Способ получения мезенхимной клетки, способ получения зуба и мезенхимная клетка для формирования зуба

Способ получения мезенхимной клетки, способ получения зуба и мезенхимная клетка для формирования зуба

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения мезенхимных клеток для формирования зуба, к способу получения зуба и мезенхимным клеткам для формирования зуба.

Предшествующий уровень техники

Зуб представляет собой орган, имеющий эмаль во внешнем поверхностном слое и дентин во внутреннем слое, которые являются твердыми тканями, одонтобласты во внутреннем слое дентина, продуцирующие дентин и пульпу зуба в центральной его части, они могут быть уничтожены в результате кариеса зубов, парадонтита и тому подобное.

Зубы являются функциональными единицами, которые формируются путем индукции во время процесса развития зародыша, они построены из многих типов клеток, которые, как полагают, являются такими же как органы или системы внутренних органов. Поэтому зубы не могут создаваться системой стволовых клеток, такими как гематопоэтическая стволовая клетка или мезенхимная стволовая клетка во взрослом организме. В результате зубы не могут регенерировать исключительно трансплантацией стволовых клеток (терапия трансплантации стволовых клеток), которая в регенеративной медицине в настоящее время находится в процессе разработки.

Поэтому недавно были проведены исследования, направленные на регенерацию зуба путем трансплантации реконструированного зубного зачатка, полученного реконструкцией зубного зачатка из изолированных клеток зубного зачатка.

Например, в J. Dent. Res., 2002, Vol.81(10), pp.695-700 описывается, что ткань, подобная зубной ткани, регенерирует путем трансплантации клеток, таких как эпителиальные клетки, выделенные из зубного зачатка, и мезенхимные клетки фолликул, с биодеградирующим носителем в брюшную полость крысы.

Способ регенерирования зубного зачатка описан, например, в опубликованной заявке на патент Японии (JP-A) №2004-331557, в которой клетки зубного зачатка, выделенные из живого организма, выращиваются в присутствии биологически активных веществ, таких как фибробластные факторы роста и тому подобное. В JP-A №2004-357567 предполагается, что по меньшей мере один тип клеток, выбранный из клеток зубного зачатка и клеток, которые могут быть дифференцированы в эти клетки зубного зачатка, оба из них выделяют из живого организма, выращивают вместе с фибринсодержащим носителем, и там же описывается, что путем применения фибринсодержащего носителя, имеющего желаемую форму для зубного зачатка, формируется "зуб", имеющий желемую форму.

В заявках на патент США (номер публикации) 2002/0119180 и 2004/0219489 описывается способ формирования зуба, включающий засев смеси клеток зубного зачатка из нижней челюсти шестимесячной свиньи, содержащей образующие дентин мезенхимные клетки, имеющие происхождение из пульпы зуба, и эпителиальные клетки, способствующие образованию эмали, в матрице, которая представляет собой биодеградирующий полимер, содержащий сополимер полигликолевой кислоты и полиуксусной кислоты, и трансплантации его в тело животного. Здесь описывается, что при применении матрицы, имеющей желаемую форму для зубного зачатка, формируется "зуб", имеющий желаемую форму.

Кроме того, в WO 2005/014070 описывается способ регенерации зуба для лечения пациента с остеопорозом или костным повреждением. По этому способу кость образуется посевом мезенхимных клеток в ячеистом носителе из полигликолевой кислоты с последующим ламинированием носителя эпителиальными клетками и коллагеном или обертыванием носителя лентой из эпителиальных клеток. Дополнительно, в WO 2005/014070 для воспроизведения формы кости применяют носитель.

В WO 2006/129672 описывается способ выращивания зуба, включающий получение клеточных масс из эпителиальных клеток и мезенхимных клеток из зубного зачатка соответственно; контакт этих клеточных масс друг с другом в коллагеновом геле; выращивание этих клеточных масс в условиях контакта с целью получить зуб, имеющий размещение клеток, специфичное для зуба.

Однако, для того чтобы регенерировать зуб или зубной зачаток согласно вышеописанным способам, клетки зубного зачатка или клетки, способные в них дифференцироваться, получают из живого организма. При таком приеме, когда применяют клетки, отобранные из живого организма, количество получаемых клеток иногда является недостаточным. Кроме того, иногда ограничен источник снабжения клеток.

