F-белок респираторно-синцитиального вируса и его применение

F-белок респираторно-синцитиального вируса и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует F-белок респираторно-синцитиального вируса или фрагмент указанного белка, а также к ее экспрессии в клетке человека, к вариантам молекулы указанной нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, а также их применению в составе вирусных векторов или плазмидных векторов в качестве вакцины.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Еще в 1957 году у детей с тяжелыми заболеваниями нижних дыхательных путей был выявлен вирус, названный респираторно-синцитиальным вирусом (RSV, или РСВ). Данное название относится к характеристике вируса, который вызывает заболевания дыхательных путей и формирует синцитии в условиях in vitro.

РСВ относится к семейству парамиксовирусов, подсемейству пневмовирусов. Так же, как и другие представители этого семейства, РСВ имеет несегментированный, непрерывный РНК геном в ориентации (-) цепи. Геном РСВ имеет размер 15222 основания и находится в комплексе сделками в форме нуклеокапсида.

Вирусный геном кодирует несколько вирусных белков. В их числе мембранные белки, известные как G-белки РСВ и F-белки РСВ. G-белок ответственен за специфическое прикрепление вирусной частицы к поверхности клетки, а F-белок вызывает слияние вируса с клеточной мембраной. F-белок синтезируется в форме полипептида-предшественника F₀ и содержит на N-конце сигнальный пептид, необходимый для транспорта комплекса транслокации к мембране эндоплазматического ретикулума. После того как аминокислотная цепь проникает через мембрану, гидрофобная последовательность на С-конце молекулы осуществляет заякоривание белка F₀ в мембране, и сигнальный пептид отщепляется. После этого белок подвергается гликозилированию во время его транспорта через аппарат Гольджи. В аппарате Гольджи также происходит расщепление белка F₀ на две части - амино-концевую часть F₂ и белок F₁. Сайт расщепления находится между сегментом, состоящим из основных аминокислот, и гидрофобным доменом. Этот гидрофобный домен размером приблизительно 25 аминокислот образует, после расщепления, N-конец белка F₁ и опосредует слияние вируса с клеточной мембраной, которое следует за присоединением вируса к поверхности клетки. Белок F₂ остается соединенным с белком F₁ через дисульфидный мостик.

Антитела, направленные против данного пептида, входящего в состав белка F₁ и опосредующего слияние, могут предотвращать поглощение вируса клеткой и за счет этого обладают нейтрализующим эффектом.

Инфекция вирусом РСВ является высоко контагиозной; в миллилитре слюны содержится до 10⁶ инфекционных вирусных частиц. Вирус передается главным образом воздушно-капельным путем и при прямом контакте инфицированных субъектов. Дети в особенности подвержены заражению в течение зимних месяцев года.

РСВ считается основной инфекционной проблемой первого года жизни. Младенцы в возрасте от шести недель до полугода являются основной группой риска. В возрасте четырех лет у 80% детей присутствуют антитела против вируса.

Тем не менее, повторные инфекции, приводящие к легким формам болезни, также развиваются в более позднем возрасте в результате снижения концентрации антител. Особенно частыми являются внутрибольничные инфекции в больницах, детских садах и клиниках.

Инкубационный период РСВ составляет приблизительно 4-5 дней. Заболевание проявляется в виде гриппозных инфекций с лихорадкой и насморком и представляет угрозу для жизни от легкой до серьезной. Также обычно наблюдают инфекции глотки (фарингиты), трахеи (трахеиты), а также бронхов (бронхиты).

После воздушно-капельной инфекции верхних дыхательных путей вирус воспроизводится в клетках слизистых оболочек и оттуда может проникнуть в течение одного или двух дней в нижние дыхательные пути.

