Векторы для множественной генной экспрессии

Векторы для множественной генной экспрессии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к рекомбинантному вектору, сконструированному для независимой экспрессии множественных нуклеотидных последовательностей, представляющих интерес, которые получены от одного и того же организма или от близкородственных организмов. Данное изобретение относится к области технологии рекомбинантных нуклеиновых кислот для экспрессии множественных нуклеотидных последовательностей, проявляющих гомологию друг с другом, в различных, как прокариотических, так и эукариотических, системах in vitro или у субъекта животного или человека для терапевтических или профилактических целей. Настоящее изобретение особенно полезно в области иммунотерапии, в частности для лечения или предупреждения патологических состояний, вызванных инфекционными организмами, такими как папилломавирус и вирус гепатита.

Технология рекомбинантных ДНК дала возможность экспрессировать нуклеотидные последовательности в культивируемых клетках-хозяевах или в живых организмах. Несколько плазмидных ДНК и вирусных векторов создано и применено для разнообразных целей, включая вакцинацию, генотерапию, иммунотерапию и экспрессию в культивируемых клетках. Векторы, такие как аденовирусные и поксвирусные векторы, обладают тем преимуществом, что они вмещают большую клонирующую емкость с потенциалом экспрессии множественных нуклеотидных последовательностей в широком диапазоне клеток-хозяев. Экспрессия множественных нуклеотидных последовательностей может обладать преимуществом в целях улучшения терапевтической эффективности, обеспечиваемой кодируемыми полипептидами (например, комбинирования гуморального и клеточного иммунитета). Вероятнее, вместо получения множества рекомбинантных векторов, сконструированных отдельно для экспрессии каждой из желаемых нуклеотидных последовательностей, было бы предпочтительно получение одного рекомбинантного вектора, по меньшей мере для упрощения стадий получения и официального разрешения.

Например, в отношении папилломавирусных инфекций представляла бы интерес экспрессия иммуногенных полипептидов от нескольких генотипов папилломавирусов с целью расширения или усиления иммунного ответа хозяина, особенно у субъекта, подверженного риску множественных инфекций, например HPV-16 и HPV-18. Однако нуклеотидные последовательности, кодирующие такие иммуногенные полипептиды, высоко гомологичны между родственными генотипами HPV. Например, последовательности HPV-16 E6 и HPV-18 E6, которые проявляют общую гомологию 63% на нуклеотидном уровне, тем не менее содержат конкретные участки очень высокой гомологии выше 75%, что может подвергать риску экспрессию генов HPV-16 и HPV-18 с одного вектора.

Кроме того, при экспрессии полипептидов вирусного происхождения гомологичные нуклеотидные последовательности могут также возникать в связи с организацией вирусного генома в целом. Достаточно часто вирус использует одну и ту же нуклеотидную последовательность для кодирования двух различных белков посредством таких биологических механизмов, как внутренняя инициация трансляции или сдвиг рамки считывания, то есть одна и та же последовательность ДНК транслируется более чем в одну рамку считывания. Например, в геноме HPV-16 соседние гены Е1 и Е2 перекрываются на 59 нуклеотидов, которые транслируются в различных рамках считывания. Иными словами, 59 последних нуклеотидов гена Е1 перекрываются с первыми 59 нуклеотидами гена Е2.

Однако ожидают, что присутствие гомологичных последовательностей в векторе отрицательно влияет на его стабильность, в частности во время стадий продуцирования вектора, приводя к потере генных последовательностей вследствие событий рекомбинации, которые происходят между гомологичными последовательностями. Таким образом, в экспрессию генов HPV-16 Е1 и Е2 в одном векторе вовлечено присутствие общего участка из 59 нуклеотидов, что может потенциально привести к событиям гомологичной рекомбинации и, в конечном счете, к потере последовательностей, содержащихся между гомологичными последовательностями Е1 и Е2. Такие нежелательные события гомологичной рекомбинации могут также происходить при экспрессии последовательностей генов HPV-16 и HPV-18 в одном и том же векторе. Эта проблема нестабильности может сделать штамм вектора неприменимым, в частности для клинических испытаний на человеке.