Для того чтобы воссоздать функцию ткани, необходимо, чтобы разнообразные типы клеток, составляющие ткань, расположились (организация клеток) в необходимых позициях относительно друг друга и имели анизотропию как в ткани.

Описание изобретения

Настоящее изобретение было сделано с учетом вышеописанных обстоятельств и предлагает способ получения зуба и получения мезенхимной клетки для формирования зуба.

В первом аспекте настоящее изобретение предлагает способ получения мезенхимных клеток для формирования зуба, способ, включающий выращивание стволовых тотипотентных клеток в присутствии индуктора дифференцировки для создания клеточной популяции после обработки индуктором дифференцировки, при этом клеточная популяция содержит CD44-позитивные и CD29-позитивные клетки или CD44-позитивные и CD106-позитивные клетки, и отбор из клеточной популяции после обработки для индукции дифференцировки CD44-позитивных и CD29-позитивных клеток или CD44-позитивных и CD106-позитивных клеток в качестве мезенхимных клеток для формирования зуба.

Во втором аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения зуба, включающий позиционирование в поддерживающем носителе первой клеточной массы, по существу состоящей только из одного типа клеток, выбранного из мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, и второй клеточной массы, по существу состоящей только из другого типа клеток, выбранного из мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, причем первую и вторую клеточные массы не смешивают друг с другом, но приводят друг с другом в тесный контакт, и выращивание первой и второй клеточной массы в указанном поддерживающем носителе, где мезенхимные клетки включают в себя вышеописанные мезенхимные клетки для формирования зуба.

В третьем аспекте настоящего изобретения предлагаются мезенхимные клетки для формирования зуба, которые индуцированы из стволовых тотипотентных клеток и являются CD44-позитивными и CD29-позитивными или CD44-позитивными и CD106-позитивными.

По настоящему изобретению предлагается способ получения мезенхимных клеток, с помощью которого желаемые зубы могут быть эффективно получены в большом количестве, и способ получения зуба, где зубы, сохраняющие организацию клеток, характерную для эмали и дентина, могут быть эффективно получены в большом количестве.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1 представляет собой схематическое концептуальное изображение, показывающее образование зубного зачатка.

Фиг.2А показывает состояние двойного окрашивания CD44 и CD29 клеток ЕС (клеток эмбриональной карциномы) по Примеру 1 настоящего изобретения.

Фиг.2В показывает состояние двойного окрашивания CD44 и CD29 на 6 сутки после обработки ДМСО по Примеру 1 настоящего изобретения.

Фиг.2С показывает состояние двойного окрашивания CD44 и CD29 выбранных CD44-позитивных и CD29-позитивных клеток по Примеру 1 настоящего изобретения.

Фиг.3А представляет собой схематическое концептуальное изображение, показывающее процедуру по Примерам настоящего изобретения для реконструкции зубного зачатка с применением мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, имеющих происхождение из зубного зачатка, и показывающее состояние гелевой упаковки до организации клеток.

Фиг.3В представляет собой схематическое концептуальное изображение, показывающее процедуру по Примерам настоящего изображения для реконструкции зубного зачатка с применением мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, имеющих происхождение из зубного зачатка, и показывающее состояние позиционирования первой клеточной массы в гелевой упаковке.

Фиг.3С представляет собой схематическое концептуальное изображение, показывающее процедуру по Примерам настоящего изобретения для реконструкции зубного зачатка с применением мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, имеющих происхождение из зубного зачатка, и показывающее позиционирование второй клеточной массы в гелевой упаковке.

Фиг.3D представляет собой схематическое концептуальное изображение, показывающее процедуру по Примерам настоящего изобретения для реконструкции зубного зачатка с применением мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, имеющих происхождение из зубного зачатка, и показывающее затвердевшее состояние гелевой упаковки, в которой позиционируется первая клеточная масса и вторая клеточная масса.

Фиг.4А представляет собой окрашенное НЕ (гематоксилин+эозин) изображение зубного зачатка по Примеру 4 настоящего изобретения, полученного из эпителиальной ткани зубного зачатка и из мезенхимной ткани зубного зачатка (увеличение: × 100).

Фиг.4В представляет собой окрашенное НЕ изображение зубного зачатка по Примеру 4 настоящего изобретения, полученного из эпителиальной ткани зубного зачатка и клеток DMSO-EC (увеличение: × 100).