Вакцина против РСВ на настоящий момент неизвестна. Вирусы, убитые формалином, минимально эффективны в этом отношении, так как F-белок разрушается при указанном химическом воздействии, и антитела образуются лишь против G-белка. Хотя такие антитела и способны нейтрализовать вирус, они не могут, тем не менее, препятствовать распространению вирусов через клеточные контакты. Проводится пассивная иммунизация путем применения иммуноглобулинов, однако она связана со значительными затратами и поэтому непригодна для профилактической иммунизации больших групп населения.

Таким образом, продолжает существовать потребность в создании эффективной вакцины против РСВ.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую F-белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или его иммуногенный фрагмент, а также полинуклеотидам, производным указанной молекулы нуклеиновой кислоты, содержание кодонов в которых оптимизировали для эффективной экспрессии F-белка РСВ в клетке-хозяине. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, последовательность нуклеотидов, которая кодирует F-белок РСВ, содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:1 или ее фрагмент. Последовательность нуклеотидов, которая по содержанию кодонов была оптимизирована для экспрессии F-белка в человеческой клетке-хозяине, например, может содержать последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 2 или ее фрагмент.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, последовательность нуклеотидов, которая кодирует F-белок РСВ, состоит из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 1 или ее фрагмента. В альтернативном варианте, последовательность нуклеотидов, которая кодирует F-белок РСВ, состоит из последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 2 с оптимизированным содержанием кодонов или ее фрагмента.

Другие аспекты данного изобретения охватывают молекулы полипептидов, полученные путем экспрессии молекул нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, указанные полипептиды содержат или состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее фрагмента.

Настоящее изобретение также далее относится к вектору, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, согласно настоящему изобретению. Молекулы нуклеиновой кислоты, согласно настоящему изобретению, могут входить в состав вектора в форме (экспрессионной) кассеты, которая, кроме последовательности нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, может также включать последовательность, контролирующую транскрипцию и/или трансляцию, например промотор, функционально связанный с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты. Еще одним дальнейшим аспектом настоящего изобретения являются клетки, содержащие указанный вектор.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, используемый вектор представляет собой вирусный вектор или плазмиду. Особенно предпочтительным является вектор на основе аденовируса, в котором E1-участок по меньшей мере частично удален таким образом, что данный вектор становится неспособным к репликации. Дополнительно, также может быть удален и Е3-участок.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, аденовирусный вектор содержит последовательность нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, в форме экспрессионной кассеты, в которой последовательность нуклеотидов, кодирующая F-белок РСВ, функционально связана с подходящим промотором, например с промотором CMV. Промотор, который применяют в аденовирусном векторе, предпочтительно представляет собой регулируемый промотор, такой как, например, тетрациклиновый промотор, для того, чтобы избежать экспрессии F-белка в клетках, продуцирующих аденовирус. Во всех клетках, не содержащих систему регуляции, промотор активен и экспрессирует F-белок РСВ. Такой аденовирусный вектор можно применять как векторную вакцину.

В дальнейших вариантах реализации настоящее изобретение также охватывает плазмидные векторы, которые содержат последовательности нуклеотидов согласно настоящему изобретению. В одном из вариантов реализации, указанные плазмидные векторы можно применять как челночные векторы, и для этого они содержат участок нуклеиновой кислоты, который делает возможной гомологичную рекомбинацию с подходящей каркасной плазмидой, которая, например, содержит большую часть вирусного генома. Особенно предпочтительной является ситуация, когда челночный вектор содержит аденовирусные последовательности, причем указанные последовательности способствуют гомологичной рекомбинации с другой плазмидой, которая содержит большую часть аденовирусного генома. Таким путем, например, можно создавать вышеупомянутые аденовирусные векторные вакцины.

Еще в одном варианте реализации настоящего изобретения, оно относится к иммуногенной композиции, которая содержит последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 1 или 2, или их фрагменты, в соответствии с настоящим изобретением. В одной из таких композиций последовательность нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, может также присутствовать в форме вышеуказанных векторов, предпочтительно, в форме аденовирусной векторной вакцины. Указанный вектор способствует транспорту молекул нуклеиновых кислот, согласно настоящему изобретению, в клетку человека и экспрессии соответствующего белка. При этом белок экспрессируется в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать требуемый иммунный ответ.

