Антитела и фрагменты антител человека против рецептора фолата альфа для радиоиммунотерапии карциномы яичника

Антитела и фрагменты антител человека против рецептора фолата альфа для радиоиммунотерапии карциномы яичника

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к антителам и фрагментам антител человека с высокими аффинностями, в частности к фрагментам Fab, специфичным в отношении рецептора фолата альфа человека. Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования таких антител и фрагментов и их применению в терапевтических регулированиях и установках диагнозов, таких как радиоиммунотерапия, в частности при раке яичника. Настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитела и фрагменты.

Эпителиальный рак яичника (ЕОС) является самым летальным из гинекологических злокачественных образований в промышленно развитых странах и в Европе. Несмотря на относительно низкую частоту (приблизительно 1/100000 новых случаев каждый год), ЕОС показывает высокое отношение случай - летальный исход, и общее дожитие, составляющее 5 лет, остается у приблизительно 44%^(1),(2). Женщины с ограниченными органом опухолями имеют отличный прогноз выживаемости, но большинство раков на ранней стадии являются бессимптомными, и у более двух третей пациентов диагностируется запущенное заболевание. ЕОС на ранней стадии является, как правило, бессимптомным, и большинство женщин (70-75%) показывают запущенное заболевание, которое часто распространяется в виде диффузных метастазов опухоли небольшого объема. Первоначальное хирургическое вмешательство почти всегда необходимо при лечении заподозренного рака яичника для гистологического подтверждения, определения стадии и уменьшения объема опухоли. Эффективное циторедуктивное хирургическое вмешательство во время диагностирования, достижимое, главным образом, при заболевании на ранней стадии, было увязано с увеличением дожития. Однако из-за трудностей в ранней диагностике и предрасположенности к диффузному метастазу небольшого объема для подавляющего большинства пациентов с ЕОС необходимо адъювантное лечение для попытки уничтожения остаточного заболевания.

Химиотерапия играет все более важную роль в эффективном лечении карциномы яичника^(3),(4). ЕОС считается чувствительной к химиотерапии опухолью; в действительности 70-80% страдающих ЕОС пациентов, которые получают в высокой степени активную, наиболее усовершенствованную химиотерапию, вступают в стадию клинической ремиссии. Однако несмотря на разработку новых терапевтических подходов и увеличение среднего общего выживания, рецидив происходит у большинства пациентов на стадии прогрессирования после завершения ответа на первоначальные лечения, и, по крайней мере, 70-90% этих пациентов, в конечном счете, умирают от устойчивых к лекарственным средствам (терапиям) раков, при этом только 10-30% демонстрируют длительное дожитие.

Поэтому существует большая потребность в способах альтернативного лечения рака яичника. Одним из этих альтернативных лечений является радиоиммунотерапия. Карциному яичника можно лечить с помощью адъювантной радиоиммунотерапии для уничтожения метастазов, являющихся устойчивыми к химиотерапии. Радиоиммунотерапия заключается в мечении моноклонального антитела, специфичного в отношении ракового эпитопа, радиоактивным компонентом. Меченное радиоактивным изотопом моноклональное антитело затем вводят in vivo, и его специфичность будет приводить к его аккумуляции в раковой массе. Этот метод позволяет концентрировать терапевтический агент, в этом случае радиоактивное соединение в раковых клетках и в противоположность химиотерапии, которая не является сайтспецифической, имеет меньшую токсичность и меньше побочных эффектов вследствие его селективной направленности, возможного отличного механизма действия и меньшей дозы терапевтического агента, используемого для полного лечения.

Для карциномы яичника пока идентифицировано несколько различных маркеров и создано много различных антител. Среди них наиболее охарактеризованными являются антитела против СА125^(5),(6) и MUC-1 и антитела против рецептора фолата, такие как Mov18⁽⁷⁾. Последние из названных антител представляют несколько значительных преимуществ.

