Желатин-трансглутаминазные кровоостанавливающие повязки и изолирующие средства

Желатин-трансглутаминазные кровоостанавливающие повязки и изолирующие средства

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к кровоостанавливающим повязкам, средствам и агентам, которые содержат рассасывающиеся или нерассасывающиеся вещества и/или коагуляционные белки. Кровоостанавливающие средства являются полезными для лечения раненой ткани.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Контроль кровоизлияния (кровотечения) является критическим этапом при первой помощи и в полевой травматологической службе. К сожалению, не является редкостью возникновение избыточного кровотечения или летального кровоизлияния из открытого места (J.M.Rocko et al.). (1982). J. Trauma 22:635). Данные о смертности в ходе вьетнамской войны свидетельствуют, что 10% боевых потерь имели место вследствие неконтролируемой кровопотери из конечностей. Вплоть до одной трети смертей от потери крови во время вьетнамской войны можно было бы предупредить путем использования эффективных способов регулирования кровотечения в полевых условиях (SAS/STAT Users Guide, 4th ed. (Gary, N.C.: SAS Institute Inc; 1990)).

Хотя статистика смертности от бытовых ран не предоставляет точные цифры догоспитальных смертей от кровотечений из конечностей, судебные отчеты и несистематическая информация указывают на аналогичную частоту (J.M.Rocko et аl.). (1982). J. Trauma 22:635). Эти данные позволяют предположить, что существенное увеличение выживания может быть достигнуто при догоспитальном использовании простого и эффективного способа контроля кровоизлияния. К сожалению, такой способ не был успешно продемонстрирован при использовании имеющихся в продаже кровоостанавливающих средств.

Особо, хирургическое закрытие раны достигается в настоящее время с помощью швов и скобок, которые облегчают заживление посредством стягивания тканей вместе. Однако очень часто они не обеспечивают достаточного изолирования, необходимого для предотвращения истечения жидкости. Таким образом, существует огромная, неудовлетворенная медицинская потребность в средствах и способах для предотвращения истечения после операции, включая подтекания, которые часто происходят вдоль скобки и линии шва. Такие средства и методы нужны в качестве дополнения к швам или скобкам для остановки кровотечения или остановки истечения других жидкостей при реконструкциях периферических сосудов, реконструкциях твердой мозговой оболочки, при торакальных, сердечно-сосудистых, легочных, неврологических и желудочно-кишечных хирургических операциях.

В настоящее время большинство из имеющихся в продаже средств, останавливающих кровотечение высокого давления, являются номинально, если вообще являются, адгезивными. Хорошими примерами таких средств являются повязка QuikClot® ACS™ (Z-Medica, Wallington, CT) и HemCon™ (HemCon, Portland, OR), два кровоостанавливающих средства, которые в настоящее время поставляют членам вооруженных сил США. Кристаллы минерала цеолита в губке QuikClot вызывают адсорбцию молекул воды в крови, таким образом концентрируя факторы свертываемости крови и ускоряя свертывание крови. Смесь хитозана, которая составляет бандаж HemCon, имеет положительный заряд и притягивает эритроциты, которые имеют отрицательный заряд. Эритроциты втягиваются в повязку, образуя уплотнение поверх раны и стабилизируя раневую поверхность.

Бандажный продукт HemCon, указанный выше, был разработан в попытке предложить догоспитальный контроль кровоизлияния, и он уже продемонстрировал ограниченный успех в полевых условиях. Однако хитозановая матрица, которая образует бандаж HemCon, может насыщаться кровью и быстро выходит из строя при столкновении с активным потоком крови или через 1-2 часа при столкновении с умеренным потоком крови из раны (B.S.Kheirabadi et al. (2005). J. Trauma. 59:25-35; A.E.Pusateri et al. (2006). J. Trauma 60:674-682). Кроме того, бандажный пластырь HemCon доступен только в виде жесткого пластыря, который нельзя легко подогнать к неровным ранам, что дополнительно ограничивает его применение.