Альтернативно, указанные иммуногенные композиции могут также содержать белки, кодируемые указанными последовательностями нуклеотидов.

В зависимости от желаемого типа применения указанные иммуногенные композиции могут также содержать фармацевтически допустимый носитель и, при необходимости, другие наполнители.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению молекул нуклеиновых кислот, векторов или белков согласно настоящему изобретению для приготовления композиции вакцины для вакцинации субъекта против заболеваний, вызываемых инфекцией РСВ. Субъектом предпочтительно является человек.

Настоящее изобретение также относится к способу получения F-белка РСВ, причем указанный способ включает экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, согласно настоящему изобретению, в подходящей клетке-хозяине. В предпочтительном варианте реализации указанного способа, содержание кодонов в указанной молекуле нуклеиновой кислоты, согласно настоящему изобретению, оптимизировано для экспрессии в клетке-хозяине.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг.1 представлены результаты количественной ОТ-ПЦР для РСВ, в пробах РНК, выделенной из бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) мышей, которых иммунизировали различными конструкциями плазмидной ДНК. Числа над скобками обозначают статистическую значимость различий между единичными результатами сравниваемых групп (использован тест Тьюки).

На Фиг.2 представлены результаты количественной ОТ-ПЦР для РСВ, в пробах РНК, выделенной из бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) мышей, которых иммунизировали различными конструкциями, после инфицирования РСВ. Число копий РСВ при количественной ОТ-ПЦР, стандартизованное путем определения количества РНК, показано для РНК, выделенной из полученных проб БАЛ. Индивидуальные значения, полученные для 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски) представлены для каждого варианта.

