Пептиды rumc, обладающие антимикробной активностью

Пептиды rumc, обладающие антимикробной активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к пептидам RumC1, RumC2 и RumC3, обладающим антимикробной активностью, а также к генам, кодирующим эти пептиды и выделенным из Ruminococcus gnavus E1.

Некоторые бактериальные штаммы обладают способностью выделять вещества, обладающие бактериостатическим или бактерицидным действием в отношении своих конкурентов. Эти антимикробные вещества могут обладать органической природой, например органические кислоты или перекись водорода (Ross et al., Int. J. Food Microbiol. 79, 3-16, 2002), или пептидной природой. Также различают ферментативно синтезированные антимикробные пептиды, которые образуют класс антибиотиков (Mootz et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 543-551, 1997; Keating et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 598-606, 1999), и продуцируемые в рибосомах пептиды, которые образуют класс бактериоцинов (Jacob et al., Ann. Inst. Pasteur (Paris) 84, 222-224, 1953).

В отношении бактериоцинов существует растущий интерес в исследовательской и промышленной области; они могут представлять собой альтернативу применению антибиотиков, в особенности в животноводстве (Luchansky, Antonie Van Leeuwenhoek 76, 335, 1999; O'Sullivan et al., Biochimie 84, 593-604, 2002).

В последние годы разработано множество гетерологических систем экспрессии этих бактериоцинов. В частности, Morriset et al. (Morisset et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 4672-4680, 2004) проводили экспрессию вариантов мезентрицина Y105, представляющего собой бактериоцин класса IIa, продуцируемый Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides Y105, в Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum DSM20484. Аналогично, Flynn et al. (Microbiol., 148, 973-984, 2002) осуществляли экспрессию АВР-118, представляющего собой бактериоцин класса IIb, исходно продуцируемый Lactobacillus salivarius subsp. salivarius UCC118, в хозяевах Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis и Bacillus cereus.

Дополнительно осуществляли несколько тестов экспрессии бактериоцинов в бактерии Escherichia coli (McCormick et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 4757-4766, 1998; Garneau et al., Appl. Environ. Microbiol., 69, 1352-1358, 2003; Biet et al., Microbiol., 144, 2845-2854, 1998; Miller et al., Appl. Environ. Microbiol., 64, 14-20, 1998; Richard et al., J. Bacteriol., 186, 4276-4284, 2004; Kloche et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 67:532-538, 2005), дрожжах Saccharomyces cerevisiae (Schoeman et al., Yeast, 15, 647-656, 1999; Van Reenen et al., Int. J. Food Microbiol., 81, 29-40, 2003) и в молочнокислых бактериях (Rodriguez et al., Int. J. Food Microbiol., 80, 101-116, 2003).

Таким образом, осуществили множество исследований с целью идентификации новых бактериоцинов и продукции этих бактериоцинов.

Пищеварительная экосистема образована распространенной и очень сложной микрофлорой, включающей комбинацию бактерий, дрожжей и архей. Эти микроорганизмы являются по существу анаэробными, и в основном среди них обнаруживают бактерии родов Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, Bifidobacterium и Fusobacterium (Suau et al., Appl. Environ. Microbiol. 65, 4799-4807, 1999). Микрофлора оказывает значительное влияние на здоровье хозяина. Она, в частности, вовлечена в токсификацию и детоксикацию метаболических соединений, поступающих с пищей (Hughes and Rowland Microbial Ecology Health Disease 2, 179-185, 2000). Она также способна модулировать экспрессию функций энтероцитов (Bry et al., Science 273, 1380-1383, 1996; Hooper et al., Science 291, 881-884, 2001). Наконец, она играет фундаментальную роль в защите хозяина от инвазии потенциально патогенных экзогенных бактерий (Ducluzeau et al., Microbial Ecology and Intestinal Infections, 1988; Fons et al., Microbial Ecology in Health and Disease 2, 240-246, 2000).