Рецептор фолата альфа (αFR) представляет собой связанный с гликозилфосфатидилинозитом белок с высокой аффинностью к фолиевой кислоте и некоторым восстановленным фолатам, таким как 5-метилтетрагидрофолат и тетрагидрофолат. Он также присутствует на ограниченном числе эпителиальных клеток, особенно почки, плаценты и хориодного сплетения, но экспрессируется на их апикальной поверхности, что делает его не доступным для антител. Сверхэкспрессия αFR клетками карциномы яичника и его ограниченное распространение в нормальных тканях предоставляет возможность для разработки антител против αFR для радиоиммунотерапии. MOv18 является моноклональным антителом, которое является специфичным в отношении рецептора фолата альфа, являющимся идеальной мишенью для радиоиммунотерапии, поскольку он сверхэкспрессируется в 90% карцином яичников. MOv18, меченное радиоизотопом - ¹³¹I, уже было введено, с некоторым успехом, в клиническое испытание фазы I/II. Другие мышиные моноклональные антитела, индуцированные против αFR, включают MOv19.

Ряд других мАт, включающих MOv18, продемонстрировали эффективность в различных клинических испытаниях, но их клиническая разработка была ограничена их мышиным происхождением. Для обхождения их иммуногенности были сконструированы некоторые антитела так, чтобы они образовывали химерные или гуманизированные антитела до или во время их клинической разработки, при этом последнее потомство является полностью человеческим и находится в процессе клинической разработки.

Ограничением, с которым часто сталкивается радиоиммунотерапия, является длинный период полувыведения антитела, который может составлять несколько дней. С одной стороны, это свойство может представлять преимущество, предоставляя адекватное количество времени для направленной доставки антитела к опухоли. Однако, с другой стороны, это также означает, что пациент может иметь в течение нескольких дней, в зависимости от метки, радиоактивный компонент, распадающийся в венах по всему организму. В этом случае отношение опухоли к крови или органу будет едва превышать лаг в большинстве благоприятных условий, поскольку антитело медленно выводится из организма пациента. С этой точки зрения уменьшение периода полувыведения антитела будет уменьшать токсичность лечения путем снижения побочных эффектов вследствие аккумуляции неспецифических излучений в здоровых тканях.

Следующим моментом, который следует принимать во внимание, является проникновение внутрь опухоли. Стерическое препятствие молекул мАт не оказывает влияние до тех пор, пока мишенью является изолированная клетка в кровотоке, но становится критическим при учете солидных опухолей, как в случае карциномы яичника^(8),(9). На проникновение внутрь солидных опухолей также оказывает влияние аффинность антитела к его лиганду, и ранее было продемонстрировано, что слишком низкая аффинность препятствует локализации в опухолях, в то время как слишком высокая аффинность ограничивает связывание антитела на периферии опухоли⁽¹⁰⁾, при этом это явление описывается как заслон антигена.

Принимая во внимание вышеуказанное (происхождение, размер, период полувыведения и аффинность), было предложено применение для радиоиммунотерапии карциномы яичника фрагментов (Fab) антител человека. Действительно, молекула, меньшая, чем полноразмерное антитело, вероятно, будет поддерживать проникновение внутрь опухоли, а его человеческое происхождение должно исключить иммуногенные реакции. Более того, будет укорочен период полувыведения. Аффинность таких молекул должна рассматриваться как функция отобранного фрагмента антитела. Другим преимуществом Fab-формата является то, что для этого типа молекул не требуется какого-либо гликозилирования для его функциональности. Это совместимо с продукцией микроорганизмами и связанными преимуществами.

Такой фрагмент антитела был создан в прошлом с использованием направленного отбора, начинающегося с MOv19, моноклонального антитела (мАт), отобранного из того же слияния, из которого было произведено MOv18, распознающего не дающий перекрестную реакцию эпитоп на том же самом антигене-мишени, т.е. αFR. Отобранный фрагмент Fab, названный С4⁽¹¹⁾, как охарактеризовано с помощью in vitro анализов, был способен специфически связываться с αFR. С4 проявлял K_aff, составляющую 200 нМ, вычисленную с помощью анализа по Скэтчарду, выполненному на полнеразмерных клетках ЕОС.

Поэтому была предусмотрена разработка фрагмента Fab С4, подходящего для in vivo клинического применения в терапии и диагностике рака яичника. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что относительно низкая аффинность фрагмента Fab антитела С4 и его in vivo период полураспада являются несовместимыми с требованиями для клинической разработки. Действительно, in vivo эксперименты, проведенные авторами настоящего изобретения с фрагментом Fab С4, показали, что

- аффинность фрагмента Fab С4 была слишком низкой для эффективной локализации в опухоли;

- in vivo период полувыведения Fab С4 был очень коротким, что вместе с его низкой аффинностью препятствовало локализации в опухоли; было почти невозможно обнаружить фрагмент Fab в крови животного даже спустя только один час после внутривенного введения. Это сверхбыстрое выведение препятствовало аккумуляции фрагмента антитела в солидной опухоли, приводя к противоречивым результатам по биораспределению.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что продукции рекомбинантного Fab С4 в E.coli и его последующей очистки серьезно мешала одновременная продукция примесного не функционального гомодимера легких цепей (L₂), который трудно исключить во время стадий очистки.