На Фиг.3 представлены результаты ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) с использованием IgG антител. Пробы сыворотки, полученные перед первой иммунизацией (prä), после второй иммунизации (post) и после введения вирусных частиц (контрольного заражения - приблизительно 1×10⁷ iE (infektiöse Einheiten; инфекционных частиц) РСВ, выделенных из интраназальных бляшек) в день гибели мышей, иммунизированных различными композициями ((AdV-F_syn: синтетический F-белок, получаемый с РСВ-кодирующей нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, находящийся в составе аденовирусного вектора; AdV-Ova: аденовирусный вектор с нуклеиновой кислотой, кодирующей овальбумин; pcDF_{syn ED}: плазмида, кодирующая эктодомен синтетического (с оптимизированным содержанием кодонов в соответствующей ДНК) F-белка РСВ)), или неиммунизированных мышей, были протестированы с помощью ELISA с IgG-антителами с использованием антител IgG1- и IgG2a, специфичных к РСВ. Интенсивность абсорбции при длине волны 405 нм соответствует титру антител в крови мышей. Показаны каждое из индивидуальных значений, полученных для 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.4 показаны результаты реакции нейтрализации. Были получены серийные разведения проб сыворотки, полученных перед первой иммунизацией (prä), после второй иммунизации (post) и после введения вирусных частиц в день гибели мышей (nC), и затем серия разведении была протестирована в реакции нейтрализации с нейтрализующими антителами против РСВ. В каждом случае приведено наибольшее значение разведения сыворотки, при котором инфекция РСВ ингибировалась за счет нейтрализирующих антител на 50% (IC50). Показаны каждое из индивидуальных значений, полученных для 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.5 показаны результаты количественной ОТ-ПЦР для РСВ в пробах РНК, выделенных из бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) мышей, иммунизированных посредством различных способов введения аденовирусного вектора, согласно настоящему изобретению, причем указанный аденовирусный вектор содержал молекулу нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующую F-белок РСВ. Число копий РСВ, определенной посредством количественной ОТ-ПЦР, стандартизованное путем определения количества РНК, показано для РНК, выделенной из проб БАЛ, отобранных в день гибели. Показаны также каждое из индивидуальных значений, полученных для 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.6 показаны результаты количественной ОТ-ПЦР для РСВ в пробах РНК, выделенных из гомогената легких мышей, иммунизированных аденовирусным вектором различными способами, согласно настоящему изобретению, причем указанный аденовирусный вектор содержал молекулу нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующую F-белок РСВ. Показаны результаты количественной ОТ-ПЦР для РНК, выделенной из гомогената легких, полученного в день гибели мышей. Число копий РСВ при количественной ОТ-ПЦР, стандартизованное путем определения количества РНК, преобразовано в соответствии с содержанием РНК в пробах. Показаны также каждое из индивидуальных значений, полученных для 5 (*) или 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.7 показаны результаты ELISA с IgG-антителами для мышей, иммунизированных аденовирусным вектором различными способами, соответствующим настоящему изобретению, причем указанный аденовирусный вектор содержал молекулу нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующую F-белок РСВ. Пробы сыворотки, полученные перед первой иммунизацией (prä), после первой иммунизации (post I), после второй иммунизации (post II) и, после введения вирусных частиц, в день гибели мышей (nC) тестировали с помощью ELISA с IgG-антителами с использованием антител IgG1 и IgG2a, специфичных к РСВ. Интенсивность абсорбции при длине волны 405 нм соответствует титру антител в крови мышей. Показаны каждое из индивидуальных значений, полученных для 5 (*) или 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.8 показаны результаты реакции нейтрализации для мышей, иммунизированных аденовирусным вектором различными способами, соответствующим настоящему изобретению, причем указанный аденовирусный вектор содержал молекулу нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующую F-белок РСВ. Получали серийные разведения проб сыворотки, полученных перед первой иммунизацией (prä), после первой иммунизации (post I), после второй иммунизации (post II) и, после введения вирусных частиц, в день гибели мышей (nC), и затем серия разведении была протестирована в реакции нейтрализации с нейтрализующими антителами против РСВ. Приведены наибольшие значения разведения для каждой сыворотки, при которых инфекция РСВ ингибировалась на 50% (IC50). Показаны каждое из индивидуальных значений, полученных для 5 (*) или 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.9 показаны результаты количественной ОТ-ПЦР для РСВ в пробах РНК, выделенных из бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) мышей, иммунизированных путем подкожного введения аденовирусного вектора, согласно настоящему изобретению, причем указанный аденовирусный вектор содержал молекулу нуклеиновой кислоты, с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующую F-белок РСВ (AdV-F_syn), в различных дозировках (при возрастающих дозировках). Число копий РСВ при количественной ОТ-ПЦР, стандартизованное путем определения количества РНК, показано для проб РНК из БАЛ, полученных в день гибели мышей. Показаны каждое из индивидуальных значений, полученных для 5 (*) или 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.10 показаны результаты количественной ОТ-ПЦР для РСВ на пробах РНК, выделенной из гомогената легких мышей, иммунизированных путем подкожного введения аденовирусного вектора, согласно настоящему изобретению, причем указанный аденовирусный вектор содержал молекулу нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующую F-белок РСВ (AdV-F_syn), в различных дозировках (при возрастающих дозировках). Показаны результаты количественной ОТ-ПЦР для проб РНК, выделенной из гомогената легких, полученного в день гибели мышей. Число копий РСВ при количественной ОТ-ПЦР, стандартизованное путем определения количества РНК, преобразовано в соответствии с содержанием РНК в пробах. Показаны каждое из индивидуальных значений, полученных для 5 (*) или 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.11 показаны результаты ELISA с IgG-антителами в отношении мышей, иммунизированных путем подкожного введения аденовирусного вектора, согласно настоящему изобретению, причем указанный аденовирусный вектор содержал молекулу нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующую F-белок РСВ (AdV-F_syn), в различных дозировках (при возрастающих дозах). Пробы сыворотки, полученные перед первой иммунизацией (prä), после первой иммунизации (post I), после второй иммунизации (post II) и, после введения вирусных частиц, в день гибели мышей (nC), были протестированы с помощью ELISA с IgG-антителами с использованием антител IgG1 и IgG2a, специфичных к РСВ. Интенсивность абсорбции при длине волны 405 нм соответствует титру антител в крови мышей. Показаны каждое из индивидуальных значений, полученных для 5 (*) или 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.12 демонстрируется результат реакции нейтрализации для мышей, иммунизированных путем подкожного введения аденовирусного вектора, согласно настоящему изобретению, причем указанный аденовирусный вектор содержал молекулу нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующую F-белок РСВ (AdV-F_syn), в различных дозировках (при возрастающих дозировках). Получали серийные разведения пробы сыворотки, полученные перед первой иммунизацией (prä), после первой иммунизации (post I), после второй иммунизации (post II) и, после введения вирусных частиц, в день гибели мышей (nC), и затем серию разведений протестировали в реакции нейтрализации с нейтрализующими антителами против РСВ. Приведены наибольшие значения для каждого разведения сыворотки, при которых инфекция РСВ ингибировалась на 50% (IC50). Показаны каждое из индивидуальных значений, полученных для 5 (*) или 6 мышей (черные символы), а также средние значения (поперечные полоски).