Для решения этой проблемы в WO 92/16636 предложена вставка в рекомбинантный вектор гомологичных нуклеотидных последовательностей в противоположной ориентации по отношению друг к другу, чтобы, таким образом, уменьшить вероятность событий рекомбинации. Однако данная стратегия была описана в связи с вектором на основе вируса осповакцины, а не для других рекомбинантных векторов, таких как аденовирусы. Кроме того, расположение в противоположной ориентации не всегда возможно вследствие возможной промоторной интерференции и особенностей конструкции.

В данной области техники существует необходимость в создании рекомбинантных векторов, способных к экспрессии в клетке-хозяине или субъекте-хозяине нуклеотидных последовательностей, полученных от одного и того же или от близкородственных организмов, которые в нативном окружении содержат высоко гомологичные участки. Настоящее изобретение решает задачу обеспечения новой стратегии, предназначенной для минимизации вероятности событий рекомбинации, путем изменения любой или обеих гомологичных нуклеотидных последовательностей, используя вырожденность генетического кода, чтобы сделать их менее гомологичными, чем до модификации, при этом не изменяя или значительно не изменяя кодируемую аминокислотную последовательность. Настоящее изобретение позволяет преодолеть разрушительный эффект гомологичной рекомбинации, которая может происходить между гомологичными последовательностями, особенно во время стадий продуцирования вектора, и приводить к потере нуклеотидных последовательностей, содержащихся между ними. Обнаружено, что вектор по настоящему изобретению удивительно эффективен при экспрессии папилломавирусных генов Е1 и Е2, которые в нативном окружении имеют общий 100% гомологичный участок из 59 нуклеотидов, и удивительно стабилен во время стадий продуцирования вектора. Также обнаружено, что вектор по настоящему изобретению удивительно эффективен при экспрессии генов Е6 и Е7, полученных от близкородственных генотипов HPV-16 и HPV-18.

Данная техническая задача решена в результате разработки решений, определенных в формуле изобретения.

Другие и дополнительные аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными на основании приведенного ниже описания предпочтительных на данный момент воплощений изобретения. Эти воплощения приведены в целях раскрытия.

Соответственно, в первом аспекте в настоящем изобретении предложен вектор, содержащий по меньшей мере первую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую первый полипептид, и вторую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую второй полипептид, где:

- указанные первая и вторая молекулы нуклеиновой кислоты получены соответственно от первой и второй нативных нуклеиново-кислотных последовательностей, которые проявляют процент гомологии примерно 80% или выше, чем 80%, на протяжении участка из 40 или большего числа непрерывных нуклеотидов, и

- указанная первая молекула нуклеиновой кислоты и/или указанная вторая молекула нуклеиновой кислоты, содержащаяся в векторе, модифицирована таким образом, чтобы снизить указанный процент гомологии до значения менее чем 75%.

Как используют здесь на протяжении всей заявки, термины в единственном числе используют в том смысле, что они означают "по меньшей мере один", "по меньшей мере первый", "один или более чем один" или "множество" соединений или стадий, на которые ссылаются, если контекст не требует иного. Например, термин "клетка" включает множество клеток, включающее их смесь.

Термин "и/или" при использовании здесь включает значение "и", "или" и "все или любая другая комбинация элементов, связанных указанным термином". Например, "первая молекула нуклеиновой кислоты и/или вторая молекула нуклеиновой кислоты" означает либо первую молекулу нуклеиновой кислоты, либо вторую молекулу нуклеиновой кислоты, либо обе, первую и вторую, молекулы нуклеиновой кислоты.

Термин "примерно" или "приблизительно", как используют здесь, означает значение в пределах 5%, предпочтительно в пределах 4% и более предпочтительно в пределах 2% от данного значения или интервала.

Как используют здесь, при использовании для определения продуктов, композиций и способов, термин "содержащий" предназначен для обозначения того, что эти продукты, композиции и способы включают компоненты или стадии, на которые ссылаются, но не исключают другие. "Состоящий по существу из" означает включение других компонентов или стадий любой существенной значимости. Таким образом, композиция, состоящая по существу из перечисленных компонентов, не должна исключать следовые примеси и фармацевтически приемлемые носители. "Состоящий из" означает исключение более чем следовых элементов других компонентов или стадий. Например, полипептид "состоит из" аминокислотной последовательности, когда этот полипептид не содержит никаких аминокислот, кроме перечисленной аминокислотной последовательности. Полипептид "состоит по существу из" аминокислотной последовательности, когда такая аминокислотная последовательность присутствует вместе только с небольшим количеством дополнительных аминокислотных остатков, типично от примерно 1 до примерно 50 или около того, дополнительных остатков. Полипептид "содержит" аминокислотную последовательность, когда эта аминокислотная последовательность составляет по меньшей мере часть конечной аминокислотной последовательности полипептида. Такой полипептид может иметь от нескольких до нескольких сотен дополнительных аминокислотных остатков. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут среди прочего играть роль в транспортировке полипептида, способствовать продуцированию или очистке полипептида; продлевать время полужизни. То же может быть применимо к нуклеотидным последовательностям.