Поэтому авторы настоящего изобретения решили изучить возможность продуцирования димерного фрагмента Fab, подходящего для радиоиммунотерапии карциномы яичника. Переключение с Fab-формата на F(ab)₂-формат дает несколько преимуществ, таких как двухвалентность, которая увеличивает авидность фрагмента и, следовательно, его общую аффинность, удваивает его молекулярную массу относительно соответствующего фрагмента Fab, что, в свою очередь, уменьшает экскрецию в мочу, защищая почки, и в результате увеличивает in vivo период полувыведения⁽¹²⁾.

Однако авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эффективно подвергнуть димеризации фрагмент Fab С4 невозможно. Ни природные, ни химические способы димеризации не дали приемлемых выходов димеров С4; любое небольшое количество правильного димерного продукта было в высокой степени загрязнено неправильными суррогатными димерными видами, которые было невозможно удалить с помощью очистки с использованием гельпроникающей хроматографии. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что для продукции димера Fab требуется обширная модификация исходного фрагмента Fab С4, в том числе замена легкой цепи лямбда С4 легкой цепью каппа. Это было осуществлено с использованием процедуры направленного отбора. Новый фрагмент Fab, включающий отобранную таким образом легкую цепь каппа, был назван AFRA и вызвал разработку Fab, имеющего увеличенную аффинность связывания. Новая легкая цепь каппа также аннулировала проблему образования гомодимера легких цепей и увеличила стабильность, что является преимуществом для радиоиммунотерапии⁽¹³⁾. Дальнейшим преимуществом является тот факт, что каппа-цепи легче экспрессировать в Escherichia coli⁽¹⁴⁾, которая является особенно выгодной в случае промышленного применения. Аминокислотная последовательность легкой цепи каппа AFRA настоящего изобретения проиллюстрирована на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1). Для сравнения на фиг.1 также продемонстрирована аминокислотная последовательность легкой цепи С4 (SEQ ID NO: 12).

Таким образом, настоящее изобретение относится к антителу, предпочтительно моноклональному, или к фрагменту антитела, которые специфически связываются с рецептором фолата альфа, причем указанные антитело или фрагмент включают легкую цепь, которая включает или состоит из аминокислотной последовательности AFRA, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1), или производное указанной легкой цепи, имеющее аминокислотную последовательность, которая функционально эквивалентна аминокислотной последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1). Функциональные эквиваленты определены ниже.

В контексте настоящего изобретения используется следующая терминология.

Термины «антитела и фрагменты настоящего изобретения» или «антитела AFRA» или «фрагменты антител AFRA», если не указано иное, означают антитела или фрагменты, которые включают легкую цепь, включающую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая идентична последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1), или аминокислотной последовательности, которая функционально эквивалентна аминокислотной последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1).

Термины «происходящее из AFRA антитело» или «фрагмент происходящего из AFRA антитела» используются для обозначения антител или фрагментов, которые включают легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, которая функционально эквивалента аминокислотной последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1).

Термин «легкая цепь AFRA» означает легкую цепь, проиллюстрированную на фиг.1 (AFRA) и 7 (SEQ ID NO: 1). Термин «происходящая из AFRA легкая цепь» означает легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, которая функционально эквивалента аминокислотной последовательности, проиллюстрированной на фиг.1 (AFRA) и 7 (SEQ ID NO: 1).

Термин «антитело» используется синонимично с термином «иммуноглобулин» (или «Ig»). Если не отмечено иное, термин «антитело» или термин «иммуноглобулин» означает интактную (или полноразмерную) молекулу антитела. Фрагменты обозначаются как таковые.

Нумерацию положений аминокислот в пределах молекулы антитела осуществляют с использованием системы нумерации по Kabat (Kabat, H. A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. (U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, Md., 1991), если не указано иное.