На Фиг.13 приведена карта челночной плазмиды, в которой клонировали молекулу нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующая F-белок, по рестрикционным сайтам HindIII и XhoI; или челночной плазмиды, которую использовали для встраивания молекулы нуклеиновой кислоты с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующей F-белок, и которая содержит тетрациклинзависимый промотор (pS-DP-delta). Данный промотор выключен при помощи генетического переключающего элемента в клетках 293TRex-cells(Invitrogen).

На Фиг.14 показаны различия в экспрессии pFwt (экспрессионной плазмиды с последовательностью ДНК, кодирующей F-белок РСВ дикого типа), pIFwt (экспрессионной плазмиды с последовательностью ДНК, кодирующей F-белок РСВ дикого типа, с дополнительным интроном перед открытой рамкой считывания), pFsyn (экспрессионной плазмиды с последовательностью ДНК с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующей F-белок РСВ) и pIFsyn (экспрессионной плазмиды с последовательностью ДНК с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующей F-белок РСВ, с дополнительным интроном перед открытой рамкой считывания) после трансфекции в клетки Нер2, лизиса клеток спустя 48 часов после трансфекции, разделения белков клеточного лизата путем гель-электрофореза, переноса на нитроцеллюлозную мембрану и детекции с помощью специфических антител (Ab: анти-PCB-F; pcDNA3.1: плазмида без встроенного гена (пустая плазмида); Нер2: клетки без плазмиды; RSV: клетки, инфицированные РСВ (положительный контроль); kD: молекулярный вес в килодальтонах).

На Фиг.15 показаны результаты анализа интенсивности экспрессии. Экспрессию конструкции с оптимизированным содержанием кодонов, кодирующей F-белок РСВ, с интроном перед открытой рамкой считывания (pIFsyn), путем серийных разведении (от 1:10² до 1:10⁴) клеточных лизатов сравнивали с экспрессией плазмиды с последовательностью дикого типа с интроном перед открытой рамкой считывания (pIFwt) в неразведенном клеточном лизате (1:1). Количество белка, полученного при экспрессии конструкции с оптимизированным содержанием кодонов, при разведении в 1000 раз (1:10³) достоверно больше, чем количество белка, полученного с плазмиды с исходной последовательностью (kDa=молекулярный вес в килодальтонах).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом своем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая, содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую F-белок респираторно-синцитиального вируса (РСВ) или фрагмент указанного белка, причем указанная последовательность нуклеотидов содержит SEQ ID NO:1 или ее фрагмент. Данная последовательность отличается от известных последовательностей, кодирующих F-белок РСВ, поскольку имеет нуклеотидную замену в кодирующей последовательности. Эта замена приводит к образованию измененной аминокислотной последовательности F-белка РСВ, в которой в положении 241 находится валин вместо аланина. Такую молекулу нуклеиновой кислоты можно применять в качестве вакцины или в качестве компонента вакцинной композиции.