Фиг.4С представляет собой окрашенное НЕ изображение зубного зачатка по Примеру 4 настоящего изобретения, полученного из эпителиальной ткани зубного зачатка и клонированных клеток DMSO-EC (увеличение: × 100).

Фиг.5А показывает состояние двойного окрашивания CD44 и CD29 клеток ЕС по Примеру 5 настоящего изобретения.

Фиг.5В показывает состояние двойного окрашивания клеток CD44 и CD29 на 7 сутки после обработки RA по Примеру 5 настоящего изобретения.

Фиг.5С показывает состояние двойного окрашивания клеток CD44 и CD29 выбранных CD44-позитивных и CD29-позитивных клеток по Примеру 5 настоящего изобретения.

Фиг.6 представляет собой окрашенное НЕ изображение зубного зачатка, полученного из CD44-позитивных и CD106-позитивных клеток, полученных обработкой RA по Примеру 5 настоящего изобретения, и эпителиальной ткани зубного зачатка (увеличение: × 200, полоса соответствует 50 мкм).

Фиг.7А показывает состояние двойного окрашивания CD44 и CD106 из клеток ЕС по Примеру 6 настоящего изобретения.

Фиг.7В показывает состояние двойного окрашивания CD44 и CD106 из клеток на 7 сутки после обработки RA по Примеру 6 настоящего изобретения.

Фиг.7C показывает состояние двойного окрашивания CD44 и CD106 из отобранных CD44-позитивных и CD106-позитивных клеток по Примеру 6 настоящего изобретению.

Лучший вариант осуществления изобретения

Способ получения мезенхимных клеток

Способ получения мезенхимных клеток по настоящему изобретению является способом получения мезенхимных клеток для формирования зуба, при этом способ включает выращивание стволовых тотипотентных клеток в присутствии индуктора дифференцировки с целью получения популяции клеток после обработки индуктором дифференцировки, при этом популяция клеток содержит CD44-позитивные и CD29-позитивные клетки или CD44-позитивные и CD106-позитивные клетки, и отбор из популяции клеток после обработки индуктором дифференцировки CD44-позитивных и CD29-позитивных клеток или CD44-позитивных и CD106-позитивных клеток в качестве мезенхимных клеток для формирования зуба.

В настоящем изобретении было обнаружено, что CD44-позитивные и CD29-позитивные клетки или CD44-позитивные и CD106-позитивные клетки, полученные индукцией дифференцировки стволовых тотипотентных клеток, могут применяться в качестве мезенхимных клеток для формирования зуба. Согласно этому мезенхимные клетки, необходимые для формирования зуба, могут быть получены из источников иных, чем зуб или зубной зачаток, полученных из живого организма, и они не требуются для получения мезенхимных клеток необходимых для формирования зуба. В результате необходимое количество мезенхимных клеток можно легко получить, в некоторых случаях в больших количествах, обходя такие обстоятельства, как незначительное количество клеток, непосредственно собранных из зубного зачатка или возможные ограничения источника поступления.

В настоящем изобретении термин "зуб" означает ткань, имеющую сплошной слой дентина внутри и слой эмали снаружи, конкретно ткань, имеющую анизотропию вследствие наличия коронки и корня. Анизотропия зуба может быть идентифицирована расположением коронки и корня. Коронка и корень могут визуально различаться по их форме, гистологическому окрашиванию и тому подобное. Коронка является частью, имеющей структуру из слоев эмали и дентина, а в корне слой эмали отсутствует.

Дентин и эмаль могут быть легко морфологически идентифицированы специалистами в данной области техники путем гистологического окрашивания или тому подобное. Эмаль может быть также идентифицирована наличием энамелобласта, что можно удостоверить наличием/отсутствием амелогенина. С другой стороны, дентин можно идентифицировать наличием одонтобласта, что можно удостоверить наличием/отсутствием сиалопротеина. Подтверждение наличия амелогенина или сиалопротеина можно выполнить способами, хорошо известными специалистам в данной области техники, и примеры способа включают гибридизацию in situ и окрашивание антителом или тому подобное.

Мезенхимные клетки по настоящему изобретению первоначально можно применить для формирования зубного зачатка с целью формирования зуба.

