Препарат вакцины на основе конъюгата никотин-носитель

Препарат вакцины на основе конъюгата никотин-носитель

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, вакцин и фармацевтических препаратов. В изобретении предложены препараты, которые содержат конъюгат никотина и вирусоподобной частицы и стабилизатор, где стабилизатор содержит нередуцирующий дисахарид и неионогенное поверхностно-активное вещество. Лиофилизированные препараты сохраняют стабильность после длительного хранения при комнатной температуре.

Ссылки на родственные заявки

В настоящее время внимание общественности привлекли вакцины для лечения или предупреждения привыкания к никотину. Эти вакцины, как правило, содержат молекулы никотина, ковалентно связанные с носителем, поскольку никотин представляет собой низкомолекулярное органическое соединение и сам по себе не может вызывать иммунный ответ. Кроме того, поскольку у никотина отсутствуют пригодные для такой связи с носителем функциональные группы, то, как правило, требуется интродукция связующей последовательности в молекулы никотина. В настоящее время имеются сведения о создании нескольких вакцин, см., например, US 5876727, US 6232082, US 6656469 и US 6932971. Описанные конъюгаты различаются не только природой носителя, но также природой связующей последовательности и сайтом в молекуле никотина, в который интродуцируют связующую последовательность.

В US 6932971 описано сочетание молекул никотина с вирусоподобной частицей (ВПЧ) с помощью связующей последовательности со сложноэфирной функциональной группой, что приводит к получению упорядоченного и повторяющегося конюъгата никотин-носитель и позволяет получать высокий титр специфических антител к никотину. В настоящее время эти же авторы установили, что вакцину, которая содержит вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Qβ, с которой молекулы никотина ковалентно сцеплены с помощью связующей последовательности, несущей сложноэфирную функциональную группу, можно эффективно применять для отказа людей от курения (Maurer и др., Eur. J. Immun., 35, 2005, cc. 2031-2040).

Требования, заключающиеся в том, чтобы композиции вакцин обладали стабильностью и чтобы химическое и/или физическое расщепление было минимальным или отсутствовало, обусловливают необходимость в разработке препаратов, удовлетворяющих указанным требованиям.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании изобретения неожиданно было установлено, что можно создавать лиофилизированный препарат, который стабилизирует конъюгаты никотин-вирусоподобная частица, содержащие молекулы никотина, которые ковалентно связаны с вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, несущей по меньшей мере одну функциональную группу эфира карбоновой кислоты. Кроме того, при создании изобретения неожиданно было установлено, что этот лиофилизированный препарат сохраняет стабильность в течение длительного периода хранения при комнатной температуре или даже при повышенной температуре (40°С). Кроме того, лиофилизированный препарат, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит простую и экономичную композицию стабилизатора благодаря минимальному количеству входящих в ее состав эксципиентов.

Таким образом, одним из объектов изобретения является лиофилизированный препарат, содержащий: (I) по меньшей мере один конъюгат никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композицию стабилизатора, включающую: (в) по меньшей мере один нередуцирующий дисахарид, причем концентрация нередуцирующего дисахарида составляет от 0,5 до 15% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) по меньшей мере одно неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет от 5,4 до 6,6.

Следующим объектом изобретения является способ приготовления лиофилизированного препарата, предлагаемого в изобретении.

И еще одним объектом изобретения является восстановленный препарат, содержащий лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, растворенный и/или суспендированный в физиологически приемлемом растворе или в стерильной воде, предпочтительно в воде для инъекций (WFI). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения восстановленный препарат может содержать также адъювант.

Подробное описание изобретения

Если не указано иное, все технические и научные понятия, употребляемые в настоящем описании, имеют общепринятые значения, которые очевидны специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение.