Термин «фрагмент» по отношению к нуклеиновой кислоте относится к части нуклеотидной последовательности, которая укорочена с 3'- и/или 5'-конца по сравнению с указанной нуклеиновой кислотой. В частности, такие фрагменты имеют размер по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 60, и еще более предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов, и кодируют часть F-белка РСВ, обладающую достаточной иммуногенностью, чтобы вызывать иммунный ответ в организме.

Термины «иммуноген» или «иммуногенность» относятся к способности вещества, например пептида или белка, вызывать иммунный ответ в организме. Иммуногенность вещества можно определить, например, путем обнаружения антител.

С другой стороны, изобретение ориентировано на использование синтетических молекулы нуклеиновой кислоты, образованных из указанной молекулы нуклеиновой кислоты, причем указанные синтетические молекулы нуклеиновой кислоты оптимизированы по содержанию кодонов для экспрессии в организме-хозяине, в ткани-хозяине или клетке-хозяине.

Термин «синтетический» по отношению к нуклеиновой кислоте означает, в пределах настоящего изобретения, что данная молекула нуклеиновой кислоты не существует в природе. Синтетическая молекула нуклеиновой кислоты может быть, например, оптимизирована по содержанию кодонов.

Выражение «оптимизированная по содержанию кодонов» по отношению к нуклеиновой кислоте обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, последовательность которой искусственно изменена таким образом, что повышен уровень ее экспрессии в организме-хозяине, т.е. образуется большее количество белка, который кодирует данная молекула нуклеиновой кислоты.

Ранее, попытки вызвать экспрессию F-белка респираторно-синцитиального вируса (РСВ) путем трансфекции экспрессионных плазмид, зависимых от полимеразы II, не приводили к успеху.

Клетки эукариот отличаются от клеток прокариот более выраженной компартментализацией внутриклеточного пространства для обеспечения прохождения сложных ферментативных реакций, необходимых для эффективной экспрессии белков, клеточного метаболизма и/или деления клетки. Ключевой особенностью репликации любого вируса является адаптация к клетке-хозяину и, в частности, к системе экспрессии клетки-хозяина. РНК-вирусы, которые реплицируются в цитоплазме клеток, являющихся их хозяевами, эволюционно развивались в условиях, существующих в цитоплазме клеток-хозяев. Так, собственная система транскрипции этих вирусов включает РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая осуществляет синтез мРНК на матрице геномной РНК. По этой причине цитоплазматические РНК-вирусы не приспособлены к сложной среде ядра эукариотической клетки-хозяина. Таким образом, неэффективную экспрессию вирусных генов под контролем эукариотических промоторов можно объяснить отсутствием в этих генах элементов, необходимых для стабилизации пре-мРНК, процессинга мРНК и/или экспорта мРНК из ядра. Эффективной экспрессии вирусных генов можно достичь, изменив кодоны в вирусных генах на кодоны, более часто используемые в клетке-хозяине.

Для этой цели на основе последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1, согласно настоящему изобретению, была получена синтетическая последовательность, оптимизированная по содержанию кодонов, которая транслируется в идентичную белковую последовательность, но в которой присутствуют альтернативные варианты кодонов. В соответствии с данным изобретением, способ оптимизации кодонов включает следующие этапы: идентификация позиций кодонов в определенной открытой рамке считывания; сравнение частоты использования определенного кодона в организме-хозяине; в случае, если такой кодон используется не часто, замещение данного кодона кодоном, оптимальным для экспрессии; повторение этого процесса в отношении всего фрагмента гена; проверка новой последовательности гена в отношении отсутствия нежелательных последовательностей, которые могли появиться в результате замены кодонов, таких как, например, сайты полиаденилирования, нежелательные сайты рестрикции, сайты распознавания сплайсинга интронов и т.д.; сборка синтетических фрагментов гена и тестирование экспрессии в организме-хозяине или в клетке-хозяине.