В настоящем изобретении термины "зубной зачаток" и "зародыш зуба" применяют, чтобы сослаться на разницу, основанную на различии в стадиях, описанную ниже. В этом случае "зубной зачаток" означает эмбрион на ранней стадии развития зуба, которому еще предстоит стать зубом в будущем, то, что по традиционной классификации стадий развития зуба находится на стадии зачатка зуба или стадии колокола, и особенно подразумевает такую ткань, в которой еще не наблюдается накопление эмали и дентина, характерных для твердых тканей зуба. С другой стороны, «зародыш зуба» означает ткань на переходной стадии от "зубного зачатка", применяемого в настоящем изобретении, когда начинается накопление дентина и эмали, характерных для твердой ткани зуба и стадия обособления от десен для выполнения типичных функций зуба.

В процессе онтогенеза развитие зуба из зубного зачатка на стадии зачатка в свою очередь проходит каждую из стадий, шапочкообразная почка, ранняя стадия колокола и поздняя стадия колокола, как показано на Фиг.1. Здесь на стадии зачатка эпителиальные клетки инвагинируются таким образом, что они «обертываются» вокруг мезенхимных клеток, а достигнув ранней стадии колокола и поздней стадии колокола, порция эпителиальных клеток становится внешней эмалью, а порция мезенхимных клеток внутри начинает формировать дентин. Поэтому зуб формируется из зубного зачатка путем межклеточного взаимодействия между эпителиальными клетками и мезенхимными клетками.

В настоящем изобретении термин "мезенхимная клетка" означает клетку, происходящую из мезенхимной ткани, а "эпителиальная клетка" означает клетку, происходящую из эпителиальной ткани.

Дополнительно в настоящем изобретении "периодонтальная ткань" означает альвеолярный отросток и периодонтальную мембрану, формирующуюся в основном во внешнем слое зуба. Альвеолярный отросток и периодонтальную мембрану специалисты в данной области техники могут морфологически легко различить путем гистологического окрашивания или тому подобное.

Теперь будут описаны мезенхимные клетки по настоящему изобретению для формирования зуба.

Предпочтительно применяются стволовые тотипотентные клетки, применяемые для получения мезенхимных клеток по настоящему изобретению для формирования зуба, имеющие отношение к клеткам, обладающим потенциалом для мультидифференцировки, которые могут дифференцироваться в два или более типа клеток, и к клеткам, выбранным из группы, состоящей из клеток эмбриональной карциномы, эмбриональных стволовых клеток и эмбриональных клеток зародышевого пути. Среди них наиболее предпочтительными с точки зрения доступности являются клетки эмбриональной карциномы (далее именуемые "клетками ЕС"). Клетками ЕС, применимыми по настоящему изобретению, могут служить клетки, полученные из любой ткани, такой как нерв, семенник или яичник. Примеры такой клетки ЕС включают NCR-G3 клетку и NTERA-2 клетку, полученные у человека, и линии клеток, полученные у мыши, такие как с-1300 клетка, F9 клетка, LT-2 клетка, ОТТ6050 клетка, РСС4 клетка, Р19 клетка, МЕТТ-1 клетка или STT-3 клетка. Эти клетки можно соответствующим образом отобрать, в зависимости от намечаемого применения из клеток, полученных у различных животных, например приматов (например, человека и обезьяны) и копытных (например, свиньи, коровы и лошади), являющихся млекопитающими, и грызунов (например, мыши, крысы и кролика), являющихся мелкими млекопитающими. Примерами клеточной линии эмбриональной карциномы, полученной у мыши, являются вышеупомянутые линии клеток и полученные из них клоны.

Средой для выращивания стволовых тотипотентных клеток могут служить традиционно применяемые культуральные среды. Примеры сред, которые могут применяться для выращивания, включают среды, обычно применяемые для выращивания клеток животных, такая как среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM). К этой среде для способствования росту клеток можно добавлять сыворотку или, в качестве альтернативы сыворотке, клеточный фактор роста, такой как FGF (фактор роста фибробластов), EGF (эпидермальный фактор роста) или PDGF (тромбоцитарный фактор роста), или известный компонент сыворотки, такой как трансферрин. В случаях, если добавляется сыворотка, ее концентрация может соответственно изменяться в зависимости от условий выращивания, обычно она составляет 10%. Для культуры клеток могут применяться обычные условия культуральной среды, такие как для культур в инкубаторе при 37°С и при 5% CO₂. Можно также добавлять антибиотик(и), такой как стрептомицин.