Адъювант. Понятие «адъювант» в контексте настоящего описания относится к неспецифическим стимуляторам иммунного ответа или субстанциям, которые обеспечивают образование депо в хозяине и при объединении с вакциной и фармацевтической композицией соответственно, предлагаемыми в настоящем изобретении, могут еще в большей степени усиливать иммунный ответ. Можно применять различные адъюванты. Предпочтительными адъювантами являются полный и неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия и модифицированный мурамилдипептид. Кроме того, в качестве адъювантов можно применять минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол, а также адъюванты, которые можно применять для введения человеку, такие как БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Такие адъюванты также хорошо известны в данной области. К другим адъювантам, которые можно вводить в сочетании с композициями, предлагаемыми в изобретении, относятся (но не ограничиваясь только ими) монофосфорильный липидный иммуномодулятор, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, соли алюминия (квасцы), MF-59, ОМ-174, ОМ-197, ОМ-294 и адъюванты, созданные на основе виросомальной технологии (Virosomal adjuvant technology). Адъюванты могут также представлять собой смеси указанных субстанций. ВПЧ, как правило, относят к адъюванту. Однако в контексте настоящего описания понятие «адъювант» относится к адъюванту, который не представляет собой ВПЧ, применяемую в предлагаемом в изобретении препарате, а относится к дополнительному, отличному от ВПЧ компоненту.

Оболочечный белок. В контексте настоящего описания понятие «оболочечный белок» и понятие «капсидный белок», которые используются взаимозаменяемо в контексте настоящего описания, относятся к вирусному белку, предпочтительно субъединице встречающегося в естественных условиях капсида вируса, предпочтительно РНКового бактериофага, который обладает способностью встраиваться в вирусный капсид или ВПЧ.

Препарат до лиофилизации. Понятие «препарат до лиофилизации» относится к жидкому препарату, предлагаемому в настоящем изобретении, который подлежит процессу лиофилизации, как правило и предпочтительно, не позднее чем через 24 ч, а также, как правило и предпочтительно, не позднее чем через 8 ч и еще более часто и предпочтительно не позднее чем через 2-4 ч после рассматриваемого момента времени. Понятие «процесс лиофилизации» и понятие «процесс сушки вымораживанием» используются взаимозаменяемо в контексте настоящего описания и должны рассматриваться как синонимы.

Лиофилизированный препарат. Понятие «лиофилизированный препарат» относится к композиции, полученной или которую можно получать с помощью процесса сушки вымораживанием жидкого препарата. Как правило и предпочтительно, он представляет собой твердую композицию, содержание воды в которой менее 5%, предпочтительно менее 3%. Предпочтительно понятие «лиофилизированный препарат» относится к композиции, полученной или которую можно получать с помощью процесса изготовления лиофилизированного препарата, предлагаемого в настоящем изобретении.

Восстановленный препарат. Понятие «восстановленный препарат» относится к жидкому препарату, полученному в результате растворения и/или суспендирования лиофилизированного препарата в физиологически приемлемом растворе.

Связующая последовательность. Понятие «связующая последовательность» в контексте настоящего описания относится к молекулярному элементу, который ковалентно связывает молекулу никотина с вирусоподобной частицей.

Комнатная температура. Понятие «комнатная температура» в контексте настоящего описания относится к температуре от 15 до 30°С, предпочтительно от 20 до 27°С, более предпочтительно 25°С.