К известным кишечным патогенам относится Clostridium perfringens, представляющий собой строго анаэробную грамположительную бактерию, которая способна образовывать споры, и которая широко распространена в окружающей среде. Этот патоген может происходить из пищи, но также может быть представлен в низкой концентрации в кишечнике, и может начинать пролиферировать и секретировать токсины под действием стресса. Штаммы Clostridium perfringens классифицируются на пять токсинотипов в зависимости от токсинов, которые они продуцируют (Petit et al., Trends Microbiol. 7, 104-110, 1999). Штаммы С.perfringens типа А и ответственны за желудочно-кишечные заболевания у человека. В 1997 году в Соединенных Штатах Америки зарегистрировано более чем 245000 случаев инфицирования С.perfringens. Это привело к госпитализации 41 человека, семь из которых умерли (Mead et al., Emerg. Infect. Dis. 5, 607-625, 1999). Штаммы С.perfringens типа А и С могут представлять собой соответственно причину некротического энтерита у свиней и домашней птицы. У домашней птицы некротический энтерит представляет собой быстро развивающуюся острую патологию, смертность от которой достигает 1-2% в сутки. Помимо ее влияния на самочувствие животных эта патология может, таким образом, оказывать ощутимое экономическое воздействие. До 1999 года это заболевание удовлетворительно контролировали путем применения антибиотиков в качестве факторов роста. Тем не менее, Евросоюз запретил их использование в корме для животных по причине появления резистентных бактерий, следствием чего явилось уменьшение эффективности антибиотиков у человека. В результате этого запрета некротический энтерит, вызванный Clostridium perfringens у свиней и домашней птицы, больше не контролируется в Европе. Количество случаев, о которых сообщают в Réseau National d'Observations Epidémiologiques en Aviculture (RNOEA) (AFSSA Ploufragan), значительно увеличилось в 1999 и 2000 годах (Valancony, Bulletin desGTV 12, 9-12, 2001).

Таким образом, в настоящее время поиск альтернативных решений для контроля и лечения этого заболевания приобретает первостепенную важность.

Ruminococcus gnavus представляет собой строго анаэробную бактерию, относящуюся к семейству Lachnospiraceae в порядке Clostridiales. Dabard et al. (Appl. Environ. Microbiol., 67, 4111-4118, 2001) продемонстрировали, что штамм Ruminococcus gnavus E1, выделенный из доминирующей флоры у человека, способен продуцировать антимикробное вещество, известное как руминококцин А или RumA, которое накапливается в культуральном супернатанте. Он представляет собой бактериоцин, относящийся к семейству лантибиотиков, обладающих активностью против различных штаммов патогенного Clostridium sp. Gomez et al. (J. Bacteriol., 184, 18-28, 2002) продемонстрировал, что экспрессия генов, вовлеченных в биосинтез руминококцина А, индуцируется в присутствии трипсина. Те же самые авторы также продемонстрировали, что некоторые пищеварительные ферменты могут ингибировать индукцию продукции RumA.

Таким образом, авторы изобретения заинтересовались другими бактериоцинами.

Настоящее изобретение относится к пептидам RumC1, RumC2 и RumC3, обладающим антибактериальной активностью против Clostridium perfringens, и также к генам, кодирующим эти пептиды.

Описание последовательностей

SEQ ID No.1: Консервативная пептидная последовательность пептидов RumC Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No.2: Пептидная последовательность пептидов RumC Ruminococcus gnavus E1, экспериментально определенная при помощи способа деградации по Эдману.

SEQ ID No.3: Пептидная последовательность пептидов RumC Ruminococcus gnavus E1, экспериментально определенная при помощи способа деградации по Эдману.

SEQ ID No.4: Пептидная последовательность пептида RumC1 Ruminococcus gnavus E1, выведенная из SEQ ID No.7

SEQ ID No.5: Пептидная последовательность пептида RumC2 Ruminococcus gnavus E1, выведенная из SEQ ID No.8

SEQ ID No.6: Пептидная последовательность пептида RumC3 Ruminococcus gnavus E1, выведенная из SEQ ID No.9

SEQ ID No.7: Нуклеотидная последовательность гена rumC1 Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No.8: Нуклеотидная последовательность гена rumC2 Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No.9: Нуклеотидная последовательность гена rumC3 Ruminococcus gnavus E1

SEQ ID No.10, 11 и 12: Экспериментально определенные пептидные последовательности

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к пептиду, обладающему антимикробной активностью, отличающемуся тем, что он включает пептид, выбранный из следующих пептидов: пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.1, пептид, включающий пептид, имеющий по меньшей мере 80% идентичность с полипептидом SEQ ID No.1, пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.2, и пептид, включающий пептид, имеющий по меньшей мере 80% идентичность с полипептидом SEQ ID No.2. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения этот пептид также включает пептидную последовательность SEQ ID No.3. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения этот пептид включает пептид, выбранный из пептидов, имеющих последовательность SEQ ID No.4, 5 или 6.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антимикробную активность, отличающемуся тем, что он включает полинуклеотид, выбранный из любого полинуклеотида, имеющего последовательности SEQ ID No.7, 8 или 9, к полинуклеотиду, который гибридизуется с любым полинуклеотидом, имеющим последовательности SEQ ID No.7, 8 или 9, и к полинуклеотиду, кодирующему полипептид, определенный выше.

