклеотидов обычно называют "олигонуклеотидами".

Термин "промотор" по данному описанию обозначает область в гене, с которой факторы транскрипции и/или РНК полимераза могут (может) связываться таким образом, чтобы контролировать экспрессию ассоциированной кодирующей последовательности. Обычно, но не всегда, промоторы локализованы в 5' некодирующих областях генов, 5' от кодона инициации трансляции. Промоторная область гена может содержать одну или более консенсусных последовательностей, которые действуют как распознаваемые сайты связывания для специфических в отношении последовательности ДНК-связывающих доменов ДНК-связывающих белков. Тем не менее, такие сайты связывания могут также быть локализованы в областях вне промотора, например, в энхансерных областях, расположенных в интронах или 3' от кодирующей последовательности.

Термин "выделенный", в применении к полипептиду или комплексу (объединению) полипептидов, обозначает полпептид, который выделен из организма, который является его природным источником. Предпочтительно, чтобы выделенный полипептид практически не содержал других полипептидов, нативных для протеома организма - источника. Наиболее предпочтительно, чтобы чистота выделенного полипептида составляла, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, более 99%. В данном контексте предполагается, что термин "выделенный" включает один и тот же полипептид в альтернативных физических формах, либо в нативной форме, в форме денатурированного белка, в димерной/мультимерной форме, в форме гликозилированного, кристаллизованного, либо дериватизированного белка. Ссылка на "комплекс" ("объединение") в данном описании включает примеры, в которых первый и второй полипептидные домены находятся в единой полипептидной цепи, а также в которых первый и второй домены входят в состав отдельных полипептидных цепей, которые нековалентной связью связаны друг с другом, а также в которых образуются посттрансляционные ковалентные связи, связывающие отдельные домены в один объединенный функциональный элемент (единицу).

В одном варианте настоящего изобретения предусматривается новый комплекс между Blimp1 и Prmt5, способный регулировать экспрессию генов в клетках млекопитающих по механизму эпигенетического контроля.

Обычно соматические клетки развиваются по пути дифференцировки, развиваясь от состояния менее специализированной клетки к состоянию более специализированной или коммитированной клетки. Менее специализированные клетки могут демонстрировать способность вести себя как стволовые клетки-предшественники, дающие начало некоторым различным типам клеток. Количество этих различных типов клеток, для которых данная стволовая клетка может служить в качестве предшественника, обычно называют "потентностью" этой стволовой клетки. Следовательно, плюрипотентные стволовые клетки могут вести себя как предшественники очень многих различных типов дифференцированных клеток. Если клетка может дифференцироваться во все клетки организма, она является тотипотентной стволовой клеткой, если клетка может дифференцироваться в большинство типов клеток, она является плюрипотентной стволовой клеткой. Эмбриональные стволовые клетки обычно называют плюрипотентными, так как они могут генерировать большинство типов клеток млекопитающих, за исключением экстраэмбриональных тканей (т.е. трофэктодермы). Настоящее изобретение включает способ контроля выбора судьбы клетки на уровне контроля экспрессии генов. Белковый комплекс по изобретению, будучи экспрессирован или иным способом введен в клетки млекопитающих, сдвинуть судьбу клетки в другую сторону от выбора плюрипотентности. Напротив, ингибирование активности белкового комплекса по изобретению, или даже одного компонента, Blimp1, в стволовых клетках может сдвинуть судьбу клетки в сторону выбора плюрипотентности и самообновления.

Другой родственной областью полезности настоящего изобретения является терапия рака. Большинство, если не все, раковые заболевания подвергаются эпигенетическим изменениям, включая в значительной степени деактивацию и сайленсинг генов-супрессоров опухолей и активацию онкогенов. Реактивация генов-супрессоров опухолей может уменьшить интенсивность фенотипа рака, поскольку может подавить (негативно регулировать) онкогены. Следовательно, способ контроля экспрессии генов и выбора судьбы клеток in vivo представляет очень обещающее направление в терапии рака.

Созревание белка (Blimp1), индуцированное В-лимфоцитами

Blimp1 представляет собой белок длиной 100 кДа, который содержит пять ДНК-связывающих мотивов цинковых пальцев (GENBANK регистрационный по: NM_007548). Человеческий гомолог Blimp1 называется либо PRDI-BF1, либо PRDM1 (GENBANK регистрационный по: NM_000198). кДНК Blimp1 сначала выделяли вычитательным (субстрактивным) скринингом линии клеток В-клеточной лимфомы (BCL₁) после обработки цитокинами IL-2 и IL-5. эктопической экспрессии Blimp1 достаточно для того, чтобы вызвать конечную дифференцировку BCL₁ клеток. Считается, что Blimp1 является 'мастер-регулятором' (общим регулятором) конечного развития В-клеток (Yu J. et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 20(7): 2592-2603).

У человека PRDI-BF1, человеческий ортолог мышиного Blimp1, способен образовывать комплекс с Н3 лизин-метилтрансферазой G9a. Показано, что этот комплекс способен вызвать сайленсинг гена человеческого интерферона-β (IFN-β) по опосредованному хроматином механизму в промоторной области гена (Gyory I. et al. (2004) Nat. Imm. 5: 299-308).

Показано, что Blimp1 образует комплекс с факторами, которые принимают участие в эпигенетических модификациях. Полагают, что комплекс, содержащий Blimp1 и гистонную деацетилазу (HDAC), изменяет структуру нуклеосомы и ингибирует транскрипцию генов за счет деацетилирования лизиновых остатков на "хвостах" гистона. Так как ацетилирование лизиновых остатков эффективно нейтрализует их положительный заряд, деацетилирование возвращает заряд и приводит к модификации структуры нуклеосомы вследствие стерических и других эффектов.