Как используют здесь, "вектор" может представлять собой любой агент, способный к доставке и экспрессии по меньшей мере первой и второй молекул нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине или субъекте-хозяине. Вектор может быть экстрахромосомным (например, эписомным) или интегративным (для включения в хромосомы хозяина), автономно или неавтономно реплицирующимся, многокопийным или низкокопийным, двунитевым или однонитевым, незащищенным или в комплексе с другими молекулами (например, векторы в комплексе с липидами или полимерами с образованием структур в виде частиц, таких как липосомы, липоплексы или наночастицы, векторы, упакованные в вирусный капсид, и векторы, иммобилизованные на твердофазных частицах, и т.д.). Определение термина "вектор" также охватывает векторы, которые модифицированы таким образом, что дают возможность предпочтительной направленности в конкретную клетку-хозяина. Характерным признаком направленных векторов является присутствие на их поверхности лиганда, способного распознавать и связывать клеточный и экспонированный на поверхности компонент, такой как маркер, специфичный для клетки (например, HPV-инфицированной клетки), тканеспецифичный маркер или опухолеспецифичный маркер. Лиганд может быть генетическим путем встроен в полипептид, присутствующий на поверхности вектора (например, аденовирусный файбер-протеин, пентон, pIX, как описано в WO 94/10323 и WO 02/96939 или продукт гена р14 вируса осповакцины, как описано в ЕР 1146125).

В контексте настоящего изобретения термины "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид" и "нуклеотидная последовательность" используют взаимозаменяемо и определяют полимер любой длины либо из полидезоксирибонуклеотидных (ДНК), либо полирибонуклеотидных (РНК) молекул, либо любой их комбинации. Это определение охватывает одно- или двунитевые, линейные или кольцевые, природные или синтетические полинуклеотиды. Кроме того, такие полинуклеотиды могут содержать не встречающиеся в природе нуклеотиды (например, метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги, такие как описаны в US 5525711, US 4711955 или ЕРА 302175), а также химические модификации (например, см. WO 92/03568; US 5118672) с целью повышения стабильности нуклеиновой кислоты in vivo, усиления ее доставки или снижения скорости клиренса из субъекта-хозяина. Если они присутствуют, модификации могут быть приданы до или после полимеризации.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют здесь взаимозаменяемо для отнесения к полимерам из аминокислотных остатков, которые содержат 9 или более аминокислотных остатков, связанных посредством пептидных связей. Этот полимер может быть линейным, разветвленным или циклическим. В контексте данного изобретения "полипептид" может включать аминокислоты, которые представляют собой L стереоизомеры (природную форму) или D стереоизомеры, и могут включать аминокислоты, иные чем 20 распространенных в природе аминокислот, такие как [бета]-аланин, орнитин или метионина сульфоксид, или аминокислоты, модифицированные на одной или более чем одной альфа-аминогруппе, альфа-карбоксильной группе или боковой цепи, например, путем прибавления метила, формила, ацетила, гликозила, фосфорила и тому подобного. В качестве общего указания, если аминокислотный полимер является длинным (например, более чем 50 аминокислотных остатков), на него предпочтительно ссылаются как на полипептид или белок. Как следствие, "пептид" относится к фрагменту из аминокислот в количестве от примерно 9 до примерно 50 аминокислот в длину. В контексте изобретения пептид предпочтительно включает выбранную область природного (или нативного) белка, например его иммуногенный фрагмент, содержащий эпитоп.