Настоящее изобретение также относится к экспрессионной кассете, отличающейся тем, что она включает в направлении транскрипции промотор, который является функциональным в организме хозяина, полинуклеотид, определенный выше, и терминаторную последовательность в том же самом организме хозяина.

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему полинуклеотид, определенный выше, и/или экспрессионную кассету, определенную выше.

Настоящее изобретение также относится к организму-хозяину, трансформированному полинуклеотидом, определенным выше, экспрессионной кассетой, определенной выше, и/или вектором, определенным выше.

Настоящее изобретение относится к штамму Ruminococcus gnavus, депонированному в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) 19 декабря 2006 года под номером CNCM 1-3705, а также к не модифицированному генетически бактериальному штамму в выделенной форме, который продуцирует пептид, определенный выше.

Настоящее изобретение относится к белковой смеси или ферментационному суслу, которое может быть получено при помощи организма хозяина или штамма, определенного выше.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей пептид, определенный выше, организм хозяина, определенный выше, штамм, определенный выше, ферментационное сусло организма хозяина, определенное выше, или ферментационное сусло штамма, определенное выше. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения композиция находится в жидкой форме или порошкоообразной форме.

Настоящее изобретение также относится к пищевой добавке, содержащей пептид, определенный выше, организму хозяина, определенному выше, штамму, определенному выше, ферментационному суслу организма хозяина, определенному выше, или ферментационному суслу, определенному выше. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения добавка находится в жидкой форме или порошкообразной форме.

Настоящее изобретение также относится к корму для животных, отличающемуся тем, что он включает пищевое основание для животных и пищевую добавку, определенную выше.

Настоящее изобретение также относится к применению определенного выше пептида, определенного выше организма хозяина, определенного выше штамма, определенного выше ферментационного сусла организма хозяина или определенного выше ферментационного сусла штамма для приготовления лекарственного средства, пищевой добавки или корма для животных. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения это лекарственное средство или его пищевая добавка предназначены для профилактики или лечения некротического энтерита у домашней птицы или свиней. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения это лекарственное средство или эта пищевая добавка предназначены для профилактики или лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека.

Наконец, настоящее изобретение также относится к нетерапевтическому применению определенного выше пептида для лечения животных. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения пептид получают из штамма, эндогенного для животного, или из штамма, экзогенного для животного. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения пептид получают из штамма, эндогенного для животного, и стимулируют продукцию пептида указанным эндогенным штаммом. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения пептид получают из штамма, эндогенного для животного, и стимулируют рост указанного эндогенного штамма.

Пептиды.

Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам, обладающим антимикробной активностью. Предпочтительно эти пептиды выделяют из Ruminococcus gnavus, например из мутантного штамма Ruminococcus gnavus. В качестве примера, эти пептиды могут выделять из штамма Ruminococcus gnavus, депонированного в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) 19 декабря 2006 года под номером CNCM 1-3705, т.е. штамма LEM9-17.

Термин "антимикробная активность" обозначает способность ингибировать рост или развитие бактерий-мишеней или способность убивать бактерии-мишени. Способы измерения антимикробной активности известны специалистам в данной области техники. Антимикробная активность продемонстрирована в настоящем изобретении путем тестирования активности в отношении штамма Clostridium perfringens CpA, выращиваемого на агаровой среде. Образец, содержащий один из пептидов по изобретению, помещают в лунки, сформированные в агаровой среде. Антимикробная активность является показанной, когда вокруг лунки образуется ореол ингибирования.

Пептидные последовательности пептидов RumC1, RumC2 и RumC3 Ruminococcus gnavus E1 представлены соответственно последовательностями SEQ ID No.4, SEQ ID No.5 и SEQ ID No.6. Эти последовательности происходят соответственно от нуклеотидных последовательностей генов rumC1, rumC2 и rumC3, представленных, соответственно, последовательностями SEQ ID No.7, SEQ ID No.8 и SEQ ID No.9.