Стабильный. Понятие «стабильный» в контексте настоящего описания относится к состоянию лиофилизированного препарата, предлагаемого в изобретении, который содержит конъюгаты никотин-ВПЧ, предпочтительно содержит конъюгаты никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Qβ и еще более предпочтительно содержит Nic-Qβ, в котором при хранении вплоть до 15 недель, предпочтительно вплоть до 20 недель, более предпочтительно вплоть до 25 недель при комнатной температуре или повышенной температуре (40°С) (I) общее содержание свободного никотина и производных никотина составляет менее 7%, предпочтительно менее 5%, более предпочтительно менее 3%, еще более предпочтительно менее 2% от общего содержания никотина в препарате и (II) суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ, предпочтительно суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Qβ, предпочтительно суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Qβ, не превышает более чем на 10%, предпочтительно на 7%, более предпочтительно на 4% суммарное количество олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ, предпочтительно суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Qβ, предпочтительно суммарное содержание олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Qβ, в препарате до лиофилизации. Согласно настоящему описанию суммарное количество олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ в препарате после хранения за вычетом суммарного количества олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ до лиофилизации соответствует проценту увеличения. Например, если в препарате до лиофилизации присутствует 1% олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Qβ, a после лиофилизации согласно настоящему изобретению и 15-недельного хранения присутствует 4% олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Qβ, то процент увеличения составляет 3%. Понятие «свободный никотин и производные никотина» в контексте настоящего описания относится к никотину и производным никотина, которые не связаны ковалентно с вирусоподобной частицей, предлагаемой в изобретении. Метод определения общего количества никотина, а также свободного никотина или производных никотина предпочтительно представляет собой ОФ-ЖХВР-анализ, изложенный в примере 1 в настоящем описании. Метод определения суммарного количества олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ, предпочтительно суммарного содержания олигомеров и агрегатов конъюгатов никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Qβ, предпочтительно суммарного содержания олигомеров и агрегатов конъюгатов Nic-Qβ, предпочтительно представляет собой анализ фракционирования потока в поле асимметричного потока (AF4), изложенный в примере 1 в настоящем описании, в котором фракции, содержащие частицы, более крупные, чем мономеры и димеры конъюгатов никотин-ВПЧ, предпочтительно более крупные, чем мономеры и димеры конъюгатов никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Qβ, предпочтительно более крупные, чем мономеры и димеры конъюгатов Nic-Qβ, объединяют при расчете.

Олигомер. Понятие «олигомер» в контексте «олигомер конъюгата никотин-ВПЧ», «олигомер конъюгата никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Qβ» и «олигомер конъюгата Nic-Qβ» относится к агрегации по меньшей мере трех и вплоть до десяти ВПЧ или ВПЧ Qβ соответственно.

Агрегат. Понятие «агрегат» в контексте «агрегат конъюгата никотин-ВПЧ», «агрегат конъюгата никотин-ВПЧ из РНКового бактериофага Qβ» и «агрегат конъюгата Nic-Qβ» относится к агрегации по меньшей мере десяти ВПЧ или ВПЧ Qβ соответственно.

Вирусная частица. Понятие «вирусная частица» в контексте настоящего описания относится к морфологический форме вируса. У некоторых типов вируса она содержит геном, окруженный капсидным белком; у других имеет дополнительные структуры (например, оболочки, хвосты и т.д.).

Вирусоподобная частица (ВПЧ) в контексте настоящего описания относится к нерепликативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной вирусной частице, или относится к нерепликативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной структуре, напоминающей вирусную частицу, предпочтительно капсид вируса. Понятие «нерепликативный» в контексте настоящего описания обозначает отсутствие у генома, входящего в ВПЧ, способности к репликации. Понятие «неинфекционный» в контексте настоящего описания обозначает неспособность проникать в клетку-хозяина. Предпочтительно вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, является нерепликативной и/или неинфекционной, поскольку у нее отсутствует полностью или частично вирусный геном или функции генома. В одном из вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой вирусную частицу, в которой вирусный геном инактивирован физически или химически. Как правило и более предпочтительно, у вирусоподобной частицы отсутствуют все или часть репликативных и инфекционных компонентов вирусного генома. Вирусоподобная частица, предлагаемая в изобретении, может содержать нуклеиновую кислоту из генома, отличного от ее генома. Обычным и предпочтительным вариантом вирусоподобной частицы, предлагаемой в настоящем изобретении, является вирусный капсид, такой как вирусный капсид соответствующего вируса, бактериофага, предпочтительно РНКового фага. Понятия «вирусный капсид» или «капсид» относятся к макромолекулярной структуре, состоящей из субъединиц вирусного белка. Как правило, они состоят из 60, 120, 180, 240, 300, 360 и более субъединиц вирусного белка. Как правило и предпочтительно, взаимодействия этих субъединиц приводят к формированию вирусного капсида или напоминающей вирусной капсид структуры с присущей ей повторяющейся организацией, при этом структура, как правило, является сферической или трубчатой. Например, капсиды РНКовых бактериофагов или HbcAg (внутренний (коровый) антиген вируса гепатита В) имеют сферическую форму, обладающую икосаэдральной симметрией. Понятие «капсидоподобная структура» в контексте настоящего описания относится к макромолекулярной структуре, состоящей из субъединиц вирусного белка, которая имеет морфологическое строение, сходное с капсидом, как он определен выше, но не имеет характерного симметричного строения, сохраняя при этом достаточную упорядоченность и частоту встречаемости. Одной из общих характерных особенностей вирусной частицы и вирусоподобной частицы является высокая упорядоченность и повторяемость строения их субъединиц.