Другими кровоостанавливающими средствами на основе полисахаридов, которые были предложены для использования в контроле кровоизлияния, является RDH™ (ацетилглюкозамин), TraumaDEX™ (МРН (микропористые полисахаридные гемосферы)), и Chitoskin™ (хитозан и желатин). Однако ни один из этих типов повязок не был способен постоянно демонстрировать отсутствие недостатков при значительном потоке крови. Другие внедренные в последнее время кровоостанавливающие средства включают Celox™ (кристаллы хитозана) и WoundStat™ (TraumaCure Inc., MD) (гранульная смесь минерала смектита и суперпоглощающего полимера). Однако оба эти продукта быстро разбухают с заполнением раневых участков, что делает их подходящими только для ускорения свертывания крови в отдельных типах ран, и представляющими опасность ослабления или даже остановки течения крови в близлежащих кровеносных сосудах.

QuikClot ACS™, также упоминаемый выше, также показал эффективность в остановке кровоизлияний умеренной степени. Однако механизм адсорбции воды минералом цеолитом не может быть осуществлен без высвобождения большого количества тепла. По этой причине применение QuikClot ACS™ ведет к высоким температурам и тяжелым ожогам на пораженном участке, что повреждает участки окружающих тканей и значительно усложняет дальнейшее лечение (А.Е.Pusateri et al. (2006). J. Trauma. 60:674-682). Очевидно, более идеальным является кровоостанавливающий раствор без такого существенного побочного эффекта. Хотя QuikClot разработал минеральную смесь, которая высвобождает меньше тепла при применении, эффективность более холодной смеси является недостаточной для помощи при серьезной травме. Кроме того, ни исходная, ни более холодная минеральная смесь не могли остановить активное артериальное кровотечение.

Все вышеуказанные изделия основаны на каскаде естественного свертывания для контроля истечения жидкости из раненого участка. По этой причине они все полезны только для остановки потока крови, и каждое - только в условиях, подходящих для данного конкретного средства. Общая изоляция раневого участка, в частности поврежденных участков с истечением жидкостей, отличных от крови, выходит за пределы возможностей этих продуктов.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует потребность и было бы полезно иметь нетоксичное адгезивное вещество, которое можно было бы применять для широкого ряда применений, включая, без ограничения ими, хирургические применения, контроль за кровоизлиянием и контроль за кровотечением из раны. Также существует потребность и было бы полезно иметь нетоксичное адгезивное вещество, которое можно было бы использовать в качестве части кровоостанавливающего бандажа. Также существует потребность и было бы полезно иметь нетоксичное адгезивное вещество, которое было бы полезно в качестве хирургического изолирующего средства.

Настоящее изобретение преодолевает недостатки предшествующего уровня техники, предлагая адгезивный материал, который содержит сшиваемый белок и нетоксичное вещество, индуцирующее сшивание сшиваемого белка. Предпочтительно сшиваемый белок включает желатин и любой вариант желатина или вариантный белок, как описано в данном описании изобретения. Возможно и предпочтительно нетоксичное вещество включает трансглутаминазу (TG), которая возможно может содержать микробную трансглутаминазу (mTG). Согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения адгезивное вещество предложено в виде бандажа, который предпочтительно адаптирован для использования в качестве кровоостанавливающего бандажа. Согласно другим воплощениям предлагается изолирующее средство, которое предпочтительно адаптировано для использования в качестве хирургического изолирующего средства.

При воздействии трансглутаминазы желатин, представляющий собой денатурированную форму белкового коллагена, быстро сшивается с образованием колеблющегося геля. Процесс гелеобразования, который имеет место, чрезвычайно похож на позднюю стадию каскада естественного свертывания, которое претерпевает фибрин при вступлении в контакт с фактором XIII и кальцием. Кроме того, полученный гель демонстрирует адгезивную способность, очень похожую, если не выше, чем у фибриновых клеев (M.K.McDermott, Biomacromolecules. 2004 Jul-Aug; 5(4): 1270-9).

В настоящем изобретении используются аналогии сшивания желатин-TG с каскадом свертывания фибрина для имитации превосходных кровоостанавливающих характеристик улучшенного фибринового средства. Замена фибрин-тромбинового сэндвича фибринового бандажа сэндвичем желатин-TG приводит к созданию новой, недорогой и стабильной повязки, которая может контролировать кровоизлияние без существенных побочных эффектов. Такой новый бандаж максимально увеличивает адгезивные свойства смеси желатин-TG, допуская контролируемое прикладывание большого количества смеси к раневому участку способом, который предупреждает распространение TG на области, не контактирующие с бандажом. По этой причине такая синергическая технология является достижением как в области улучшенных фибриновых повязок, так и в области адгезии желатина-TG.