В природе антитела являются молекулами гликопротеинов, продуцируемыми В-лимфоцитами. Антитела настоящего изобретения могут продуцироваться В-лимфоцитами, гибридомой, с помощью экспрессии рекомбинантного антитела в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине или с помощью синтетических методов, таких как конструирование антител из существующих антител. Они могут быть или могут не быть гликозилированными. Вообще говоря, антитела связывают антигены с высокой степенью специфичности, и их можно подразделить на основе физических и функциональных свойств на пять классов (или изотипов), обозначаемых IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Эти различные типы антител используют общую основную структурную единицу, которая имеет молекулярную массу, составляющую приблизительно 150000 Дальтон (150 кДа), и составлена из двух идентичных тяжелых (Н) полипептидных цепей и двух идентичных легких (L) цепей, ковалентно связанных посредством межцепочечных дисульфидных (S-S) связей между остатками цистеинов. Интактные антитела настоящего изобретения также имеют эту структуру. Предпочтительно они типа IgG.

В контексте настоящего изобретения «фрагмент антитела» означает любую часть антитела, предпочтительно антигенсвязывающую часть, и включает варианты таких частей. Примерами антигенсвязывающих фрагментов в соответствии с настоящим изобретением являются фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab)₂ и минитела. Варианты таких фрагментов включают димеры и тримеры фрагментов и межфрагментные слияния, получаемые путем использования встречающихся в природе последовательностей шарнирных областей, синтетических последовательностей шарнирных областей, пептидных линкеров, или химические конъюгаты. Фрагменты настоящего изобретения могут быть одновалентными (например, фрагменты Fab), двухвалентными (например, фрагменты F(ab)₂) или поливалентными (например, химический конъюгат, включающий тримерный фрагмент Fab).

Антигеном, с которым специфически связываются антитела и фрагменты AFRA настоящего изобретения, является рецептор фолата альфа человека (αFR). Рецептор фолата имеет три изоформы, альфа, бета и гамма, аминокислотные последовательности которых идентичны на приблизительно 70%. Эти различные изоформы демонстрируют значительные различия в их относительных аффинностях к фолиевой кислоте и являются дифференциально тканеспецифическими и дифференциально увеличенными в нескольких злокачественных образованиях. Альфа-изоформа в норме связана с поверхностью клетки с помощью гликозилфосфатидилинозитного мембранного якоря¹⁵. Она имеет высокую аффинность к фолиевой кислоте, опосредуя интернализацию связанных с рецептором соединений фолата и конъюгатов фолата. Рецептор фолата альфа имеет очень ограниченное распространение в нормальных тканях (т.е. присутствует на ограниченном числе нормальных эпителиальных клеток), но сверхэкспрессируется в карциноме гинекологических тканей, например в карциноме яичника. В соответствии с настоящим изобретением термин «рецептор фолата альфа» является синонимом следующих терминов: FR-альфа; FRα; рецептор 1 фолата; рецептор фолата взрослых; связывающий фолат белок взрослых; FBP; ассоциируемый с опухолью яичника антиген MOv18. В контексте настоящего изобретения термин охватывает рецептор, экспрессируемый на поверхности клетки, и также его растворимую форму. Первичная аминокислотная последовательность рецептора фолата альфа человека продемонстрирована на фиг.10А, а растворимой формы - на фиг.10В.

Важным свойством антител и фрагментов настоящего изобретения является специфичность их связывания с рецептором фолата альфа. Поскольку антитела и фрагменты настоящего изобретения имеют реактивность, наложимую на реактивности С4 и MOv19, они не связываются с бета- и гамма-изоформами рецептора фолата. Термины «специфично связываются» означают, что антитела и фрагменты настоящего изобретения связываются с высокой аффинностью (предпочтительно с K_D, составляющей, по крайней мере, 100 нМ, и наиболее предпочтительно с K_D, составляющей, по крайней мере, 20 нМ) с FRα, экспрессируемым на поверхности клетки млекопитающего, и не связываются с белками, идентичными по той же самой эпитопной области менее чем на 90%, предпочтительно менее чем 95% и наиболее предпочтительно менее чем 98%. Эпитоп, узнаваемый моноклональными антителами настоящего изобретения, может быть эпитопом непрерывного типа или может быть эпитопом прерывистого типа (конформационным), образуемым рецептором при приеме им своей природной конформации на поверхности клетки человека, предпочтительно на поверхности клетки карциномы яичника человека. Например, антитела и фрагменты настоящего изобретения не связываются с белками с общей идентичностью, составляющей менее 90%, предпочтительно менее 95% и наиболее предпочтительно менее 98%. Таким образом, возможно, что антитела и фрагменты настоящего изобретения связываются с белками, имеющими очень высокую степень идентичности с рецептором фолата альфа человека, продемонстрированным на фиг.10А и В, например, аллельными вариантами, имеющими различия в одной - пяти аминокислотах относительно последовательностей на фиг.10, и являющимися по существу идентичными последовательностям на фиг.10 относительно эпитопной области(ей), узнаваемой антителами настоящего изобретения.