Вирусоподобная частица РНКового бактериофага. В контексте настоящего описания понятие «вирусоподобная частица РНКового бактериофага» относится к вирусоподобной частице, содержащей или предпочтительно практически состоящей или состоящей из оболочечных белков, их мутантов или фрагментов РНКового бактериофага. Кроме того, вирусоподобная частица РНКового бактериофага, имея структуру РНКового бактериофага, является нерепликативной или неинфекционной, и, как правило, у нее отсутствуют ген или гены, кодирующие комплекс репликации РНКового бактериофага, и, как правило, она лишена также гена или генов, кодирующих белок или белки, которые ответственны за связывание вируса с хозяином или за проникновение в хозяина. Однако под это определение подпадают также вирусоподобные частицы РНКовых бактериофагов, в которых вышеупомянутый(ые) ген(ы) еще присутствует(ют), но является(ются) неактивным(и), и вследствие этого такие частицы также представляют собой нерепликативные и неинфекционные вирусоподобные частицы РНКового бактериофага. Предпочтительные ВПЧ, выведенные из РНКовых бактериофагов, обладают икосаэдральной симметрией и состоят из 180 субъединиц. В контексте настоящего описания понятия «субъединица» и «мономер» используют взаимозаменяемо, и они являются эквивалентными. Предпочтительными методами, с помощью которых вирусоподобной частице РНКового бактериофага придают нерепликативность и/или неинфекционность, являются физическая, химическая инактивация, например УФ-облучение, обработка формальдегидом, как правило и предпочтительно, генетическая манипуляция.

Один или несколько. В контексте настоящего описания упоминание единственного числа может обозначать «по меньшей мере один» или «один или несколько», если не указано иное.

Одним из объектов изобретения является лиофилизированный препарат, содержащий: (I) по меньшей мере один конъюгат никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной вирусоподобной частицей с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композицию стабилизатора, включающую: (в) по меньшей мере один нередуцирующий дисахарид, причем концентрация нередуцирующего дисахарида составляет от 0,5 до 15% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации; (г) по меньшей мере одно неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате до лиофилизации и где значение рН композиции стабилизатора до лиофилизации составляет от 5,4 до 6,6. В данной области известно, что лиофилизация белковой композиции обычно приводит к получению более стабильного и в результате имеющего более длинное время пролужизни продукта. Кроме того, лиофилизированный препарат имеет повышенную стабильность сложноэфирной функциональной группы, которая присутствует в конъюгате никотин-ВПЧ, и повышенную стабильность компонента, представляющего собой РНК.

Другим объектом изобретения является жидкий препарат, содержащий: (I) по меньшей мере один конъюгат никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной ВПЧ с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композицию стабилизатора, которая содержит (в) по меньшей мере один, предпочтительно один нередуцирующий дисахарид, причем концентрация указанного нередуцирующего дисахарида составляет от 0,5 до 15% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате, (г) по меньшей мере одно, предпочтительно одно индивидуальное неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате и где значение рН композиции стабилизатора составляет от 5,4 до 6,6. Кроме того, объектом изобретения является препарат, который можно получать с помощью способа лиофилизации, включающего стадию замораживания указанного жидкого препарата и сушки указанного жидкого препарата.