Изобретение также относится к фрагментам этих пептидов RumC1, RumC2 и RumC3 Ruminococcus gnavus E1, обладающим антимикробной активностью. Термин "пептидный фрагмент" обозначает пептид, содержащий часть, а не весь пептид, от которого он происходит. Таким образом, изобретение относится к пептидам, имеющим последовательности SEQ ID No.1, SEQ ID No.2 и SEQ ID No.3.

Эти фрагменты сохраняют свою антимикробную активность. Таким образом, изобретение относится к биологически активным фрагментам. Термин "биологически активный фрагмент" обозначает фрагмент полипептида, который сохраняет функцию полипептида, от которого он происходит.

Изобретение также относится к пептидам, обладающим антимикробной активностью, которые имеют, по меньшей мере, 80%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичных аминокислот с любыми пептидами, имеющими последовательности SEQ ID No.1, 2 или 3.

Способы получения пептидов последовательностей SEQ ID No.1, SEQ ID No.2 и SEQ ID No.3 известны специалистам в данной области техники.

Пептиды RumC секретируются (или высвобождаются) бактериями во внеклеточную среду. Возможно, чтобы любые из пептидов, имеющих последовательности SEQ ID No.4, 5 и/или 6, включали сигнальный пептид с заданным количеством аминокислот. В этом случае изобретение также относится к зрелому пептиду, полученному после отщепления сигнального пептида. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения изобретение относится к пептидам, последовательности которых располагаются между позицией 20 и позицией 63 в последовательностях SEQ ID No.4, 5 и 6.

В еще одном воплощении потенциальный сигнальный пептид в составе пептида SEQ ID No.4, 5 или 6 может быть замещен гетерологичным сигнальным пептидом для осуществления экспрессии и секреции этого пептида гетерологичным организмом-хозяином.

Объектом изобретения также является пептид, обладающий антимикробной активностью, который обладает, по меньшей мере, 80% идентичностью с SEQ ID No.4, 5 или 6. В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения этот пептид выделяют из штамма Ruminococcus gnavus. В соответствии с еще одним воплощением настоящего изобретения этот пептид выделяют из других штаммов Ruminococcus или других бактерий. Альтернативно, этот пептид могут получать путем химического синтеза.

Одним из объектов изобретения является пептид, в котором по меньшей мере, 90%, 95%, 98% и, предпочтительно, по меньшей мере 99% аминокислот идентичны любому из пептидов, обладающих последовательностями SEQ ID No.4, 5 или 6.

Термин "идентичные аминокислоты" обозначает аминокислоты, которые являются постоянными или неизменными для двух последовательностей. Эти пептиды могут иметь делецию, вставку или замену, по меньшей мере, одной аминокислоты по сравнению с пептидами, представленными последовательностями SEQ ID No.4, 5 или 6. Аминокислоты, модифицированные после транскрипции, например путем дегидратации, образования моносульфидных мостиков, лантионин и т.д. рассматривают как аминокислоты, которые являются неизменными в двух последовательностях.

Объектом изобретения также являются пептиды, имеющие, по меньшей мере, 80%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно, по меньшей мере, 99% сходства с любыми пептидами, имеющими последовательности SEQ ID No.4, 5 или 6.

Термин "сходство" обозначает степень похожести между белковыми последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот. Эти пептиды могут иметь делецию, вставку или замену, по меньшей мере, одной аминокислоты по сравнению с пептидами, представленными последовательностями SEQ ID No.4, 5 или 6. Количественно оцениваемая степень сходства между двумя последовательностями основана на проценте идентичности и/или консервативных замен в последовательности.

Способы измерения и идентификации степени идентичности и степени близости между полипептидами известны специалистам в данной области техники. Осуществляют совмещение последовательностей, например, при помощи Vector NTi 9.1.0, представляющей собой программу для совмещения AlignX (алгоритм Clustal W) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) или с использованием средства CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

Пептиды по изобретению могут выделять или очищать из своей естественной среды. Пептиды могут получать при помощи различных способов. Эти способы представляют собой, в особенности, очистку из естественных источников, таких как бактерии, которые в природе экспрессируют эти пептиды, продукцию рекомбинантных пептидов подходящими клетками хозяевами и их последующую очистку, продукцию при помощи химического синтеза или, наконец, комбинацию этих различных подходов. Таким образом, пептиды, имеющие последовательности SEQ ID No.1-6 по настоящему изобретению, могут выделять из штамма Ruminococcus gnavus, депонированного в CNCM 19 декабря 2006 года под номером CNCM I-3705. В еще одном воплощении пептиды по настоящему изобретению выделяют из рекомбинантных организмов хозяев, экспрессирующих пептид RumC по изобретению или фрагмент пептида RumC, обладающий антимикробной активностью.