В отличие от матрицы из свернувшегося фибрина дополнительным преимуществом матрицы из желатина-TG является то, что она может быть растворена специально, с использованием специфической протеазы, то есть иначе не является физиологически реакционно-способной (T.Chen, Biomacromolecules. 2003 Nov-Dec; 4(6): 1558-63). Таким образом, наряду с тем, что желатин-mTG кровоостанавливающая сэндвич-повязка может копировать действие фибрин-тромбиновой кровоостанавливающей сэндвич-повязки, она может быть удалена по мере необходимости без осложнения.

Кроме его применения в травматологии в качестве кровоостанавливающего средства для полевых условий, настоящее изобретение кровоостанавливающего средства на основе желатина-TG является очень перспективным в контролировании активного артериального кровотечения во время хирургической операции, кровотечения после эндоваскулярной катеризации, или истечения других физиологических жидкостей после травм или хирургической операции.

К настоящему времени, хотя гелеобразующие свойства сшитого желатина-TG и адгезивная способность сшивки желатин-TG были по отдельности изучены, не было предпринято попыток использовать обе характеристики вместе для получения кровоостанавливающего или тканевого изолирующего средства.

Адгезивное применение соединения желатин-TG было продемонстрировано in vivo на модели сетчатки крысы, где каплю смеси желатин-TG использовали для фиксации сетчатки (T.Chen, J Biomed Mater Res В Appl Biomater. 2006 Мау; 77(2):416-22).

Также исследовалось применение геля желатин-TG в качестве каркаса для клеточной терапии (патент US 5834232. Also Ito A, J Biosci & Bioeng. 2003; 95(2): 196-99. Also, Broderick EP, J Biomed Mater Res В Аррl Biomater. 2005 Jan 15; 72(I):37-42).

Хотя данные исследования подчеркивали безопасность физиологического применения смеси желатин-TG, каждое из них использовало только одну из характеристик сшивки желатин-TG, и не сообщалось о достижении или не предполагалось достижения остановки кровотечения и изоляции ткани, представленных в настоящем изобретении.

Использование смеси желатин-TG для остановки кровотечения или истечения жидкости также является показателем значительного достижения по сравнению с рядом документально подтвержденных попыток использовать трансглутаминазы, в частности тканевую TG, независимо в качестве хирургических адгезивов (среди прочего патент US 5736132, патент US 61908196). Использование желатина в качестве субстрата для TG добавляет механический каркас к активности TG, что обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с использованием одной TG. TG, взятую вместе с желатином, можно применять более точно, чем одну TG, можно приспособить точно к области раны, и обеспечить регулируемую биоабсорбируемость.

Настоящее изобретение преодолевает недостатки предшествующего уровня техники. В растворах из предыдущих попыток использовали многие формы модифицированных и немодифицированных желатиновых матриц для остановки кровотечения в степени от легкой до умеренной. Однако способ образования, in situ, матрицы из прочно сшитого желатина, которая может контролировать активное артериальное кровоизлияние или другие значительные истечения физиологических жидкостей, отсутствовал. Способ, такой как сшивание желатин-TG, который может сформировать прочную желатиновую матрицу in vivo, увеличивает механическую прочность желатиновой матрицы и делает ее пригодной для регулирования артериального кровотечения высокого давления и других истечений физиологических жидкостей. Кроме улучшенного способа сшивания, настоящее изобретение включает много других инноваций, которые обеспечивают его преимуществами по сравнению с существующими кровоостанавливающими материалами на основе желатина. Неограничивающий, иллюстративный, неполный перечень представлен ниже:

1) In-situ сшивание цепей желатина и эндогенного коллагена тканевой ЕСМ (внеклеточной матрицы) создает прочный кровоостанавливающий барьер для жидкостей.

2) Желатин и TG могут более эффективно действовать на остановку кровотечения или остановку жидкости посредством применения в лиофилизированной форме и восстановленными с помощью крови или другой биологической жидкости.

3) Смесь желатин-TG в лиофилизированной форме имеет увеличенный срок годности.

4) Желатин и TG в многослойной, лиофилизированной форме обеспечивают более быстрое восстановление, что является полезным в среде потока жидкости с высоким давлением.

5) Добавление механической основы к основной смеси желатин-TG увеличивает кровоостанавливающую или регулирующую жидкость способность смеси, замедляя жидкости и обеспечивая большее время сшивания желатина-TG, и блокирует истечения жидкости.