Еще одним объектом изобретения является жидкий препарат, содержащий: (I) по меньшей мере один конъюгат никотин-вирусоподобная частица, который включает: (а) вирусоподобную частицу и (б) по меньшей мере одну молекулу никотина, где указанная по меньшей мере одна молекула никотина ковалентно связана с указанной ВПЧ с помощью связующей последовательности, где указанная связующая последовательность содержит сложноэфирную функциональную группу; и (II) композицию стабилизатора, которая содержит или представляет собой (в) по меньшей мере одно, предпочтительно одно индивидуальное неионогенное поверхностно-активное вещество, причем концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0005 до 0,1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в препарате и где значение рН композиции стабилизатора составляет от 5,4 до 6,6.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения жидкий или лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, содержит только один углевод, предпочтительно только один сахар, где сахар предпочтительно представляет собой нередуцирующий дисахарид. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения жидкий или лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, не содержит дополнительную аминокислоту. Это означает, что в препарат не вводят никакую дополнительную аминокислоту. Однако препарат может содержать следовые количества аминокислот из-за расщепления вирусоподобной частицы.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения жидкий или лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, не содержит бычий сывороточный альбумин или человеческий сывороточный альбумин. В следующем предпочтительном варианте осуществления изобретения препарат, предлагаемый в изобретении, не содержит сывороточный белок любого типа. Преимуществом исключения сыворотки является отсутствие потенциальных проблем, связанных с загрязнением препарата.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения жидкий или лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, в частности лиофилизированный препарат, предлагаемый в изобретении, не содержит хлорида натрия. Исключение NaCl позволяет избежать высокой осмолярности препарата, которая не является необходимой. Кроме того, исключение соли позволяет устранить также возможные побочные действия на стабильность белка в процессе лиофилизации.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения по меньшей мере один, предпочтительно один индивидуальный нередуцирующий дисахарид, представляет собой сахарозу или трегалозу. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения нередуцирующий дисахарид представляет собой трегалозу.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения концентрация по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида, составляет от 3 до 15% (мас./об.), предпочтительно от 5 до 12% (мас./об.), предпочтительно от 5 до 10% (мас./об.), предпочтительно от 7,5 до 10% (мас./об.), предпочтительно 10% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата концентрацию в препарате до лиофилизации. В контексте настоящего описания, если специально не указано иное, концентрация трегалозы относится к концентрации дигидрата (2H₂O) трегалозы. Специалисту в данной области очевидно, как пересчитать концентрацию дигидрата трегалозы на концентрацию безводной трегалозы. Например, 10% дигидрата трегалозы соответствует 9% безводной трегалозы.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения композиция стабилизатора, присутствующая в жидком или лиофилизированном препарате, предлагаемом в изобретении, предпочтительно лиофилизированном препарате, содержит также один, предпочтительно один индивидуальный наполнитель. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного нередуцирующего дисахарида и наполнителя составляет от 0,5 до 15% (мас./об.) при условии, что концентрация нередуцирующего дисахарида составляет по меньшей мере 0,5% (мас./об.), предпочтительно по меньшей мере 1% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата в препарате до лиофилизации. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя составляет от 3 до 10%, предпочтительно от 3 до 8%, предпочтительно от 3 до 7%, предпочтительно от 4,5 до 7%, более предпочтительно от 4,5 до 6% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата в препарате до лиофилизации.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя в препарате до лиофилизации составляет от 3 до 10% (мас./об.), предпочтительно от 4,5 до 7% (мас./об.), при этом концентрация указанного нередуцирующего дисахарида составляет по меньшей мере 1% (мас./об.). Предпочтительно осмолярность препарата составляет от 250 до 350 мОсм/кг, более предпочтительно примерно 300 мОсм/кг.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя в препарате до лиофилизации составляет 3 до 10% (мас./об.), предпочтительно от 4,5 до 7% (мас./об.), при этом концентрация указанного наполнителя составляет по меньшей мере 1% (мас./об.). Предпочтительно осмолярность препарата составляет от 250 до 350 мОсм/кг, более предпочтительно примерно 300 мОсм/кг.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя в препарате до лиофилизации составляет от 3 до 10% (мас./об.), предпочтительно от 4,5 до 7% (мас./об.), при этом концентрация указанного наполнителя составляет по меньшей мере 1% (мас./об.), а концентрация указанного нерудуцирующего дисахарида составляет по меньшей мере 1% (мас./об.). Предпочтительно осмолярность препарата составляет от 250 до 350 мОсм/кг, более предпочтительно примерно 300 мОсм/кг.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения нерудуцирующий дисахарид представляет собой трегалозу, а наполнитель представляет собой маннит.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения общая концентрация указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального нередуцирующего дисахарида и указанного по меньшей мере одного, предпочтительно одного индивидуального наполнителя в препарате до лиофилизации составляет от 5,0 до 6,5% (мас./об.). В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение между наполнителем и нерудуцирующим дисахаридом составляет от 3,5:1 до 4,5:1, предпочтительно 4:1. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения нерудуцирующий дисахарид представляет собой трегалозу, а наполнитель представляет собой маннит. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация трегалозы составляет 1,1% (мас./об.), а концентрация маннита составляет 4,4% (мас./об.) в препарате до лиофилизации.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения наполнитель представляет собой маннит или глицин. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения наполнитель представляет собой маннит. Включение наполнителя, предпочтительно маннита, способствует получению стабильной структуры «кейка» («cake») и может позволять использовать более высокую начальную температуру сушки в процессе лиофилизации, преимуществом этого является снижение стоимости производства.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения значение рН композиции стабилизатора составляет от 5,4 до 6,6, предпочтительно от 5,6 до 6,4, предпочтительно от 5,8 до 6,4, предпочтительно от 6,0 до 6,4, предпочтительно 6,2. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения значение рН составляет 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5 и 6,6.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,0025 до 0,02% (мас./об.), предпочтительно от 0,0025 до 0,01% (мас./об.), предпочтительно 0,005% (мас./об.), где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата концентрацию в препарате до лиофилизации.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20 или полисорбат 80. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения неионогенное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 20.