Объект изобретения также представляют собой слитые белки, рекомбинантные белки или химерные белки, включающие пептиды по изобретению.

Пептиды по изобретению могут выделять из слепокишечного содержимого моноксенных крыс, несущих штамм Ruminococcus gnavus E1, и из мутантного штамма Ruminococcus gnavus, более конкретно штамма Ruminococcus gnavus, депонированного в CNCM 19 декабря 2006 года под номером CNCM 1-3705. Эти пептиды обладают антимикробной активностью, продемонстрированной при помощи теста активности в отношении Clostridium perfringens.

Масс-спектрометрия дает возможность определить приблизительную молекулярную массу пептида RumC по изобретению. Молекулярная масса составляет от 4000 до 4600 Да и более конкретно от 4100 до 4500 Да.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения пептид подходит для пищевого или фармацевтического применения, например для применения в кормлении животных.

Термин "пептид, подходящий для пищевого или фармацевтического применения", обозначает пептид, характеристики которого являются такими, что он подходит для кормления или фармацевтического применения. Характеристики, важные для пищевого или фармацевтического применения, в частности, представляют собой pH, который может выдерживать пептид. В частности, pH пищеварительной системы человека и животного является кислым, и, таким образом, важно, чтобы пептид был устойчив к этому значению pH. Еще одна важная для пищевого применения характеристика представляет собой температуру, при которой антимикробное вещество является активным. В частности, переработка антимикробного вещества в лекарственное средство, пищевую добавку или корм для животных, например, включает обработку при температуре выше комнатной температуры. Активность используемых антимикробных веществ, таким образом, должна быть стабильна при условиях способа, в особенности при температурных условиях.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения пептид или смесь пептидов по изобретению обладает антимикробной активностью при нейтральном значении pH и сохраняет свою антимикробную активность при кислом pH, например ниже 7, и предпочтительно ниже 4,4.

В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения пептид или смесь пептидов по изобретению обладает антимикробной активностью при 37°C и сохраняет эту активность при температурах ниже и выше комнатной температуры, например выше 50°C.

Изобретение также относится к пептиду, обладающему антимикробной активностью, выделенному из содержимого слепой кишки моноксенных крыс или из мутантного штамма Ruminococcus gnavus, обладающему активностью против штаммов Clostridium perfringens, имеющему молекулярную массу от 4000 до 4600 Да, что определяют при помощи масс-спектрометрии, и устойчивому к pH меньше чем или равному 7. В соответствии с одним из воплощений пептид включает последовательность SEQ ID No.1 и/или последовательность SEQ ID No.2. В соответствии с еще одним аспектом изобретения он также включает пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.3. Предпочтительно пептид включает пептид, выбранный из любого из пептидов, имеющих последовательность SEQ ID No.4, 5 или 6.

Изобретение также относится к пептиду, обладающему антимикробной активностью, который может быть получен из мутантного штамма Ruminococcus gnavus, например штамма Ruminococcus gnavus, депонированного в CNCM 19 декабря 2006 года под номером CNCM I-3705. В соответствии с одним из воплощений пептид обладает антимикробной активностью в отношении штаммов Clostridium perfringens. В соответствии с еще одним аспектом пептид имеет молекулярную массу от 4000 до 4600 Да и предпочтительно от 4100 до 4500 Да, что определяют при помощи масс-спектрометрии. В соответствии с еще одним аспектом пептид обладает антимикробной активностью при нейтральном pH, и сохраняет свою антимикробную активность при кислом pH, например меньше 7, и предпочтительно ниже 4,4. В соответствии с одним из воплощений пептид включает последовательность SEQ ID No.1 и/или последовательность SEQ ID No.2. В соответствии с еще одним аспектом изобретения он также включает пептид, имеющий последовательность SEQ ID No.3. Предпочтительно пептид включает пептид, выбранный из любого из пептидов, имеющих последовательности SEQ ID No.4, 5 или 6.