Термин "полипептид", как определено здесь, охватывает как нативные, так и модифицированные полипептиды. Термин "нативный", как используют здесь, относится к материалу, выделенному из источника в природе, в отличие от материала, искусственно модифицированного или измененного человеком в лаборатории. Например, нативный полипептид кодируется геном, который присутствует в геноме организма или клетки дикого типа. Напротив, модифицированный полипептид кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая модифицирована в лаборатории таким образом, чтобы отличаться от нативного полипептида, например, путем инсерции, делеции или замены одной или более чем одной аминокислоты или любой комбинации этих возможностей. Когда рассматривают несколько модификаций, они могут касаться последовательных остатков и/или не последовательных остатков. Примеры модификаций, рассматриваемые настоящим изобретением, могут приводить в результате к изменениям биологической активности, проявляемой нативным полипептидом. Аминокислоты, которые являются критическими для данной биологической активности, можно идентифицировать рутинными способами, такими как структурный и функциональный анализ, и специалист в данной области техники может легко определить тип мутации(й), который способен снизить или прекратить такую биологическую активность. Такие модификации можно осуществить с помощью рутинных методик, таких как сайт-направленный мутагенез. Альтернативно можно получить синтетическую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую модифицированный полипептид, путем химического синтеза в автоматизированном процессе (например, сборки из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, как описано в прилагаемом разделе примеров).

Термин "полученный", как используют здесь, относится к материалу, который обнаружен, выделен, очищен или имеет происхождение из источника в природе. "Выделенный" означает извлеченный из его природной окружающей среды. "Очищенный" означает, что он по существу свободен по меньшей мере от одного другого компонента, с которым он естественно связан. "Имеет происхождение" означает одну или более чем одну модификацию по сравнению с нативным материалом (в частности, мутации, такие как замены, делеции и/или инсерции). Методики выделения, очистки и модификации являются рутинными в данной области техники и зависят от материала, который нужно получить (например, клонирование молекулы нуклеиновой кислоты можно осуществить из источника в природе путем использования фермента рестрикции, с помощью ПЦР или путем химического синтеза).

Как используют здесь, термин "гомология" обычно выражен в виде процента и означает нуклеотидные последовательности, которые сохраняют данную степень идентичности друг с другом на протяжении участка по меньшей мере из 40 последовательных нуклеотидов (например, примерно 40, 45, 50, 55, 57, 58, 59, 60, 70 или даже большего числа последовательных нуклеотидов). "По меньшей мере 80%" относится приблизительно к 80% или более чем 80% (например, к любому значению после 80%, преимущественно по меньшей мере 85%, желательно по меньшей мере 87%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 97% вплоть до 100% гомологии последовательности). "Менее чем 75%" относится к любому значению ниже 75, например, приблизительно 74, 72, 70, 68, 65, 62, 60% или даже менее. Процент гомологии между двумя нуклеотидными последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей, учитывая число гэпов, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания, и длину каждого гэпа. В данной области техники доступны различные компьютерные программы и математические алгоритмы для определения процента идентичности между нуклеотидными последовательностями, такие как пакет программ GCG Wisconsin и программа Basic Local alignment Search Tool (BLAST), которая публично доступна в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и описана в печатных изданиях (например, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410).

В качестве исходной точки выравнивание последовательности между первой и второй молекулами нуклеиновой кислоты перед модификацией можно использовать с целью выявления одного или более чем одного участка из 40 или большего числа непрерывных нуклеотидов, которые имеют процент гомологии 80% или выше чем 80%, то есть "гомологичного" участка(ов). В конкретном воплощении паттерн использования кодона первой молекулы нуклеиновой кислоты, либо второй молекулы нуклеиновой кислоты, либо обеих, первой и второй, молекул нуклеиновой кислоты модифицируют (например, за счет тенденции к вырождению паттерна использования кодона) по меньшей мере в указанном участке(ах) из 40 или большего числа (например, приблизительно 40, 45, 50, 55, 57, 58, 59, 60, 70 или даже более) непрерывных нуклеотидов, так чтобы снизить процент гомологии до значения менее чем 75% (например, приблизительно 74, 72, 70, 68, 65, 62, 60% или даже менее).