Вирусоподобные частицы могут представлять собой любой вирус, известный в данной области, обладающий упорядоченной и повторяющейся структурой. Примеры ДНКовых или РНКовых вирусов, оболочечный или капсидный белок которых можно применять для получения ВПЧ, описаны в WO 2004/009124 на странице 25, строки 10-21, на странице 26, строки 11-28, и на странице 28, строка 4, до страницы 31, строка 4. Указанный документ включен в настоящее описание в качестве ссылки.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой вирус, выбранный из группы, включающей а) РНКовые бактериофаги; б) бактериофаги; в) вирус гепатита В, предпочтительно его капсидный белок (Ulrich и др., Virus Res. 50, 1998, сс.141-182) или его поверхностный белок (WO 92/11291); г) вирус кори (Warnes и др., Gene 160, 1995, cc.173-178); д) вирус Синдбис; е) ротавирус (US 5071651 и US 5374426); ж) вирус ящура (Twomey и др., Vaccine 13, 1995, cc.1603-1610); з) вирус Норвалка (Jiang X. и др., Science 250, 1990, cc.1580-1583; Matsui S.M. и др., J.Clin. Invest. 87, 1991, cc.1456-1461); и) альфавирус; к) ретровирус, предпочтительно его белок GAG (WO 96/30523); л) ретротранспозон Ту, предпочтительно белок р1; м) вирус человеческой папилломы (WO 98/15631); н) вирус полиомы; о) вирус табачной мозаики; п) вирус мозаики коровьего гороха; р) вирус домашних стад; с) вирус хлорозной крапчатости коровьего гороха и т) вирус мозаики люцерны. Методы получения ВПЧ на основе вируса хлорозной крапчатости коровьего гороха, вируса мозаики люцерны и вируса мозаики коровьего гороха описаны в US 2005/0260758 и WO 05/067478.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой РНКовый бактериофаг. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения РНКовый бактериофаг выбирают из группы, включающей а) бактериофаг Qβ; б) бактериофаг R17; в) бактериофаг fr; г) бактериофаг GA; д) бактериофаг SP; е) бактериофаг MS2; ж) бактериофаг М11; з) бактериофаг МХ1; и) бактериофаг NL95; к) бактериофаг f2; л) бактериофаг РР7 и м) бактериофаг АР205. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Qβ. Методы получения ВПЧ РНКового бактериофага, прежде всего ВПЧ бактериофага Qβ и ВПЧ бактериофага АР205, описаны на cc.37-47 WO 04009124 и в приведенных в указанной заявке примерах 1 и 21.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения вирусоподобная частица представляет собой РНКовый бактериофаг Qβ. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения вирусоподобную частицу РНКового бактериофага Qβ рекомбинантно экспрессируют в Е.coli.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения концентрация конъюгата никотин-ВПЧ составляет от 0,1 до 2,5 мг/мл, где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата концентрацию в препарате до лиофилизации. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения концентрация конъюгата никотин-ВПЧ составляет от 0,2 до 2 мг/мл, где концентрация представляет собой концентрацию в жидком препарате или в случае лиофилизированного препарата концентрацию в препарате до лиофилизации. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация конъюгата никотин-ВПЧ в жидком препарате, как правило и предпочтительно, выраженная в виде концентрации в препарате до лиофилизации, составляет 0,2, 0,6, 1,0 или 2 мг/мл. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация конъюгата никотин-ВПЧ в жидком препарате, как правило и предпочтительно, выраженная в виде концентрации в препарате до лиофилизации, составляет 0,2 или 0,6 мг/мл, предпочтительно 0,2 мг/мл.