В настоящем изобретении обработка для индукции дифференцировки стволовых тотипотентных клеток выполняется выращиванием в присутствии индуктора дифференцировки. При этой обработке для индукции дифференцировки клеточная популяция, содержащая CD44-позитивные и CD29-позитивные клетки или CD44-позитивные и CD106-позитивные клетки, образуется из стволовых тотипотентных клеток. Достаточно, чтобы клеточная популяция, полученная при обработке для индукции дифференцировки, содержала вышеописанные CD44-позитивные и CD29-позитивные клетки или CD44-позитивные и CD106-позитивные клетки, и она может содержать оба этих типа клеток.

Примеры пригодного для применения вышеупомянутого индуктора дифференцировки включают любой фактор, индуцирующий дифференцировку CD44-позитивной клетки из стволовых тотипотентных клеток в клетке, экспрессирующей CD44. Примеры такого фактора, индуцирующего CD44-позитивную клетку, включают факторы, индуцирующие клетки нервного гребешка, факторы, ответственные за развитие клеток нервного гребешка, и факторы, являющиеся промоторами роста клеток нервного гребешка. Фактор, являющийся индуктором клеток нервного гребня, является фактором, способным индуцировать превращение стволовой тотипотентной клетки в клетку нервного гребня или клетку из него происходящую (например, клетку гладкой мышцы или клетку сердечной мышцы), и примеры фактора включают диметилсульфоксид (DMSO), дексаметазон (Dex), циклоаденозинмонофосфат (сАМР), гексаметилен-бис-ацетамид, 5′-азацитидин, трансформирующий фактор роста бета (TGF(3) и ноггин. Примеры факторов, ответственных за развитие клеток нервного гребня, включают ретиноевую кислоту (RA), факторы BMP-4, BMP-7, Shh, Wnt, фактор роста фибробластов 2 (FGF2), эндотелин-1, эндотелин-3, активинβА, тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Примеры факторов, запускающих рост клеток нервного гребня, включают FGF2, FGF8, FGF10, BMP-2, SCF и активный витамин D3. Фактор, индуцирующий клетки нервного гребня, фактор, ответственный за развитие клеток нервного гребня, и фактор, запускающий рост клеток нервного гребня, могут быть точно не отличимы один от другого и каждый из них можно применять поодиночке или два или более, в комбинации. Среди прочих в настоящем изобретении предпочитаются DMSO и RA, которые могут применяться поодиночке или в комбинации, способные эффективно производить далее упомянутую интересующую клеточную популяцию.

Эти индукторы дифференцировки можно добавлять к среде клеток, способных к дифференцировке, в такой концентрации, при которой возможна индукция дифференцировки. Отсюда концентрация, при которой возможна индукция пролиферации, различна в зависимости от природы индуктора и типа применяемых стволовых тотипотентных клеток.

В случае DMSO его концентрация может быть главным образом от 0,5 об.% до 10 об.% и с точек зрения выживаемости клеток при обработке и выхода интересующих клеток, получаемых в культуре, предпочтительно от 2,5 об.% до 5 об.%, более предпочтительно от 4 об.% до 5 об.%, относительно объема среды. Дифференцировка тотипотентных стволовых клеток может быть индуцирована в достаточной степени, как только концентрация станет не меньше чем 2,5 об.%, и выход интересующих клеток не уменьшается чрезмерно если концентрация не превышает 5 об.%.

В случае RA ее концентрация может быть главным образом от 0,1 мкМ по объему до 10 мкМ по объему и с точек зрения выживаемости клеток при обработке и выхода интересующих клеток, получаемых в культуре, предпочтительно от 0,5 мкМ по объему до 5 мкМ по объему, более предпочтительно от 0,5 мкМ по объему до 2 мкМ по объему, относительно объема среды. Дифференцировка стволовых тотипотентных клеток может быть индуцирована в достаточной степени, как только концентрация станет не меньше чем 0,1 мкМ по объему, и выход интересующих клеток не уменьшается чрезмерно, если концентрация не превышает 10 мкМ по объему.

Обработка для индукции дифференцировки стволовых тотипотентных клеток проводится культурированием стволовых клеток, способных к дифференцировке, в присутствии вышеописанного индуктора(ов) дифференцировки. Хотя время обработки для индукции дифференцировки варьируют в зависимости от концентрации индуктора(ов) дифференцировки и активности роста клеток, в основном оно может составлять от 2 часов до 3 суток и, с точек зрения выживаемости клеток и выхода клеток интереса, получаемых в культуре, предпочтительно от 6 часов до 24 часов. В значительной степени дифференцированные клетки могут эффективно получаться при времени не меньше чем 6 часов и выход интересующих клеток не уменьшается чрезмерно, если время не превышает 24 часа.