Если каждый из остатков метионина и триптофана кодируется уникальным триплетом нуклеиновой кислоты (то есть кодоном), то для кодирования других 18 аминокислот могут быть использованы различные кодоны (вырожденность генетического кода). Например, аминокислоты кодируются кодонами, как описано ниже: аланин (Ala или А) кодируется кодонами GCA, GCC, GCG и GCU; цистеин (С или Cys) кодонами UGC и UGU; аспарагиновая кислота (D или Asp) кодонами GAC и GAU; глутаминовая кислота (Е или Glu) кодонами GAA и GAG; фенилаланин (F или Phe) кодонами UUC и UUU; глицин (G или Gly) кодонами GGA, GGC, GGG и GGU; гистидин (Н или His) кодонами САС и CAU; изолейцин (I или Ile) кодонами AUA, AUC и AUU; лизин (K или Lys) кодонами ААА и AAG; лейцин (L или Leu) кодонами UUA, UUG, CUA, CUC, CUG и CUU; метионин (М или Met) кодоном AUG; аспарагин (N или Asn) кодонами ААС и AAU; пролин (Р или Pro) кодонами ССА, ССС, CCG и CCU; глутамин (Q или Gln) кодонами САА и CAG; аргинин (R или Arg) кодонами AGA, AGG, CGA, CGC, CGG и CGU; серин (S или Ser) кодонами AGC, AGU, UCA, UCC, UCG и UCU; треонин (Т или Thr) кодонами АСА, АСС, ACG и ACU; валин (V или Val) кодонами GUA, GUC, GUG и GUU; триптофан (W или Trp) кодоном UGG и тирозин (Y или Tyr) кодонами UAC и UAU.

Снижение процента гомологии в одном или более чем одном гомологичном участке, присутствующем в указанных первой и второй молекулах нуклеиновой кислоты, может быть достигнуто путем использования преимущества вырожденности генетического кода и модификации паттерна использования кодона в первой молекуле нуклеиновой кислоты и/или во второй молекуле нуклеиновой кислоты. Модификацию паттерна использования кодона обычно проводят путем замены одного или более чем одного "нативного" кодона другим кодоном(ами). Например, замена Arg-кодирующего кодона AGA Arg-кодирующим кодоном CGC снизит гомологию в 2 из 3 положений этого кодона. Нет необходимости в вырожденности всех нативных кодонов, поскольку гомология может быть значительно снижена при частичной замене. Кроме того, модификацию паттерна использования кодона можно осуществить на протяжении всей молекулы нуклеиновой кислоты, либо можно ограничить гомологичным участком(ами), присутствующими до модификации. Желательно в контексте изобретения вырожденность осуществляют в первой молекуле нуклеиновой кислоты и ограничивают гомологичным участком(ами). Предпочтительно паттерн использования кодона модифицируют на нуклеотидном уровне, и модификации являются молчащими на аминокислотном уровне, то есть, когда это возможно, каждый "нативный" кодон заменяют кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, так что такие модификации не транслируются в кодируемом полипептиде. Более предпочтительно, когда это возможно, паттерн использования кодона модифицируют таким путем, что гомологичные участки между первой и второй молекулами нуклеиновой кислоты ограничены до числа последовательных нуклеотидов менее 9 или 8, преимущественно до числа последовательных нуклеотидов менее 7, предпочтительно до числа последовательных нуклеотидов менее 6 и более предпочтительно до числа последовательных нуклеотидов менее 5. Модификацию паттерна использования кодона можно создать с помощью ряда путей, известных специалистам в данной области техники, таких как сайт-направленный мутагенез (например, используя систему мутагенеза in vitro Sculptor™ производства Amersham, Les Ullis, France), ПЦР мутагенез, перестановка в ДНК, а также с помощью методик химического синтеза (результатом которых, например, является синтетическая молекула нуклеиновой кислоты).

Когда вектор согласно изобретению содержит более чем две молекулы нуклеиновой кислоты, тогда любую молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в векторе и полученную из нативной нуклеиново-кислотной последовательности, которая проявляет процент гомологии приблизительно 80% или выше чем 80% на протяжении участка из 40 или большего числа непрерывных нуклеотидов по меньшей мере с одной другой нативной нуклеиново-кислотной последовательностью, из которой получена другая молекула нуклеиновой кислоты, можно модифицировать таким образом, чтобы снизить процент гомологии до значения менее чем 75%, таким образом, чтобы ни одна пара молекул нуклеиновой кислоты, содержащихся в векторе, не могла содержать участок из 40 или большего числа последовательных нуклеотидов, проявляющих процент идентичности выше, чем 75%.