Изобретение также относится к пептиду, обладающему антимикробным потенциалом, выделенному из содержимого слепой кишки моноксенных крыс, соответствующему хроматограмме на Фиг.4А, полученной при 214 нм при помощи обратно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии), обладающему активностью в отношении различных штаммов Clostridium perfringens, в частности типу токсина А.

Полинуклеотиды.

Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим антимикробную активность. Предпочтительно эти полинуклеотиды кодируют антимикробную активность в отношении Ruminococcus.

В соответствии с настоящим изобретением термин "полинуклеотид" обозначает одноцепочечную полинуклеотидную цепь или комплементарную ей цепь, которая может быть цепью ДНК или РНК, или двухцепочечную нуклеотидную цепь, которая может представлять собой комплементарную или геномную ДНК. Предпочтительно полинуклеотиды по изобретению представляют собой ДНК, в частности двухцепочечную ДНК. Термин "полинуклеотид" также обозначает модифицированные полинуклеотиды.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут выделять или очищать из естественной среды. Полинуклеотиды по настоящему изобретению также могут получать путем химического синтеза или при помощи стандартных способов молекулярной биологии, описанных Sambrook, Fristsch и Maniatis в их книге, озаглавленной "Molecular cloning: a laboratory manual", издание: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Изобретение относится к полинуклеотиду, соответствующему любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Изобретение также относится к полинуклеотиду, который гибридизуется с полинуклеотидом, соответствующим любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему пептид, обладающий определенной выше антимикробной активностью.

Изобретение также относится к полинуклеотиду, который имеет, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичность с полинуклеотидом, соответствующим любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Этот полинуклеотид кодирует антимикробную активность. В соответствии с одним из воплощений полинуклеотид кодирует антимикробную активность в отношении штаммов Clostridium perfringens.

Термин "идентичные нуклеотиды" обозначает нуклеотиды, которые являются постоянными или неизменными между двумя последовательностями. Этот полинуклеотид может иметь делецию, вставку или замену, по меньшей мере, одного нуклеотида по сравнению с референсным полинуклеотидом.

Изобретение также относится к полинуклеотиду, который имеет, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно по меньшей мере 99% сходство с полинуклеотидом в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Этот полинуклеотид кодирует антимикробную активность. В соответствии с одним из воплощений полинуклеотид кодирует антимикробную активность в отношении штаммов Clostridium perfringens.

Термин "сходство" обозначает меру близости между белковыми последовательностями или последовательностями нуклеиновой кислоты. Этот полинуклеотид может иметь делецию, вставку или замену, по меньшей мере, одного нуклеотида по сравнению с референсным полинуклеотидом. Степень сходства между двумя последовательностями, оцениваемая по шкале, основана на проценте идентичности и/или консервативных замен в последовательности.

Способы измерения и идентификации степени идентичности и степени сходства между последовательностями нуклеиновой кислоты известны специалистам в данной области техники. Осуществляют совмещение последовательностей, например, при помощи Vector NTi 9.1.0, программы совмещения AlignX (алгоритм Clustal W) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com) или с использованием средства CLUSTAW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).