Несколько связующих последовательностей, содержащих функциональные группы эфира карбоновой кислоты, с помощью которых можно ковалентно связывать молекулы никотина с носителем, описаны в US 5876727, US 6656469 и US 6932971. Их конкретное описание включено в настоящее описание в качестве ссылки. Связующие последовательности, которые можно применять в настоящем изобретении и которые содержат сложноэфирную функциональную группу, представляют собой, например, связующие последовательности, обозначенные как CJ2, CJ2.1, CJ2.2, CJ2.3, CJ4, CJ4.1, CJ5, CJ5.1, CJ8, CJ8.1, CJ9 и CJ11, описанные в столбце 17 US 5876727.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения связующая последовательность представлена в A-X-CO(O)-Y-Z-B, где A обозначает молекулу никотина, где B обозначает вирусоподобную частицу и где X обозначает (CH₂)m, где m обозначает 1-4, Y=(CH₂)n, где n обозначает 1-8, и Z обозначает C(O).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения связующая последовательность содержит, практически состоит или состоит из: CH₂OCO(CH₂)nCO, где n обозначает 1-8, предпочтительно n обозначает 1-4, предпочтительно n обозначает 1 или 2 и наиболее предпочтительно n обозначает 2. В еще одном из наиболее предпочтительных вариантов осуществления изобретения связующая последовательность представлена в A-CH₂OCO(CH₂)₂CO-B, где A обозначает молекулу никотина и где B обозначает вирусоподобную частицу.

Связующую последовательность можно ковалентно связывать либо с пиридиновым, либо с пирролидиновым кольцом молекулы никотина. Их примеры описаны, в частности, в US 5876727, US 6656469 и US 6932971. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения связующую последовательность коваленто связывают с 3'-положением молекулы никотина.

Большинство ковалентно связанных молекул никотина либо имеют одинаковую абсолютную конфигурацию, т.е. все молекулы никотина имеют (R)-конфигурацию или все молекулы никотина имеют встречающуюся в естественных условиях (S)-конфигурацию, либо они присутствуют в виде любой их смеси. Предпочтительно молекулы никотина ковалентно связывают таким образом, что они присутствуют либо в виде примерно равной или равной смеси и (R)-конфигурации и встречающейся в естественных условиях (S)-конфигурации. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения конъюгат никотин-ВПЧ, входящий в состав препаратов, предлагаемых в изобретении, можно получать или его получают с использованием рацемической смеси молекул никотина или производных никотина, как правило и предпочтительно, с использованием рацемической смеси молекул никотина или производных никотина, которая содержит молекулы никотина с ковалентно связанной связующей последовательностью, предназначенной для осуществления реакции сочетания с вирусоподобной частицей, что позволяет получать конъюгат никотин-вирусоподобная частица, предлагаемый в изобретении.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения конъюгат никотин-ВПЧ, предпочтительно никотин-ВПЧ из РНК