Выравнивание последовательности между каждой парой нативных последовательностей, из которых получены молекулы нуклеиновой кислоты, можно использовать с целью выявления одного или более чем одного участка, проявляющего процент гомологии 80% или выше чем 80%. Затем последовательность одной или более чем одной из нативных последовательностей модифицируют, в частности путем вырождения использования кодона, таким образом, чтобы снизить процент гомологии, по меньшей мере в гомологичных участках, до значения менее чем 75%. В конечном счете, ни одна молекула нуклеиновой кислоты, содержащаяся в векторе, не должна содержать участок из 40 или большего числа (например, 45, 50, 55, 57, 58, 59, 60, 70 или даже более) последовательных нуклеотидов, проявляющий процент идентичности выше, чем 75%, с любой другой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащейся в указанном векторе.

Как упомянуто выше, полипептид, кодируемый молекулами нуклеиновой кислоты, содержащимися в векторе, может иметь или не иметь такую же аминокислотную последовательность, как нативный полипептид. В частности, в дополнение к мутациям для вырождения использования кодона, таким образом, чтобы снизить гомологию, по меньшей мере в гомологичных участках молекул нуклеиновой кислоты, содержащихся в векторе, указанные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащиеся в векторе, могут также включать дополнительные мутации, приводящие или не приводящие в результате к модификации аминокислотной последовательности кодируемого полипептида.

Вектор по изобретению охватывает как вирусные, так и невирусные (например, плазмидные ДНК) векторы. Подходящие невирусные векторы включают плазмиды, такие как pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAX и pgWiz (Gene Therapy System Inc.; Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76, 12735-12746). "Вирусный вектор" используют здесь в соответствии с его значением, принятым в данной области техники. Он относится к любому вектору, который содержит по меньшей мере один элемент вирусного происхождения, включая полноразмерный вирусный геном, его участок или модифицированный вирусный геном, как описано ниже, а также вирусные частицы, образованные им (например, вирусный вектор, упакованный в вирусный капсид с образованием инфекционных вирусных частиц). Вирусные векторы по изобретению могут быть репликационно-компетентными, либо могут быть генетически повреждены таким образом, что являются репликационно-дефектными или иметь нарушенную репликацию. Термин "репликационно-компетентный", как используют здесь, охватывает репликационно-селективные и условно-репликационные вирусные векторы, которые сконструированы генно-инженерным путем таким образом, чтобы лучше или селективно реплицироваться в специфичных клетках-хозяевах (например, в опухолевых клетках). Вирусные векторы могут быть получены из ряда различных вирусов, и особенно из вируса, выбранного из группы, состоящей из ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса (AAV), поксвируса, вируса герпеса, вируса кори и пенистого вируса.

В одном воплощении вектор по изобретению представляет собой аденовирусный вектор (обзор см. в "Adenoviral vectors for gene therapy", 2002, Ed D. Curiel and J. Douglas, Academic Press). Он может иметь происхождение от любого аденовируса человека и животных. Любой серотип или подгруппу можно использовать в контексте изобретения. Можно более конкретно указать подгруппу А (например, серотипы 12, 18 и 31), подгруппу В (например, серотипы 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34 и 35), подгруппу С (например, серотипы 1, 2, 5 и 6), подгруппу D (например, серотипы 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39 и 42-47), подгруппу Е (серотип 4) и подгруппу F (серотипы 40 и 41). Особенно предпочтительными являются человеческие аденовирусы 2 (Ad2), 5 (Ad5), 6 (Ad6), 11 (Ad11), 24 (Ad24) и 35 (Ad35). Такой аденовирус доступен из Американской коллекции типовых клеточных культур (АТСС, Rockville, Md.) и является предметом различных публикаций, в которых описаны его последовательность, организация и способы продуцирования, что дает возможность специалистам в данной области техники использовать его (см., например, US 6133028; US 6110735; WO 02/40665; WO 00/50573; EP 1016711; Vogels et al., 2003, J. Virol. 77, 8263-8271).

Аденовирусный вектор по настоящему изобретению может быть репликационно-компетентным. Различные примеры репликационно-компетентных аденовирусных векторов легко доступны специалистам в данной области техники (см., например, Hernandez-Alcoceba et al., 2000, Human Gene Ther. 11, 2009-2024; Nemunaitis et al., 2001, Gene Ther. 8, 746-759; Alemany et al., 2000, Nature Biotechnology 18, 723-727; WO 00/24408; US 5,998,205, WO 99/25860, US 5698443, WO 00/46355, WO 00/15820 и WO 01/36650).