Как указано выше, в то время как FRα сверхэкспрессируется в клетках карциномы яичника, он также экспрессируется на некоторых типах нормальных эпителиальных клеток. Однако экспрессия на нормальных клетках происходит на апикальной поверхности, что делает рецептор недоступным для антител настоящего изобретения в in vivo контексте. Следовательно, in vivo антитела и фрагменты настоящего изобретения специфически связываются с FRα, экспрессируемым на клетках карциномы яичника, которые в результате трансформации теряют свою полярность и в которых рецептор фолата альфа затем экспрессируется на всей поверхности клетки (или другой карциномы), и не могут связываться с рецептором, экспрессируемым на поверхности нормальных эпителиальных клеток человека. Напротив, в том случае, когда антитела и фрагменты настоящего изобретения проверяют с помощью in vitro анализов на выделенных нормальных эпителиальных клетках или тканях человека (таких как эпителиальные клетки гипофиза, эндометрия, щитовидной железы или поджелудочной железы) или линиях клеток, экспрессирующих низкие уровни FRα, можно обнаружить специфическое связывание.

Антитела AFRA и фрагменты антител AFRA настоящего изобретения характеризуются специфической легкой цепью, аминокислотная последовательность которой проиллюстрирована на фиг.1 (SEQ ID NO: 1). Иллюстрируемая легкая цепь AFRA имеет структуру, которая является типичной для легкой цепи иммуноглобулинов (L). Действительно, вообще говоря, длина легких цепей (L) составляет приблизительно 220 аминокислот, и на аминоконце легкой цепи находится одна вариабельная область («V_L») (приблизительно 110 аминокислот), а остающаяся карбоксильная половина L-цепи составляет одну константную область («C_L»). Легкая цепь AFRA настоящего изобретения включает 218 аминокислот, при этом N-концевые 113 аминокислот составляют вариабельную область («V_L»), а остающиеся 105 аминокислот карбоксильного конца составляют константную область («C_L»). Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи является уникальной для антитела AFRA настоящего изобретения. Вместе с вариабельной областью связанной тяжелой цепи она образует антигенсвязывающий сайт антитела. Константная область легкой цепи AFRA является типичной легкой цепью каппа.

В то время как легкая цепь антител и фрагментов AFRA настоящего изобретения обычно идентична легкой цепи, проиллюстрированной на фиг.1 и 7, в этой последовательности тем не менее могут быть произведены некоторые изменения без отклонения от настоящего изобретения. Действительно, настоящее изобретение также относится к «происходящим из AFRA антителам» или «происходящим из AFRA фрагментам антител», которые включают легкую цепь, которая функционально эквивалента легкой цепи, проиллюстрированной на фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1). Такая функционально эквивалентная легкая цепь является аминокислотной последовательностью, которая включает легкую цепь, вариабельная область которой включает, по крайней мере, одну из областей легкой цепи AFRA, проиллюстрированной на фиг.1 и 7, определяющую специфичность для рецептора фолата альфа, и которая включает константную область каппа. Области, определяющие специфичность, соответствуют «гипервариабельным» участкам V_L-цепи, которые также называют «определяющими комплементарность участками» (CDR). Эти CDR обозначают CDR1, CDR2 и CDR3 или, альтернативно, L1, L2 и L3. Определяющими комплементарность участками, подтверждаемыми кристаллической структурой Fab, последовательности AFRA (SEQ ID NO: 1) являются

RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3),

QASNKDT (SEQ ID NO: 4),

LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5).