Согласно некоторым предпочтительным воплощениям настоящего изобретения смесь желатин-mTG является частично сшитой перед прикладыванием к раневому участку или перед лиофилизацией. В другом воплощении не сшитый желатин или mTG присутствуют вместе с частично сшитым желатином-mTG.

Кровоостанавливающие бандажи, которые являются по природе адгезивными, известны в данной области техники, и пока еще имеют много осложнений и недостатков в применении. Например, широко распространенное кровоостанавливающее применение фибриногена и тромбина было обычным в последний год второй мировой войны, но было прекращено из-за передачи гепатита (D.B.Kendrick, Blood Program in WW II (Washington, DC: Office of the Surgeon General, Department of Army; 1989), 363-368).

Фибриногеновые повязки впервые использовались хирургами-травмотологамим во время первой мировой войны, когда Грей и его сотрудники изготовили предварительно полимеризованные фибриновые пластины и порошки. Во время второй мировой войны вооруженными силами США и Американским Красным Крестом был создан фибриновый клей с предварительно полимеризованными подобными стироформу пластинами фибрина и фибриновыми пленками. Повязки на основе фибрина продемонстрировали значительное различие во времени регулирования кровотечения и уменьшении кровопотери по сравнению с контролем (Jackson, М., et аl. (1996). J. of Surg. Res. 60:15-22; и Jackson, M., et al. (1997). Surg. Forum. XL. VIII:770-772).

Несмотря на эффективность фибриногеновых повязок в регулировании кровоизлияния, использование фибриногеновых повязок было прекращено, так как часто передавались заболевания, переносимые кровью и сывороткой, такие как гепатит и ВИЧ, поскольку средства содержали очищенный человеческий или животный фибриноген или другие очищенные продукты из крови (Holcomb, J.В., et аl. (1997). Surgical Clinics of North America. 77:943-952).

В последние несколько лет, однако, возобновился интерес к продуктам на основе фибрина для лечения ран, так как методы очистки плазмы значительно снижали риск заболеваний, переносимых кровью и сывороткой.

Красным Крестом США описана кровоостанавливающая сэндвич-повязка, которая содержит слой тромбина, помещенного между слоями фибриногена (смотри, например PCT/US99/10952, патенты US 6054122, 6762336). Такая кровоостанавливающая повязка продемонстрировала больший успех в лечении потенциально летальных травматических ран (E.M.Acheson. (2005). J. Trauma. 59(4):865-74; discussion 874-5; B.S.Kheirabadi. (2005). J. Trauma. 59(I):25-34; discussion 34-5; A.E.Pusateri. (2004). J. Biomed. Mater. Res. В Аррl. Biomater. 15; 70(1):114-21). Фактически в исследованиях на свиньях фибриновая сэндвич-повязка значительно превзошла продукты HemCon и QuikOot в лечении потенциально летальных травматических ран, демонстрируя коэффициент выживаемости >75% через 2 часа, против 0% выживаемости, когда использовали стандартный армейский полевой бандаж, бандаж HemCon или порошок QuikClot.

Хотя такие повязки можно использовать в способах лечения раненой ткани, такие обычные сэндвич-повязки могут расслаиваться, в результате чего кромки слоев повязки больше не прилипают друг к другу. Такое расслоение может приводить к пониженному взаимодействию слоев компонентов повязки, с уменьшением эффективности повязки в предупреждении кровоизлияния.

Была описана улучшенная кровоостанавливающая сэндвич-повязка на основе фибрина, которая содержит множество слоев, содержащих рассасывающиеся вещества и/или коагуляционные белки. Конкретно, повязка (смотри PCT/US03/28100, патентная заявка US 0060155234) содержит слой тромбина, расположенный между первым и вторым слоями фибриногена, где слой тромбина является не одинаковым по протяженности с первым и/или со вторым слоем фибриногена.

Несмотря на достижения в фибриновых раневых повязках, такие бандажи страдают многими недостатками. Лиофилизированный фибриноген, используемый для изготовления бандажа, должен быть очищен от плазмы человеческой крови. Так как это является дорогостоящим и тонким процессом, полученный фибриногеновый бандаж является исключительно дорогостоящим в получении и имеет очень короткий срок годности при комнатной температуре. Чем больше фибриногена добавляют к основе, тем лучше бандаж работает в отношении остановки кровотечения. Однако чем больше фибриногена добавлено к основе, тем более дорогостоящей является бандаж. Кроме того, большие количества фибриногена в основе бандажа могут способствовать ломкости бандажа, делая его ломким и неудобным в работе с ним. Как результат данных ограничений, в продаже отсутствует эффективный фибриновый бандаж.