Альтернативно аденовирусный вектор по изобретению может быть репликационно-дефектным (дефектным по репликации) (см., например, WO 94/28152). Предпочтительными репликационно-дефектными аденовирусными векторами являются E1-дефектный (например, US 6136594 и US 6013638) с делецией Е1, продолжающейся приблизительно от положений 459-3328 или приблизительно от положений 459-3510 (со ссылкой на последовательность человеческого аденовируса типа 5, раскрытую в GeneBank под номером по каталогу М 73260 и в Chroboczek et al., 1992, Virol. 186, 280-285). Клонирующую емкость и безопасность можно дополнительно улучшить путем делетирования дополнительного участка(ов) аденовирусного генома (например, в заменимой области Е3 или в других незаменимых областях Е2, Е4, как описано в Lusky et al., 1998, J. Virol 72, 2022-2032).

Первая и вторая молекулы нуклеиновой кислоты могут быть независимо встроены в любой локализации аденовирусного вектора по изобретению, как описано в Chartier et al. (1996, J. Virol. 70, 4805-4810), и независимо расположены в смысловой и/или антисмысловой ориентации относительно естественного направления транскрипции области вставки. Например, обе они могут быть встроены при замещении области Е1 или альтернативно одну встраивают при замещении области Е1, а другую при замещении области Е3.

В другом воплощении вектор по изобретению представляет собой поксвирусный вектор (см., например, Сох et al. in "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. М. Hos, Carolina Academic Press). Он может быть получен из любого члена семейства Poxviridae, в частности птичий вирус (например, ALVAC, как описано в WO 95/27780), вирус оспы кур (например, TROVAC, как описано в Paoletti et al., 1995, Dev. Biol. Stand. 84, 159-163) или вирус осповакцины, где последний предпочтителен. Пригодный вирус осповакцины может быть выбран из группы, состоящей из копенгагенского штамма (Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 и 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381-401), штамма Уайетт, NYVAC (см. WO 92/15672 и Tartaglia et al., 1992, Virology 188, 217-232) и высоко аттенуированного модифицированного штамма Анкара (MVA) (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16). Такие векторы и способы получения описаны в различных документах, доступных специалистам в данной области техники (например, Paul et al., 2002, Cancer gene Ther. 9, 470-477; Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4769330; US 4772848; US 4603112; US 5100587 и US 5179993). Первая и вторая молекулы нуклеиновой кислоты, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно встроены в несущественный локус поксвирусного генома с той целью, чтобы рекомбинантный поксвирус оставался жизнеспособным и инфекционным. Несущественные области представляют собой некодирующие межгенные области или любой ген, для которого инактивация и делеция значительно не нарушают рост, репликацию или инфекцию вируса. Можно также рассматривать вставку в незаменимый вирусный локус при условии, что дефектная функция обеспечивается in trans в процессе продуцирования вирусных частиц, например, путем использования хелперной клеточной линии, несущей комплементирующие последовательности, соответствующие делегированным в поксвирусном геноме.

При использовании копенгагенского вируса осповакцины по меньшей мере первую и вторую молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно встраивают в ген тимидинкиназы (tk) (Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530-537). Однако другие сайты инсерции также пригодны, например ген гемагглютинина (Guo et al., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), в локус K1L в гене u (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190) или при левом конце генома вируса осповакцины, где в литературе описано разнообразие спонтанных или сконструированных генно-инженерным путем делеций (Altenburger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss et al. 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et al., 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus et al, 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al., 1991, Virol. 180, 406-410).

При использовании MVA по меньшей мере первую и вторую молекулы нуклеиновой кислоты можно независимо встраивать в любую из идентифицированных делеций I-VII, которые имеют место в геноме MVA (Antoine et al., 1998, Virology 244, 365-396), а также в локусе в D4R, но предпочтительна инсерция в делецию II и/или III (Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutler et al., 1994, Vaccine 12, 1032-1040).

При использовании вируса оспы кур, хотя можно рассматривать инсерцию в ген тимидинкиназы, по меньшей мере первую и вторую молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно встраивают в межгенную область, расположенную между ОРС 7 и 9 (см., например, ЕР 314569 и US 5180675).