Одним из примеров синтетической последовательности нуклеиновой кислоты, полученной в соответствии с указанным способом и оптимизированной по содержанию кодонов для экспрессии в клетках человека, содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:2 или состоит из указанной последовательности. В настоящем изобретении также рассматривают фрагменты указанной последовательности нуклеотидов, кодирующие части F-белка РСВ.

Применение нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 позволило авторам настоящего изобретения добиться увеличения уровня экспрессии F-белка РСВ в клетках человека в 1000 раз, по сравнению с уровнем экспрессии, наблюдаемой при использовании последовательности дикого типа SEQ ID NO:1.

После оптимизации содержания кодонов последовательность встраивают в экспрессионную кассету, которая дополнительно содержит последовательности, способствующие эффективной экспрессии кодируемого белка в клетке-хозяине, предпочтительно в клетке человека. Такая экспрессионная кассета может содержать последовательность нуклеотидов, оптимизированную по содержанию кодонов, функционально связанную с последовательностями контроля транскрипции и трансляции, например с последовательностями промотора и/или терминатора.

Термин «кассета» или «экспрессионная кассета» относится к последовательностям нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, которые содержат последовательности нуклеотидов, которые будут экспрессироваться. Благодаря наличию сайтов рестрикции на 5'- и 3'-концах последовательностей данную кассету/экспрессионную кассету можно легко встроить в вектор или плазмиду, а также удалить или переместить. Кроме кодирующей последовательности нуклеотидов, экспрессионная кассета обычно содержит последовательности контроля транскрипции и трансляции, например последовательности промотора и/или терминатора транскрипции, которые функционально связаны с последовательностью нуклеотидов и которые способствуют ее экспрессии в клетке-хозяине.

Термин «промотор» в настоящей заявке относится к участку цепи ДНК, который распознает РНК-полимераза. После того как РНК-полимераза распознает промоторный участок, образуется инициирующий комплекс, включающий связанную РНК-полимеразу, и начинается транскрипция. Существуют дополнительные регуляторы инициирующего комплекса, например активирующие последовательности (энхансеры) или ингибирущие последовательности(сайленсеры).

Подходящим промотором для осуществления экспрессии последовательностей нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, является, например, CMV (промотор цитомегаловируса). Данный промотор может быть соединен с последовательностью нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, в экспрессионной кассете для экспрессии в клетках человека.

В вектор можно встроить указанную экспрессионную кассету, содержащую последовательность нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, соединенную с дополнительными последовательностями, необходимыми для экспрессии в клетке-хозяине.

Термин «вектор» относится к средствам, с помощью которых молекулы ДНК можно переносить в организм, или ткань, или клетку-хозяин. Существуют различные типы векторов, которые включают, например, плазмиды, космиды, вирусы, например аденовирусы, и бактериофаги.

Вектор, полученный таким образом, также входит в объем настоящего изобретения. Вектор предпочтительно представляет собой плазмидный или вирусный вектор, в частности аденовирусный вектор.

Аденовирусный вектор, который содержит последовательность нуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, может включать участок, содержащий нефункциональный ген Е1, чтобы не допустить репликации вируса и выработки инфекционных вирусных частиц в клетке-хозяине. Предпочтительно, участок, содержащий ген Е1, удален или замещен вставкой экспрессионной кассеты. Дополнительно, такой вектор может также не иметь участка, содержащего ген Е3, который в норме ответственен за взаимодействие с иммунной системой хозяина. Такие рекомбинантные аденовирусы, например, описанные в патенте US 5,922,576, можно размножать в известных клеточных линиях («упаковочные линии»), например, 293-, 911- или PerC.6 клетки, которые экспрессируют вирусный ген Е1.