Имеется определенное соотношение между временем обработки стволовых тотипотентных клеток, индукцией дифференциации и концентрацией индуктора(ов) дифференцировки, позволяющей эффективное осуществление индукции дифференцировки стволовых тотипотентных клеток. То есть период времени выращивания в присутствии индуктора(ов) дифференцировки (время обработки) варьируют в зависимости от концентрации индуктора(ов) дифференцировки и типа индуктора(ов) дифференцировки, но в случае специфичного индуктора дифференцировки, когда количество дней выращивания фиксировано, обычно для концентрации имеется предпочтительный диапазон. Дополнительно в случаях, если количество суток выращивания уменьшается, диапазон оптимальных концентраций сдвигается в сторону более высоких концентраций, в то время как в тех случаях, когда количество суток выращивания увеличивается, диапазон оптимальных концентраций сдвигается в сторону более низких концентраций. Принимая во внимание эти факторы, эффект индукции дифференцировки может проявляться в широких диапазонах концентраций путем подбора количества дней выращивания, и специалисты в данной области техники смогут легко определить оптимальный диапазон концентраций, в которых может проявляться индуцирующий эффект.

В клеточной популяции, полученной после обработки для индукции дифференцировки путем вышеописанной обработки для индукции дифференцировки, существует клеточная популяция, содержащая CD44-позитивные и CD29-позитивные клетки или CD44-позитивные и CD106-позитивные клетки. Также в клеточной популяции могут содержаться оба типа клеток. После обработки для индукции дифференцировки клеточная популяция подвергается селекционной обработке, при которой в качестве мезенхимных клеток для формирования зуба отбираются CD44-позитивные и CD29-позитивные клетки или CD44-позитивные и CD106-позитивные клетки.

Для селекции клеток может применяться любой способ, при условии, что им можно отбирать мезенхимные клетки по настоящему изобретению, как выше описано. Примеры таких способов селекции включают способы селекции, основанные на моделях генной экспрессии, поверхностных клеточных антигенах и морфологии, и один или более из этих способов можно применять для селекции стволовых тотипотентных клеток. Способ селекции с точки зрения эффективности предпочтительно является способом, применяющим сортировку клеток на основе экспрессии на поверхности клеток, и для того чтобы гарантированно отобрать мезенхимные клетки, предпочтительно применять комбинацию многих способов, особенно комбинацию профиля генной экспрессии и поверхностно-клеточного антигена.

Мезенхимные клетки для формирования зуба, отбираемые по настоящему изобретению, являются CD44-позитивными и вдобавок обладают свойствами CD29-позитивных или CD106-позитивных клеток. Про CD44 известно, что он представляет собой мембранный белок, который экспрессируется на поверхности клетки как гиалуронановый рецептор. С другой стороны, про CD29 известно, что он является мембранным белком, который экспрессируется на клеточной поверхности как молекула интегрина β1 и про который сообщалось, что он является слабо позитивным у клеток ЕС и экспрессируется в мезенхимных клетках на уровне мРНК. Про CD106 известно, что он является молекулой VCAM-1, про которую известно, что она является адгезионной молекулой, часто применяемой в качестве маркера для эпителиальных клеток. Клетки, демонстрирующие такие свойства, можно применять в качестве мезенхимных клеток для формирования зуба, как описано ниже.

Мезенхимные клетки по настоящему изобретению для формирования зуба могут являться популяцией, являющейся CD44-позитивной и также позитивной по меньшей мере по одному из антигенов CD29 и CD106, а также могут являться популяцией, содержащей тройные позитивные клетки, то есть позитивные по всем из антигенов CD44, CD29 и CD106.

Мезенхимные клетки по настоящему изобретению для формирования зуба также можно отбирать на основании свойств клеток иных, чем выше описанные свойства антигенов CD44, CD29 и CD106.

Примеры других свойств клеток включают другие профили поверхностно-активных антигенов и профили генной экспрессии. Примеры профилей клеточной экспрессии антигенов включают CD14-негативные, CD34-негативные и CD45-негативные профили и их можно применять поодиночке или в комбинации. Примеры генной экспрессии включают, но не ограничены ими, экспрессию генов Slug, Wnt5a, Lhx8, BMP4, Рах3, Рах9, Msx1 и отсутствие экспрессии генов Oct3/4, nanog, Sox9 и Sox5 и их можно применять поодиночке или в комбинации.