В другом воплощении изобретения по меньшей мере первая и вторая молекулы нуклеиновой кислоты независимо кодируют полипептид, способный к обеспечению терапевтической или защитной активности у субъекта, проявляющего патологическое состояние или склонного к нему. Термин "субъект", как используют здесь, относится к позвоночному, в частности к члену видов млекопитающих и особенно домашних животных, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и приматов, включая людей. Такой полипептид предпочтительно выбран из группы, состоящей из иммуногенных полипептидов и противоопухолевых полипептидов.

"Иммуногенный" полипептид относится к полипептиду, способному к индукции, стимуляции, развитию или усилению иммунной системы у субъекта, в котором он экспрессируется. Такой иммунный ответ может быть либо гуморальным, либо клеточным, либо и гуморальным, и клеточным. Гуморальный ответ вызывает продуцирование антител против обсуждаемого полипептида, тогда как клеточный ответ вызывает ответ Т-хелперных клеток и/или CTL, и/или стимуляцию продуцирования цитокинов. Типично иммуногенное свойство полипептида можно оценить либо in vitro, либо in vivo с помощью ряда анализов, которые являются стандартными в данной области техники (общее описание методик, доступных для оценки возникновения и активации иммунного ответа, см., например, в последнем издании Coligan et al., Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health). Например, обнаружение может быть колориметрическим, флуорометрическим или радиоактивным, и пригодные методики включают ЭЛАЙЗА, Вестерн-блоттинг, радиоиммунологические анализы и анализы иммунопреципитации. Измерение клеточного иммунитета можно осуществить путем измерения профилей цитокинов, секретируемых активированными эффекторными клетками, включая клетки, имеющие происхождение от CD4+ и CD8+ Т-клеток (например, количественного определения клеток, продуцирующих ИФНg, с помощью ELIspot), путем определения статуса активации иммунных эффекторных клеток (например, анализы пролиферации Т-клеток на основании классического анализа захвата [³H]тимидина), путем анализа на антиген-специфичные Т-лимфоциты у сенсибилизированного субъекта (например, пептид-специфичного лизиса в анализе цитотоксичности). Иммуногенное свойство полипептида можно также оценить в подходящих животных моделях с помощью ELIspot, аналитических методик, основанных на тетрамерах, или других стандартных методик анализа Т-клеточно-опосредованного иммунитета. Пригодные иммуногенные полипептиды могут быть получены из вируса гепатита В (HBV) (например, S, preS2 или preS1-полипептид, как описано в ЕР 414374; ЕР 304578 или ЕР 198474); вируса гепатита С (HCV) (например, Core (С), гликопротеин оболочки Е1, Е2, неструктурный полипептид NS2, NS3, NS4 или NS5 или любая их комбинация); вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) (например, gp120 или gp160) и папилломавируса (как проиллюстрировано здесь ниже).

"Противоопухолевый" полипептид относится к полипептиду, способному обеспечить супрессию или абсолютное сокращение распространения опухолевых клеток. Противоопухолевое свойство полипептида можно определить в соответствующих животных моделях или у субъекта, подлежащего лечению, на основании снижения действительного размера опухоли за период времени. Ряд способов можно использовать для оценки размера опухоли, включая радиологические способы (например, однофотонную и позитронную эмиссионную компьютерную томографию; см. в общем "Nuclear Medicine in Clinical Oncology", Winkler, C. (ed.), Springer-Verlag, New York, 1986), способы, в которых используют общепринятые реагенты визуализации (например, галлия-67 цитрат), иммунологические способы (например, радиоактивно меченное моноклональное антитело, направленное на специфичные опухолевые маркеры), а также ультразвуковые способы исследования (см. "Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff and Fukuda (eds.), Igaku-Shoin, New York, 1984). Альтернативно противоопухолевое свойство полипептида можно определить на основании снижения присутствия опухолевого маркера. Примеры включают ПСА (простатоспецифический антиген) для обнаружения рака простаты и РЭА (раковоэмбриональный антиген) для обнаружения рака прямой и ободочной кишки и некоторых раков молочной железы. Кроме того, противоопухолевое свойство полипептида можно определить в подходящей животной модели, например, используя мышь, которой инъецировали репрезентативную клеточную линию рака человека. После развития пальпируемых опухолей мышам инъецируют вектор по изобретению, а затем проводят мониторинг сниженной скорости опухолевого роста и повышенной