Эти участки проиллюстрированы на фиг.7 жирным шрифтом с подчеркиванием. Таким образом, в соответствии с этим вариантом настоящего изобретения происходящее из AFRA антитело или происходящий из AFRA фрагмент антитела специфически связываются с рецептором фолата альфа (FRα) и включают легкую цепь, вариабельная область которой включает, по крайней мере, одну и предпочтительно две, и более предпочтительно все три из следующих аминокислотных последовательностей:

CDR1: RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 3),

CDR2: QASNKDT (SEQ ID NO: 4),

CDR3: LQSKNFPPYT (SEQ ID NO: 5).

Последовательности CDR, перечисленные выше, предпочтительно присутствуют в происходящей из AFRA легкой цепи в положениях, одинаковых с положениями в исходной легкой цепи AFRA, т.е. CDR1: 24-38; CDR2: 54-60; CDR3: 93-102 (используя систему нумерации по Kabat). Остающаяся последовательность вариабельной области указанной происходящей из AFRA легкой цепи может быть любой каркасной последовательностью, например каркасной последовательностью, которая отличается от последовательности фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1) заменой, делецией или вставкой вплоть до десяти или двадцати аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, и которая при использовании для замены каркасной последовательности легкой цепи AFRA, проиллюстрированной на фиг.1, в антителе или фрагменте антитела, содержащем CDR AFRA, не изменяет качественно специфичность антитела или его фрагмента в отношении рецептора фолата альфа человека. В одном варианте осуществления вариабельная область происходящей из AFRA легкой цепи отличается от последовательности фиг.1 и 7 (SEQ ID NO: 1) заменой, делецией или вставкой вплоть до десяти или двадцати аминокислот, например 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, причем вставки, делеции или замены могут иметь место внутри или вне CDR. Константная область указанной происходящей из AFRA легкой цепи является классической константной областью каппа, например идентичной аминокислотам 114-219 последовательности AFRA на фиг.7 (с двойным подчеркиванием). Предпочтительно эти происходящие из AFRA антитела или происходящие из AFRA фрагменты антител связываются с рецептором фолата альфа (FRα) с аффинностью (K_D), составляющей менее 50 нМ, предпочтительно менее 20 нМ.

Специфичность происходящих из AFRA антител или происходящих из AFRA фрагментов антител, определенных выше, в отношении рецептора фолата альфа можно проверить in vitro и/или in vivo, используя общепринятые экспериментальные средства для демонстрации реактивности с FRα и отсутствия перекрестной реактивности с рецепторными белками, последовательности которых идентичны менее чем на 90%, предпочтительно менее чем на 95%.

Независимо от того, является ли легкая цепь (L) не измененной последовательностью AFRA (SEQ ID NO: 1) или ее производным, описанным выше, антитело или фрагмент в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно, кроме того, включает, по крайней мере, часть тяжелой цепи антитела, например, по крайней мере, вариабельную область (V_H), с первой константной областью, обычно обозначаемой С_Н1, или без нее. Другими частями тяжелой цепи, которые могут быть связаны с легкой цепью настоящего изобретения, являются фрагменты тяжелой цепи, включающие вариабельную область (V_H), первую константную область (С_Н1) и всю шарнирную область или ее часть. В альтернативном случае тяжелая цепь может быть интактной, включающей последовательно V_H, С_Н1, шарнирную область, С_Н2, С_Н3 и необязательно С_Н4. Связь между тяжелой цепью и легкой цепью является в норме ковалентной, посредством дисульфидной связи, включающей цистеин на карбоксильном конце легкой цепи.

В контексте настоящего изобретения различные сегменты тяжелой цепи, которые могут быть связаны с легкой цепью AFRA, определяют следующим образом, имея в виду, что длина тяжелой цепи (Н) интактного иммуноглобулина обычно составляет 440 аминокислот: вариабельная область (V_H) представляет собой амино-концевой участок тяжелой цепи (как правило, приблизительно 110 аминокислот). Остаток тяжелой цепи включает три или четыре (в зависимости от класса тяжелой цепи) повтора из приблизительно 110 аминокислот, которые обладают высокой степенью (по крайней мере 30%) гомологии последовательностей в пределах данного класса. Эти области являются константными областями тяжелой цепи, обозначаемыми С_Н1, С_Н2, С_Н3 и С_Н4. Тяжелая цепь также содержит шарнирную область, расположенную между доменами С_Н1 и С_Н2, придающую гибкость и способность образовывать межцепочечные дисульфидные связи в молекуле. Шарнирная область позволяет двум антигенсвязывающим участкам каждой молекулы антитела независимо перемещаться для связывания антигена.