Мезенхимные клетки для формирования зуба по настоящему изобретению в добавление к вышеописанным CD44, CD29 и CD106, предпочтительно, экспрессируют по меньшей мере один ген, выбранный из группы генов Slug, Рах3, Msx1 и Рах9, более предпочтительно экспрессируют, как Slug ген, так и Рах3 ген, еще более предпочтительно экспрессируют все четыре гена благодаря их высокому потенциалу в образовании зуба.

Для подтверждения этих антигенов поверхности клеток и профилей генной экспрессии и основанной на них селекции применяют различные антитела, узнающие антигены поверхности, последовательности нуклеиновых кислот, с помощью которых можно подтвердить экспрессию и тому подобное. Все эти антитела и последовательности нуклеиновых кислот известны и их можно легко получить. Подтверждение и селекция на основании этих антигенов поверхности и профилях генной экспрессии могут проводиться с применением способов, общепринятых в таких приложениях, как иммуноокрашивание различными антителами, проточная цитометрия, сортировка клеток или РВ-ПЦР (полимеразная цепная реакция в реальном времени).

В способе получения клетки по настоящему изобретению клонирование с целью получения единичной мезенхимной клетки может применяться в сочетании с вышеприведенным способом селекции. Примерами способа клонирования являются способы, обычно применяемые для этой цели, такие как способ серийных разведений, сортировка клеток и клонзапирающие кольца. Хотя клонирование может проводиться или до, или после селекции вышеописанным способом селекции, предпочтительно, чтобы повысить эффективность получения мезенхимной клетки(ок), проводить его после селекции.

Для эффективного получения желаемого количества клеток на стадии селекции перед стадией селекции можно провести стадию пролиферации. На этой стадии пролиферации выращивание клеточной популяции после индукции дифференцировки проводят, применяя среду для нормальной культуры, не содержащую индуктора дифференцировки. По этому способу интересующим клеткам, дифференцировка которых была индуцирована, позволяют пролиферировать до установленного числа клеток. В результате селекцию можно легко проводить, имея достаточное количество клеток.

Хотя временной период для такой стадии пролиферации может быть легко установлен на основании данных о количестве клеток и их состоянии после обработки индукцией дифференцировки, с точки зрения эффективной концентрации клеток интереса, временной период может в основном составлять от 3 до 30 суток, предпочтительно от 5 до 10 суток. В результате интересующие мезенхимные клетки для формирования зуба, содержащиеся в клеточной популяции, подвергаются селекции и после стадии селекции мезенхимные клетки по настоящему изобретению могут быть эффективно получены в большом количестве.

Мезенхимные клетки, полученные по способу настоящего изобретения, применяют для формирования зуба. Формирование зуба может проводиться любым способом, при условии, что в способе используются мезенхимные клетки по настоящему изобретению, и эти клетки наиболее предпочтительно применять в нижеследующем способе по настоящему изобретению для получения зуба.

Далее будет описываться способ получения зуба по настоящему изобретению.

Способ получения зуба

Предпочтительный способ получения зуба с применением мезенхимных клеток по настоящему изобретению включает в себя позиционирование в поддерживающем носителе первой клеточной массы, по существу состоящей только из одного типа клеток, выбранного из мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, и второй клеточной массы, по существу состоящей только из другого типа клеток, выбранного из мезенхимных клеток и эпителиальных клеток, причем первую и вторую клеточные массы не смешивают друг с другом, но приводят друг с другом в тесный контакт (стадия позиционирования), и выращивание первой второй клеточной массы в указанном поддерживающем носителе (стадия выращивания); где мезенхимные клетки включают в себя вышеописанные мезенхимные клетки для формирования зуба.

В способе получения по настоящему изобретению, поскольку мезенхимные клетки и эпителиальные клетки выращивают в виде клеточных масс в поддерживающем носителе при условии, что массы не смешиваются друг с другом, но находятся в тесном контакте, межклеточное взаимодействие может легко осуществляться ввиду тесного контакта так, чтобы зуб имел расположение клеток, характерное для зуба, то есть дентин внутри и эмаль снаружи. Отсюда клеточная масса, состоящая в основном из мезенхимных клеток, содержит мезенхимные клетки по настоящему изобретению для формирования зуба таким образом, чтобы зубы, имеющие характерное расположение клеток, можно было получать в большом количестве.