Для того чтобы получить такой аденовирусный вектор, экспрессионную кассету, которая содержит последовательность нуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, можно встроить в плазмидный вектор, например, используя подходящие сайты рестрикции. Такой плазмидный вектор может содержать нуклеотидные последовательности аденовируса, которые обеспечивают гомологичную рекомбинацию с подходящей (каркасной) плазмидой, содержащей большую часть генома аденовируса. За счет рекомбинации можно затем получить аденовирусную челночную плазмиду, содержащую последовательность нуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, в форме экспрессионной кассеты. Такая аденовирусная челночная плазмида способна, например, обеспечивать регулируемую экспрессию встроенной в нее нуклеотидной последовательности, в соответствии с настоящим изобретением. Указанным способом может быть получено большое количество аденовирусных векторов. Затем такие аденовирусные векторы можно использовать в качестве вакцинирующих векторов.

Для создания аденовирусных векторов, экспрессирующих F-белок, можно заменить промотор CMV на регулируемый промотор. При наличии такого промотора вектор можно поддерживать в клетках, которые содержат систему регуляции экспрессии F-белка РСВ, например, экспрессионную систему, регулируемую тетрациклином (клетки 293TRex). Например, клетки 293TRex используют для продукции и поддержания аденовирусного вектора.

Регулируемые промоторы - это промоторы, которые приводят к измененной экспрессии трансгена, с которым они соединены, при воздействии некоторых веществ, например при действии антибиотиков или белков, которые связываются со специфичной последовательностью ДНК. К таким регулируемым промоторам относится, например, промотор CMV, имеющий сайты связывания репрессора - тетрациклина (тетрациклин-регулируемый промотор), промотор, регулирующий экспрессию в зависимости от присутствия стероида экдизона, а также другие регулируемые экспрессионные системы.

Настоящее изобретение, таким образом, также в одном из своих аспектов относится к плазмидам, например описанным выше челночным плазмидам и аденовирусным векторам, содержащим нуклеотидные последовательности, согласно настоящему изобретению. Аденовирусный вектор должен предпочтительно содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2 или фрагмент этой последовательности в форме экспрессионной кассеты с промотором, например промотором CMV. Особенно предпочтителен для настоящего изобретения аденовирусный вектор AdV-F_syn.

Стандартные молекулярно-биологические подходы, которые применяют для приготовления и очистки конструкций ДНК, в соответствии с настоящим изобретением для приготовления аденовирусов и аденовирусных векторов, а также челночных плазмид, известны специалистам в данной области.

Аденовирусные векторы или плазмиды, которые содержат последовательность нуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, можно применять в отношении субъекта, например человека, для того, чтобы вызвать иммунный ответ против РСВ.

Соответственно, в одном из своих дальнейших аспектов настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, которые содержат последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:1 или 2, в соответствии с настоящим изобретением, или фрагменты данных последовательностей. В одной из таких композиций, последовательность нуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, может быть представлена в форме вышеупомянутых плазмид или векторов, предпочтительно в форме аденовирусного вектора. Один из таких векторов обеспечивает транспорт молекул нуклеиновой кислоты, в соответствии с настоящим изобретением, в клетки человека, и экспрессию белка, который он кодирует. При этом белок экспрессируется в количестве, достаточном для того, чтобы вызвать соответствующий иммунный ответ.

Альтернативно, иммуногенные композиции могут также содержать белок, который кодируют указанные последовательности нуклеотидов.

В зависимости от желательного типа применения, иммуногенные композиции могут также содержать фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. Среди других веществ, наполнители также включают известные адъюванты.

Указанные иммуногенные композиции можно вводить различными способами, которые известны специалисту в данной области и которые включают, например, пероральные дозированные формы, например таблетки, капсулы, порошки, гранулы, растворы, суспензии, сиропы и эмульсии, или, альтернативно, инъекции, например внутривенные, внутрибрюшинные, подкожные или внутримышечные инъекции. Также возможно применение путем ингаляций или интраназально. Все указанные способы применения известны специалисту в данной области. Предпочтительными способами приме