Вариабельная область тяжелой цепи содержит три гипервариабельных участка, снова называемых «определяющими комплементарность участками» (CDR), обозначаемыми Н1, Н2 и Н3, или, в альтернативном случае, CDR1, CDR2 и CDR3. CDR тяжелой цепи имеют длину, составляющую приблизительно 3-25 аминокислот, и играют важную роль в специфичности антител.

В природе существует пять различных Н-цепей, обозначаемых альфа (α), гамма (γ), дельта (δ), эпсилон (δ) и мю (µ), которые отличаются друг от друга по аминокислотной последовательности. Изотип данного антитела (т.е. принадлежит ли оно классу IgA, IgG, IgD, IgE или IgM) определяют по Н-цепи данного антитела, при этом Н-цепь альфа определяет изотип IgA, Н-цепь гамма определяет изотип IgG и т.д. Внутри класса IgG существует четыре подкласса, обозначаемых IgG1 - IgG4. В соответствии с настоящим изобретением тяжелая цепь антитела AFRA или его фрагмента или варианта может быть любым из этих изотипов, но особенно предпочтительным является изотип IgG, например IgG1.

В зависимости от конкретных подобластей тяжелой цепи, которые присутствуют вместе с легкой цепью AFRA, и, кроме того, в зависимости от того, насколько много субъединиц связаны вместе, антитело и фрагменты антитела настоящего изобретения могут принимать форму интактных антител или, в альтернативном случае, могут быть их антигенсвязывающими фрагментами, такими как фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab)₂ и т.д.

В соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения антитело AFRA, или происходящее из AFRA антитело или фрагмент, представляет собой фрагмент Fab, состоящий из

i) легкой цепи AFRA (как вариабельной области (V_L), так и константной области (C_L)), продемонстрированной на фиг.1 или 7 (SEQ ID NO: 1), или ее производного, определенного выше, и

ii) вариабельной области (V_H) и первой константной области (C_H1) тяжелой цепи.

Предпочтительно легкая цепь и тяжелая цепь ковалентно связаны вместе с помощью дисульфидной связи, в которую вовлечен цистеин карбоксильного конца легкой цепи. Фрагменты Fab настоящего изобретения обычно имеют размер, составляющий приблизительно 55 кДа.

Особенно предпочтительным примером этого варианта осуществления настоящего изобретения является фрагмент Fab, в котором вариабельная область тяжелой цепи (V_H) имеет аминокислотную последовательность фиг.8 (SEQ ID NO: 2). В альтернативном случае вариабельная область тяжелой цепи (V_H) может иметь аминокислотную последовательность, которая включает, по крайней мере, один и предпочтительно два и три участка CDR проиллюстрированной последовательности в каркасной последовательности, которая отличается от каркасной последовательности, проиллюстрированной на фиг.8. Участки CDR последовательности фиг.8 являются следующими:

CDR1: DYAMI (SEQ ID NO: 6),

CDR2: SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 7),

CDR3: ERYDFWSGMDV (SEQ ID NO: 8).

Другим особенно предпочтительным примером этого варианта осуществления настоящего изобретения является фрагмент Fab, в котором константной областью тяжелой цепи (C_H1) является область C_H1 тяжелой цепи гамма, в частности тяжелой цепи гамма1. Пример типичной C_H1 тяжелой цепи проиллюстрирован на фиг.9 (SEQ ID NO: 9).

Соответственно, предпочтительный фрагмент Fab настоящего изобретения включает или состоит из следующих элементов последовательности:

i) легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,

ii) тяжелой цепи, вариабельная область которой имеет аминокислотную последовательность, проиллюстрированную на фиг.8 (SEQ ID NO: 2), и первая константная область (C_H1) которой имеет аминокислотную последовательность, проиллюстрированную на фиг.9 (SEQ ID NO: 9).