Таким образом, хотя улучшенная фибриновая повязка могла регулировать кровоизлияние без существенных побочных эффектов и восполняет вышеуказанный недостаток в активной остановке крови травматологической службой, ограничения по стоимости и стабильности являются серьезными недостатками в использования этого типа повязки.

Жидкие фибриновые изолирующие средства или клеи использовали в течение многих лет в качестве операционного вспомогательного средства для контроля за кровоизлиянием (J.L.Garza et al.). (1990). J. Trauma. 30:512-513; H.B.Kram et al. (1990). J. Trauma. 30:97-101; M.G.Ochsner et al. (1990). J. Trauma. 30:884-887; T.L.Matthew et al. (1990). Ann. Thorac. Surg. 50:40-44; H.Jakob et al. (1984). J. Vase. Surg. 1:171-180). Кроме того, одиночные изолирующие средства из донорского фибрина также клинически широко использовали в различных хирургических ситуациях (W.D.Spotnitz. (1995). Thromb. Haemost. 74:482-485; R.Lerner et al.). (1990). J. Surg. Res. 48:165-181).

Хотя в настоящее время в хирургической области используют ряд абсорбируемых хирургических кровоостанавливающих средств, ни один из существующих продуктов не является достаточно прочным для обеспечения механической и биологической поддержки, необходимой для регулирования серьезного кровоизлияния или интенсивного течения других биологических жидкостей.

Существующие в настоящее время кровоостанавливающие бандажи, такие как коллагеновые раневые повязки (INSTAT™, Ethicon, Somerville, NJ, и AVITENE™, CR Bard, Murray Hill), NJ) или сухие фибрин-тромбиновые раневые повязки (TACHOCOMB™, Hafslund Nycomed Pharma, Linz, Austria) ограничены применением в хирургии, и являются недостаточно устойчивыми к растворению в интенсивном потоке крови. Они также не обладают достаточными адгезивными свойствами, чтобы служить какой-либо практической цели при остановке серьезного кровотечения. Эти существующие в настоящее время хирургические кровоостанавливающие бандажи также являются ломкими, и таким образом предрасположены к поломке, если они повреждены путем изгиба или нагрузки давлением. Они также подвержены растворению при кровотечении. Такое растворение и разрушение этих бандажей может быть катастрофическим, так как оно может вызывать потерю адгезии к ране и позволить кровотечению продолжаться без ослабления.

Артериальным кровотечением также нельзя управлять с помощью прикладывания впитывающих кровоостанавливающих средств из окисленной целлюлозы (SURGICEL, Ethicon, Somerville, NJ) или желатиновой губки (SURGIFOAM, Ethicon, Somerville, NJ). Эти продукты предназначены для регулирования кровотечения низкого давления из кости и эпидурального венозного выделения. Желатиновые губки не подходят для артериального кровотечения высокого давления, с активным потоком, так как они не образуют сильной связи с источником кровотечения и, таким образом, легко смещаются. Окисленная целлюлоза также не подходит для регулирования артериального кровотечения, так как она набухает и нуждается в удалении из места прикладывания, когда достигается остановка кровотечения. Если поток крови является слишком высоким, имеет место чрезмерное набухание перед тем, как может быть достигнута остановка кровотечения (M.Sabel et al. (2004). Eur. Spine J. 13(1):S97-101).

Наиболее широко используемые тканевые адгезивы обычно непригодны для использования в качестве кровоостанавливающих или останавливающих внутреннюю жидкость средств, по причинам, в основном относящимся к умеренной токсичности и невозможности легкого их получения и применения в полевых условиях. Хорошим примером этого является цианоакрилатное семейство местных кожных адгезивов, таких как Dermabond™, Indermil™, Liquiband™ и так далее. Характер быстрого цианоакрилатного активирования под воздействием воздуха делает изделия на основе цианоакрилата неподходящими для использования в активной кровеостанавливающей полевой повязке и их неспособность связываться с влажными поверхностями делает их неподходящими для использования в остановке внутреннего кровотечения или истечения жидкости.