Изобретение также относится к полинуклеотидам, способным избирательно гибридизоваться с полинуклеотидом в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9. Предпочтительно селективную гибридизацию осуществляют в умеренно жестких условиях и предпочтительно в очень жестких условиях. В соответствии с изобретением термин "последовательность, способная селективно гибридизоваться" обозначает последовательности, которые гибридизуются с референсной последовательностью в степени, значительно превосходящей фоновый уровень. Уровень сигнала, сформированного путем взаимодействия между последовательностью, способной избирательно гибридизоваться, и референсными последовательностями, как правило, в 10 раз и предпочтительно в 100 раз более сильный по сравнению с взаимодействием с другими последовательностями ДНК, которые формируют фоновый уровень. Условия более строгой гибридизации, которые дают возможность для избирательной гибридизации, известны специалистам в данной области техники. Как правило, температура гибридизации и промывки, по меньшей мере, на 5°C ниже Tm (температура плавления) референсной последовательности при данном pH и для заданной ионной силы. Как правило, температура гибридизации составляет, по меньшей мере, 30°C для полинуклеотида из 15-50 нуклеотидов и, по меньшей мере, 60°C для полинуклеотида из более чем 50 нуклеотидов. В качестве примера гибридизацию осуществляют в следующем буфере: 6Х SSC (хлорид натрия + цитрат натрия), 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,02% PVP (поливинилпирролидон), 0,02% Ficoll, 0,02% BSA (бычий сывороточный альбумин), 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Промывку осуществляли, например, последовательно при низкой жесткости в 2Х SSC, 0,1% буфере SDS (додецилсульфат натрия), при умеренной жесткости в 0,5Х SSC, 0,1% буфере SDS и при высокой жесткости в 0,1Х SSC, 0,1% буфере SDS. Безусловно, гибридизацию можно осуществлять в соответствии с другими общими способами, известными специалистам в области техники (см., в частности, Sambrook, Fristsch и Maniatis в их книге, озаглавленной "Molecular cloning: a laboratory manual", edition: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Предпочтительно полинуклеотиды, которые избирательно гибридизуются с референсным полинуклеотидом, сохраняют функцию референсной последовательности. В данном случае полинуклеотиды, которые избирательно гибридизуются с полинуклеотидом в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID No.7, 8 или 9, кодируют антимикробную активность.

Изобретение относится, в общем, к полинуклеотидам, кодирующим пептиды по изобретению. Учитывая вырожденность генетического кода, различные полинуклеотиды могут кодировать один и тот же полипептид.

Экспрессионные кассеты.

В соответствии с одним из воплощений изобретения полинуклеотид, кодирующий пептид по изобретению, встраивают в экспрессионную кассету с использованием способов клонирования, хорошо известных специалистам в данной области техники. Эта экспрессионная кассета включает элементы, необходимые для транскрипции и трансляции кодирующих последовательностей для полипептидов по изобретению.

Предпочтительно эта экспрессионная кассета включает как элементы, требующиеся для продукции пептида в клетке-хозяине, так и элементы, необходимые для регуляции этой экспрессии.

Эти экспрессионные кассеты включают в направлении транскрипции:

- промотор, который является функциональным в организме хозяина;

- полинуклеотид по изобретению;

- терминаторную последовательность, которая является функциональной в том же самом организме хозяина.

В экспрессионных кассетах по изобретению могут использовать любой тип промоторной последовательности. Выбор промотора зависит в особенности от организма хозяина, выбранного для экспрессии интересующего гена. Некоторые промоторы дают возможность конститутивной экспрессии, тогда как другие промоторы, с другой стороны, являются индуцируемыми.

Среди функциональных промоторов в грибах следует, в особенности, упомянуть глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current Genet. 15, 177-180, 1989).

Среди функциональных промоторов в бактериях следует упомянуть в особенности промоторы РНК полимеразы бактериофага Т7 (Studier et al., Methods in Enzymology, 185, 60-89, 1990).

Среди функциональных промоторов дрожжей следует упомянуть промотор гена GAL1 (Elledge et al., Proc. Natl Acad. Sciences, USA. 88, 1731-1735, 1991) или промоторы Gal4 и ADH S. cerevisiae. Все эти промоторы описаны в литературе и хорошо известны специалистам в данной области техники.

Для экспрессии в Penicillium funiculosum выбирают, например, экспрессионные кассеты, включающие промотор гистона Н4В, промотор протеазы аспарагиновой кислоты или промотор csl13 (WO 00/68401).

Для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris выбирают, например, экспрессионные кассеты, содержащие индуцируемый метанолом промотор АОХ1 (Tschopp et al., Biotechnology, 5, 1305-1308, 1987) или сильный конститутивный промотор GAP (Waterham et al., Gene 186, 37-44, 1997).

Для экспрессии в Schizosaccharomyces pombe выбирают, например, экспрессионные кассеты, содержащие регулирующий промотор Nmt1, репрессированный тиамином, и активируемый в отсутствие тиамина (Maundrell, J. Biol. Chem. 265, 10857-10864, 1989).

Экспрессионные кассеты по настоящему изобретению также могут включать любую другую последовательность, необходимую для экспрессии полипептидов или полинуклеотидов, например регуляторные элементы или сигнальные последовательности, дающие возможность секреции полипептидов, продуцируемых организмом хозяина. В частности, можно применять любую регуляторную последовательность, которая дает возможность увеличения уровня экспрессии кодирующей последовательности, встроенной в экспрессионную кассету. В соответствии с изобретением ее, в частности, можно использовать в комбинации с промоторной регулирующей последовательностью или другими регулирующими последовательностями, которые расположены между промотором и кодирующей последовательностью, такими как активаторы транскрипции ("энхансеры").