На стадии позиционирования первая клеточная масса и вторая клеточная масса приводятся в контакт друг с другом и позиционируются в поддерживающем носителе.

Поэтому и первая клеточная масса, и вторая клеточная масса по существу состоит только из мезенхимных клеток или только эпителиальных клеток. Клеточная масса по существу состоит только из мезенхимных клеток, включающих вышеупомянутые мезенхимные клетки для формирования зуба. Клеточная масса, содержащая мезенхимные клетки для формирования зуба, может быть приготовлена на стадии получения согласно вышеупомянутому способу получения, а, с другой стороны, клеточная масса, по существу состоящая только из эпителиальных клеток, может быть получена независимо от клеточной массы, по существу состоящей из мезенхимных клеток (первая стадия получения клеток и вторая стадия получения клеток).

Термин "клеточная масса" означает состояние, где клетки являются плотно упакованными, и клетки могут находиться в состоянии ткани или в состоянии клеточной массы (клеточного агрегата), полученного из единичных клеток. Термин "по существу состоит" означает, что количество материи, состоящей из клеток иных, чем интересующие клетки, является настолько малым, насколько возможно. Поэтому клеточная масса, состоящая из эпителиальных клеток, может являться частью ткани или массы из единичных клеток. Как эпителиальные клетки, так и мезенхимные клетки могут также образовывать клеточные массы, составленные из единичных клеток.

Каждая из клеточных масс, первая клеточная масса и вторая клеточная масса могут составляться из эпителиальных клеток или мезенхимных клеток. Количества клеток, составляющих эти клеточные массы, варьирует в зависимости от вида животного и от типа, твердости и размера поддерживающего носителя и могут обычно составлять от 10¹ до 10⁸ клеток и предпочтительно от 10³ до 10⁸ клеток на клеточную массу.

Так как клеточная популяция, по существу состоящая из мезенхимных клеток, содержит мезенхимные клетки для формирования зуба, она все же может содержать иные мезенхимные клетки.

Примерами мезенхимных клеток иных, чем вышеописанные мезенхимные клетки, могут являться мезенхимные клетки, имеющие происхождение из зубного зачатка и других источников. Примеры мезенхимных клеток, имеющих происхождение из источников иных, чем зубной зачаток, включают клетки, имеющие происхождение из других мезенхимных тканей в организме, таких как, предпочтительно, клетки костного мозга, не содержащие клетки крови, и мезенхимные стволовые клетки, более предпочтительно, мезенхимные клетки полости рта, клетки костного мозга внутри нижней челюсти, мезенхимные клетки, имеющие происхождение из клеток краниального нервного гребня, предшественников мезензимных клеток, которые могут генерировать мезенхимные клетки и их стволовые клетки.

Эпителиальные клетки, применяемые по настоящему изобретению, предпочтительно получают из зубного зачатка таким образом, чтобы они могли воспроизвести взаимное расположение клеток в живом организме и эффективно сформировать зуб, имеющий характерную структуру и анизотропию, и, предпочтительно, на стадии между зародыш зуба и шапкообразной почкой, имея в виду незрелость и гомогенность стадии дифференцировки клеток.

Эпителиальными клетками также могут являться те, которые образованы не из зубного зачатка, и их примеры включают клетки, имеющие происхождение из других эпителиальных тканей живого организма. Предпочтительные примеры эпителиальных клеток включают клетки эпителия кожи, слизистых оболочек и десен полости рта и более предпочтительные примеры клеток эпителия включают незрелые клетки предшественников эпителия, способные производить дифференцированные, например кератинизированные (ороговевшие) или паракератинизированные эпителиальные клетки кожи, слизистой оболочки и тому подобное. Примерами таких незрелых предшественников клеток эпителия являются неороговевшие клетки эпителия и их стволовые клетки.

В случаях выделения клеток для получения клеточной массы из тканей, зубной зачаток и другие ткани могут быть получены из нижней челюсти и тому подобное различных животных, например приматов, таких как человек и обезьяна, и копытных, таких как свинья, корова и лошадь, являющихся млекопитающими, и грызунов, таких как мышь, крыса и кролик, являющихся мелкими млекопитающими. Для сбора зубных зачатков и тканей могут применяться условия, обычно п