Существующие продукты, которые предназначены для использования в остановке внутренних жидкостей, также имеют значительные проблемы. BioGlue™ (Cryolife Inc.) является сильным адгезивом и изолирующим средством, но содержит альбумин, сшитый посредством глутаральдегида, вещества, которое является токсичным и высоко нейротоксичным. Эта токсичность значительно ограничивает его применение. Другим изолирующим средством является CoSeal (Baxter), который состоит из полиэтиленгликоля (PEG). Хотя оно является нетоксичным, это средство имеет лишь слабую адгезивную силу, что значительно ограничивает его применения.

Желатин использовали в различных раневых повязках. Так как желатиновые гели имеют относительно низкую точку плавления, они являются не очень стабильными при температуре тела. Следовательно, обязательна стабилизация этих гелей путем создания поперечных связей между белковыми цепочками. На практике это обычно достигается путем обработки желатина глутаральдегидом или формальдегидом. Таким образом, сшитый желатин может быть изготовлен в виде сухих губок, полезных для индуцирования остановки крови в кровоточащих ранах. Имеющиеся в продаже примеры таких губок включают Spongostan (Ferrosan, Denmark), Gelfoam (Upjohn, USA) и Surgifoam (Ethicon. Somerville, NJ). Главным недостатком таких губок является то, что используемый сшивающий агент (формальдегид или глутаральдегид) является токсичным для клеток. Негативный эффект глутаральдегидного сшивания проиллюстрирован, например, данными, полученными de Vries et al. (Abstract Book of the Second Annual Meeting of the WHS, Richmond, USA, p51, 1992). Эти авторы показали, что сшитые глутаральдегидом коллагеновые решетки были токсичны для клеток, в то время как несшитая разновидность являлась нетоксичной. Таким образом, несмотря на их полезные кровоостанавливающие свойства, эти изделия являются не очень оптимальными в качестве раневых повязок для обработки проблемных ран. Таким образом, была бы очень желательна раневая повязка на основе желатина с использованием другой, менее токсичной технологию сшивания.

Помимо возможной токсичности, желатиновые матрицы сами по себе не обеспечивают механические свойства, необходимые для регулирования активного кровотечения. Они являются более подходящими для применений в обработке ран, при которых требуется лишь небольшая абсорбция жидкости. В одном исследовании был сделан вывод, что пластины сшитого глутаральдегидом желатина являются более подходящими в качестве средства для продолжительного заживления раны, в частности дистрофической ткани, для которой требуется более продолжительное время. Альтернативно, они могут быть полезны в качестве каркаса для прикрепления клеток, где они могут стимулировать микросреду со слабой реакционной способностью благодаря пролонгированному присутствию in situ (MG Tucci. (2001). J. Bioactive & Соmp. Polymers. 16(2): 145-157).

Желатиновые матрицы, сшитые с полисахаридами, также были рекомендованы для использования в регулировании кровотечения. Эти кровоостанавливающие соединения не имеют возможной токсичности сшитых глутаральдегидом желатиновых губок. Однако у желатин-полисахаридных веществ обычно отсутствует механическая прочность, и они предназначены главным образом для регулирования небольших количеств выделяющейся жидкости во время операции или для ограничения раневого выделения на протяжении продолжительного периода после лечения.

Одним из примеров желатин-полисахаридного соединения является желатин-альгинатная раневая повязка, которая сшивается in situ. Такая повязка не выполняет адгезивной функции, и ее главным образом используют для сохранения влаги на раневом участке. Повязки набухают до 90% их первоначального размера, что значительно снижает их механическую прочность (В Balakrishnan et al. (2005). Biomaterials. 26(32):6335-42).

Еще одним более распространенным примером является сшитая желатин-хитозановая раневая повязка (примеры в патентах US 6509039, 4572906). Хотя были предложения использовать такие повязки для травматологии (Chitoskin™), кровоостанавливающие свойства данного вещества просто недостаточны для контролирования кровотечения высокого давления. Кроме того, это вещество значительно набухает, когда сталкивается с большими объемами физиологических жидкостей. Такие повязки являются более подходящими для лечения хронических ран и ожогов.

Упоминается еще один пример (патент US 6132759), где солюбилизированный желатин сшивают с окисленным декстраном. Данное вещество предложено для покрытия и продолжительного лечения ран, так как оно продемонстрировало высокую поглощающую способность и подходящие свойства контролируемого высвобождения для доставки лекарственных веществ, особенно к ранам.