Дополнительно, экспрессионные кассеты по настоящему изобретению могут включать любую другую последовательность, необходимую для секреции полипептидов, продуцируемых организмом хозяина, такую как сигнальная последовательность. Для секреции в Pichia pastoris можно, например, использовать последовательность α фактора в качестве сигнала секреции.

В экспрессионных кассетах по изобретению может быть использовано широкое разнообразие терминаторных последовательностей, причем эти последовательности дают возможность терминации транскрипции и полиаденилирования мРНК. Может быть использована любая терминаторная последовательность, функциональная в выбранном организме хозяина.

Для экспрессии в Penicillium funiculosum выбирают, например, экспрессионные кассеты, содержащие терминатор гистона Н4.В, терминатор протеазы аспарагиновой кислоты или терминатор csl13 (WO 00/68401).

Объектом настоящего изобретения также является полинуклеотид, содержащий экспрессионную кассету по изобретению; предпочтительно экспрессионные кассеты по настоящему изобретению встроены в вектор.

Векторы.

Настоящее изобретение также относится к клонирующим или экспрессионным векторам для трансформации организма хозяина, содержащим, по меньшей мере, один полинуклеотид или экспрессионную кассету по настоящему изобретению. Этот вектор может, в частности, соответствовать плазмиде, космиде, бактериофагу или вирусу, куда встроен полинуклеотид или экспрессионная кассета по изобретению. Способы конструирования этих векторов и встраивания полинуклеотида по изобретению в эти векторы известны специалистам в данной области техники. В общем, может быть использован любой вектор, способный к самоподдержанию, или к саморепликации, или распространению в клетке-хозяине для того, чтобы в особенности вызывать экспрессию полинуклеотида или пептида. Специалист в данной области техники выбирает подходящие векторы в зависимости от трансформируемого организма хозяина и в зависимости от используемого способа трансформации.

Векторы по настоящему изобретению используются, в частности, для трансформации организма-хозяина с целью репликации вектора и/или экспрессии пептида по изобретению в организме-хозяине.

Изобретение также относится к способу получения пептида по изобретению, включающему следующие стадии:

- организм хозяина трансформируют экспрессионным вектором, содержащим экспрессионную кассету по изобретению и/или полинуклеотид по изобретению,

- выделяют пептиды, продуцируемые организмом-хозяином.

Организмы-хозяева.

Объектом настоящего изобретения также является способ трансформации организма хозяина путем интеграции в указанный организм-хозяин, по меньшей мере, одного полинуклеотида, по меньшей мере, одной экспрессионной кассеты или, по меньшей мере, одного вектора по изобретению. Полинуклеотид может быть интегрирован в геном организма-хозяина или может стабильно реплицироваться в организме-хозяине. Способы трансформации организмов-хозяев известны специалистам в данной области техники и широко описаны в литературе.

Настоящее изобретение также относится к организму-хозяину, трансформированному полинуклеотидом, экспрессионной кассетой или вектором по изобретению.

В соответствии с изобретением термин "организм-хозяин", в частности, обозначает любой высший или низший одноклеточный или многоклеточный организм, выбранный, в частности, из бактерий, дрожжей и грибов. В частности, термин "организм-хозяин" обозначает нечеловеческий организм. Предпочтительно дрожжи выбирают, например, из Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica и Schwanniomyces occidentalis. Грибы выбирают, например, из Aspergillus, Trichoderma и Penicilliums, предпочтительно из Penicillium funiculosum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii и Trichoderma koningii. В одном из воплощений изобретения организм-хозяин представляет собой штамм Penicillium funiculosum, в котором имеет место экспрессия или сверхэкспрессия пептида по изобретению. В еще одном воплощении организм хозяин представляет собой штамм Debaromyces castellii, в котором имеет место экспрессия или сверхэкспрессия пептида по изобретению. В еще одном воплощении организм хозяин представляет собой штамм Ruminococcus gnavus, в котором имеет место экспрессия или сверхэкспрессия пептида по изобретению.

Способы конструирования векторов для трансформации организмов-хозяев и для э