Известные мишени Blimp1 включают c-Myc, IFN-β, CD23, CD22, ГКГ (МНС) класса II, BSAP (Pax 5), фактор ранних В-клеток и CIITA. Все эти гены претерпевают транскрипционную регрессию под действием Blimp1. Транскрипция гена c-Myc подавляется Blimp1 в процессе дифференцировки В-клеток и является важной мишенью Blimp1 в клетках лимфомы BCL₁. Для того чтобы Blimp1 подавлял промотор c-Myc, нужны различные области молекулы Blimp1, включая N-концевой кислый домен и область между аа 90 и 464 (Yu J. et al., см. выше).

Онкобелок c-Myc важен для контроля регуляторов роста, апоптоза и/или дифференцировки, а его дисрегуляция также является причиной широкого ряда новообразований. Дисрегуляция экспрессии c-Myc в В-клетках часто вызывает опухоли. Хромосомные транслокации гена с-Мус в локусы гена Ig присутствует в большинстве лимфом Беркитта и мышиных плазмацитом (Lin K.I. et al. (2000) Mol. Cell Biol. (20)23: 8684-8695).

Мышиные клетки ES можно сохранять как плюрипотентную, самообновляющуюся популяцию с помощью LIF/STAT3-зависимой передачи сигнала. Было показано, что STAT3 регулирует экспрессию транскрипционного фактора (фактора транскрипции) Myc. Полагают также, что для взрослых стволовых клеток требуется активация Myc. Методом RT-ПЦР (RT-PCR) анализа показано, что транскрипция Myc повышается в ES клетках. Обычно для ES клеток требуется культуральная среда, которая включает LIF, иначе ES клетки имеют тенденцию скорее к дифференцировке, нежели к самообновлению. Обнаружено, что уровни Myc в клетках ES быстро разрушаются после удаления LIF из культуры, это указывает, что он может быть необходим для дифференцировки ES клеток. Эксперименты наводят на мысль, что один Myc может поддерживать состояние клеток ES (т.е. плюрипотентный фенотип) на уровне, сопоставимом с LIF, а когда Myc инактивируется, пул стволовых клеток уменьшается (Cartwright P. et al. (2005) Development 132: 885-896).

Белок Аргинин-Метилтрансфераза 5 (Prmt5)

Известно два типа гистонных метилтрансфераз (HMTase), которые включают любой домен SET (Suvar3-9, Энхансер Zeste, Trithorax), обнаруженный сначала в белках, обладающих лизин-специфической метилазной активностью, или домен с аргинин-специфической метилазной каталитической активностью, обнаруженный в PRMT. PRMT делятся на типы I и II: PRMT типа I катализируют монометилирование и асимметрическое ди(е?)метилирование аргининовых остатков, в то время как PRMT типа II катализируют образование монометилированных и симметрично диметилированых аргининовых остатков. Из шести известных PRMT только PRMT5 (GENBANK регистрационные No: NM_006109 (человеческий); NM_013768 (мышиный)) ведут себя как PRMT типа II, которые могут нацеливаться на гистоны. Конкретно, показано, что PRMT5 нацелен на конкретные остатки аргинина в Н3 и Н4 N-концевых хвостах.

PRMT5 может ассоциироваться с комплексами ремоделирования хроматина на основе BRG1 и hBRM hSWI/SNF. В таких комплексах PRMT5 способен стимулировать рост клеток и независимый от заякоривания рост, метилируя остаток аргинина 8 гистона Н3 (H3R8), и тем самым снижая экспрессию генов, таких как ST7 и NM23, которые, как известно, принимают участие в супрессии опухолей (Richard S. et al. (2005) Biochem. J. 388: 379-386). PRMT5 также принимает участие в транскрипционной регрессии CYCLIN Е и САD.

Комплекс Blimp1/Prmt5

Заявитель настоящего изобретения приступили к идентификации возможной активности домена Blimp1 SET/PR, так как никакой специфической гистон-метилтрансферазной активности не было отнесено к самому Blimp1. Заявитель показал, что Blimp1 могут образовывать новый комплекс с PRMT5, комплекс, который in vivo сохраняется в линии дифференцировки мышиных зародышевых клеток до входа PGC в половые бугорки, это наводит на мысль, что Blimp1 постоянно принимает участие в последовательности поколений ранних зародышевых клеток млекопитающих. Дальнейший анализ, более подробно описанный ниже, показывает, что новый комплекс Blimp1/Prmt5 сообщает уникальные характерные эпигенетические признаки благодаря метилированию гистонов Н2А и Н4. Полагают, что это первый пример, в котором метилирование хвоста гистона Н2А показано как эпигенетический регуляторный механизм. Далее, эксперименты, более подробно описанные ниже, показывают, что в то время как Prmt5 присутствует в плюрипотентных EG и ES клетках, Blimp1 в них отсутствует.

Экспрессия Blimp1 в линии плюрипотентных клеток ЕС Р19 приводит к репрессии гена, который, как известно, экспрессируются в плюрипотентных клетках на высоком уровне. Эксперименты наводят на мысль, что комплекс Blimp1/Prmt5 является важным регулятором экспрессии генов и может оказывать заметное влияние на выбор судьбы клеток, в частности, в отношении плюрипотентности и диф