В настоящее время ни одно вещество, включающее сшитые желатиновые матрицы или матрицы из других веществ, сшитых с желатином, не может независимо обеспечить остановку кровотечения при активном внутреннем кровотечении, даже при добавлении тромбина. Было проведено исследование по сравнению кровоостанавливающей способности желатиновой матрицы FloSeal (BioSurgery, Fremont, CA) и желатиновой матрицы GelFoam, пропитанной активным раствором тромбина. Ни одно улучшенное кровоостанавливающее средство не было способно остановить потоковое кровотечение у более чем 2/3 пациентов через 5 минут. Пульсирующее артериальное кровотечение является гораздо более активным, чем потоковое кровотечение, и, конечно, будет создавать проблему для таких пропитанных тромбином матриц (FA Weaver et al. (2002). Ann. Vase. Surg. 16(3):286-93).

В любом случае, явным недостатком в травматологии остается то, что нет новой доступной активной кровоостанавливающей полевой повязки, которая может контролировать кровоизлияние без значительных побочных эффектов. Аналогично, явным недостатком в хирургии остается то, что нет нетоксичного доступного изолирующего средства, которое способно противостоять активному кровотечению и может изолировать раневые участки, с истекающими биологическими жидкостями, отличными от крови.

Согласно некоторым воплощениям настоящего изобретения предложен способ лечения раненой ткани, включающий нанесение на ткань композиции, содержащей желатин и нетоксичный сшивающий агент.

Возможно, нетоксичный сшивающий агент содержит трансглутаминазу. Предпочтительно трансглутаминаза включена как часть трансглутаминазной композиции, и массовое отношение желатина к трансглутаминазной композиции находится в диапазоне от примерно 1:1 до примерно 300:1. Более предпочтительно трансглутаминазная композиции имеет уровень специфической активности по меньшей мере примерно 40 ед./г. Более предпочтительно трансглутаминазная композиция имеет уровень специфической активности по меньшей мере примерно 800 ед./г.

Возможно и предпочтительно активность трансглутаминазы в желатин-трансглутаминазной композиции составляет от примерно 25 до примерно 400 ед./г желатина. Более предпочтительно активность составляет от примерно 40 до примерно 200 ед./г желатина.

Возможно, трансглутаминаза включает растительную, рекомбинатную животную, или микробного происхождения трансглутаминазу, отличную от фактора XIII крови. Предпочтительно композиция имеет pH в диапазоне от примерно 5 до примерно 8.

Возможно, желатин получают из животного источника, рекомбинантного источника или их комбинации. Предпочтительно животный источник выбирают из группы, состоящей из рыб и млекопитающих. Более предпочтительно млекопитающее выбирают из группы, состоящей из свиней и коров.

Возможно, желатин представляет собой тип А (обработанный кислотой) или тип В (обработанный щелочью). Более предпочтительно желатин содержит высокомолекулярный желатин.

Возможно, раненую ткань выбирают из группы, состоящей из хирургически разрезанной ткани, хирургически восстановленной ткани и травмированной ткани.

Возможно, способ дополнительно включает уменьшение кровотечения или истечения других физиологических жидкостей из ткани. Возможно физиологическую жидкость выбирают из группы, состоящей из цереброспинальной жидкости, желудочно-кишечной жидкости, воздуха, желчи и мочи. Предпочтительно способ дополнительно включает индуцирование остановки кровотечения или остановку других истекающих физиологических жидкостей в ткани.

Возможно, рана представляет собой кровотечение или истечение другой физиологической жидкости, и лечение раненой ткани включает нанесение композиции на область раны для стимулирования in situ сшивания желатиновых цепочек и эндогенного коллагена тканевой внутриклеточной матрицы для создания барьера для истечения жидкости или кровотечению.

Возможно, способ дополнительно включает образование биомиметического сгустка.

Возможно, нанесение композиции включает: смешивание желатина и трансглутаминазы с образованием смеси; и нанесение смеси на ткань.

Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предлагается способ индуцирования остановки кровотечения в ране у млекопитающего, включающий нанесение на рану композиции, содержащей желатин и трансглутаминазу.

Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предлагается способ индуцирования образования биомиметического сгустка на участке поврежденного кровеносного сосуда, включающий нанесение на рану композиции, содержащей желатин и трансглутаминазу.

Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая комбинацию желатина и трансглутаминазы, где соотношение количества желатина и количества трансглутаминазы выбирают для индуцирования образования биомиметического сгустка у млекопитающего.

Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая комбинацию желатина и нетоксичного сшивающего агента, где соотношение количества желатина и количества нетоксичного сшивающего агента является достаточным для уменьшения кровотечения в ране млекопитающего.

Предпочтительно нетоксичный сшивающий агент содержит трансглутаминазу. Более предпочтительно трансглутаминазу добавляют в виде части трансглутаминазной композиции, и массовое отношение желатина к трансглутаминазной композиции находится в диапазоне от примерно 1:1 до примерно 300:1. Более предпочтительно отношение находится в диапазоне от примерно 1:1 до примерно 100:1. Более предпочтительно трансглутаминазная композиция имеет уровень специфической активности по меньшей мере примерно 40 ед./г. Также более предпочтительно трансглутаминазная композиция имеет уровень специфической активности по меньшей мере примерно 80 ед./г. Также более предпочтительно трансглутаминазная композиция имеет уровень специфической активности по меньшей мере примерно 200, 400 или 800 ед./г.

Возможная активность трансглутаминазы в желатин-трансглутаминазной композиции составляет от примерно 25 до примерно 400 ед./г желатина. Предпочтительно активность составляет от примерно 40 до примерно 200 ед./г желатина.

Возможно, трансглутаминаза содержит растительную, рекомбинантную, животную или микробную трансглутаминазу, отличную от фактора крови XIII. Предпочтительно композиция дополнительно содержит стабилизатор или наполнитель. Также предпочтительно композиция имеет pH в диапазоне от примерно 5 до примерно 8.

Возможно, желатин получают из животного источника, рекомбинантного источника или их комбинации. Предпочтительно животный источник выбирают из группы, состоящей из рыбы и млекопитающих. Более предпочтительно млекопитающее выбирают из группы, состоящей из свиней и коров. Более предпочтительно желатин включает желатин из свиных шкур или свиных костей или их комбинацию. Также более предпочтительно желатин представляет собой тип А (обработанный кислотой) или тип В (обработанный щелочью). Также наиболее предпочтительно желатин включает высокомолекулярный желатин.

Возможно, желатин имеет прочность геля по блуму по меньшей мере примерно 250. Предпочтительно, рыбы включают холодноводные виды рыб.

Возможно, рекомбинантный желатин получают, используя бактериальные, дрожжевые, животные, растительные системы или системы насекомых или любой тип клеточной культуры.

Возможно, желатин очищают для удаления солей. Возможно, желатин имеет по меньшей мере одну скорректированную, адаптированную или ранее определенную характеристику. Возможно, желатин не подвергают термообратимому гелеобразованию.

Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предложен кровоостанавливающий или изолирующий биологическую жидкость агент, содержащий комбинацию желатина и нетоксичный сшивающий агент. Возможно, нетоксичный сшивающий агент содержит трансглутаминазу. Предпочтительно комбинация содержит агрегированный желатин и трансглутаминазу.

Как описано в данном описании изобретения, способ или композиция, в которой трансглутаминаза может быть возможно экстрагирована из одного или более Streptoverticillium Baldaccii, штамма Streptomyces Hygroscopicus или Escherichia coli.

Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предложен способ индуцирования остановки кровотечения в и/или изолирования раненой ткани, включающий нанесение на эту ткань композиции, содержащей сшиваемый белковый субстрат и нетоксичный сшивающий агент. Возможно, нетоксичный сшивающий агент содержит трансглутаминазу. Предпочтительно субстрат содержит одну или более чем одну синтезированную полимерную последовательность, характерную для сшиваемого трансглутаминазой участка. Более предпочтительно субстрат содержит модифицированный полипептид, содержащий по меньшей мере один участок сшивания трансглутаминазой.

Согласно другим воплощениям настоящего изобретения предложена композиция для индуцирования остановки кровотечения и/или изолирования раны, содержащая смесь желатина и трансглутаминазы, где смесь модифицирована таким образом, что желатин образует раствор с трансглутаминазой при температуре более низкой, чем естественная температура золь-гелеобразования обычного животного желатина.

Возможно, желатин был модифицирован, чтобы иметь пониженную температуру золь-гелеобразования. Предпочтительно композиция дополнительно содержит добавку для увеличения растворимости желатина в смеси. Более предпочтительно композиция дополнительно содержит добавку для снижения температуры золь-гелеобразования желатина. Наиболее предпочтительно композиция дополнительно содержит пластификатор. В