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения фрагмент антитела может быть фрагментом Fab'. В контексте настоящего изобретения фрагмент Fab' представляет собой фрагмент Fab, в котором тяжелая цепь дополнительно включает встречающуюся в природе шарнирную область на ее карбоксильном конце, пригодную для ковалентного связывания со вторым фрагментом антитела. Шарнирная область содержит один или несколько аминокислотных остатков или химических групп, которые пригодны для образования ковалентной связи, например свободный цистеин, что делает возможной димеризацию фрагмента Fab'. Шарнирная область может быть, по крайней мере, отчасти встречающейся в природе шарнирной областью антитела, например шарнирной областью, встречающейся в природе в какой-либо одной из тяжелых цепей альфа (α), гамма (γ), дельта (δ), эпсилон (δ) и мю (µ). Особенно предпочтительными являются шарнирные области или их части, соответствующие встречающейся в природе последовательности подкласса гамма, в частности гамма1, такие как пентапептид DKTSC или гексапептид DKTHTC. Часть шарнирной области, используемая для создания фрагмента Fab', обычно содержит, по крайней мере, один остаток свободного цистеина, например, на карбоксильном конце, но может быть сконструирована так, чтобы она содержала два или три остатка свободных цистеинов.

В альтернативном случае фрагмент Fab' может быть подвергнут искусственной димеризации с использованием, например, небелковоподобной составляющей, такой как химический линкер, который придает устойчивость к гидролизу в условии in vivo. Примером такого искусственного линкера является бис(малеимидо)этан (ВМОЕ), но в литературе сообщалось о нескольких других линкерах.^(16),(17)

Преимуществом применения фрагментов Fab' является то, что их можно подвергнуть димеризации с образованием фрагментов F(ab')₂, имеющих два антигенсвязывающих домена. Фрагменты F(ab')₂ являются, следовательно, двухвалентными, с увеличенной авидностью связывания относительно мономера Fab. Два фрагмента Fab', которые составляют димер, соединены вместе с помощью связи между каждой из двух шарнирных областей тяжелых цепей Fab'. Мономеры Fab' можно подвергнуть димеризациии с помощью природного окисления свободных цистеинов на С-конце тяжелых цепей. Фрагменты F(ab')₂ обычно имеют размер, составляющий приблизительно 100 - 110 кДа.

При димеризации с использованием небелковоподобного искусственного линкера два мономера Fab', составляющие димер F(ab')₂, ковалентно связываются друг с другом посредством этого химического линкера. Например, бис(малеимидо)этан (ВМОЕ) дает начало малеимидной связи, являющейся негидролизуемой, и, следовательно, придает устойчивость димеру в условии in vivo.

В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения два антигенсвязывающих домена димера F(ab')₂ могут иметь идентичные специфичности, при этом оба специфически связываются с данным эпитопом рецептора фолата альфа. В альтернативном случае димер F(ab')₂ может быть биспецифическим, при этом один из антигенсвязывающих доменов является специфичным в отношении первого эпитопа рецептора фолата альфа, а другой является специфичным в отношении второго эпитопа рецептора фолата альфа. Дополнительно возможно, что второй антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, полностью отличным от рецептора фолата альфа, таким как второй карциномный антиген или маркер природных киллеров - эффекторных клеток.

Антитела и фрагменты настоящего изобретения предпочтительно являются полностью человеческими. Легкая цепь AFRA настоящего изобретения человеческого происхождения. Поэтому полезно объединять легкую цепь с тяжелой цепью человеческого происхождения. В альтернативном случае легкую цепь AFRA можно сначала объединить с тяжелой цепью нечеловеческого происхождения, например мышиной, и затем для гуманизации тяжелой цепи можно использовать методы конструирования антител.

Антитела и фрагменты настоящего изобретения характеризуются высокой аффинностью связывания и авидностью в отношении рецептора фолата альфа человека. Аффинность связывания представляет собой силу взаимодействия между отдельным антигенсвязывающим сайтом антитела или его фрагмента и своей специфической антигенной детерминантой. Чем выше аффинность, тем крепче связь между антигеном и антителом или фрагментом, и тем вероятнее сохранение антигена в сайте связывания. Термин «авидность» используется для описания общей силы взаимодействия между антигеном и антителом или фрагментом антитела и зависит как от аффинности, так и от валентности взаимодействий. Чем больше антигенсвязывающих сайтов имеет отдельная молекула антитела, тем выше ее авидность в отношении антигена.

Аффинность можно представить в виде константы аффинности К_А, которая представляет собой отношение