Способ ингибирования метастазирования злокачественной опухоли или миграции злокачественных клеток посредством снижения клеточного уровня лизил-трнк-синтетазы (варианты), композиция и применение вектора экспрессии или антитела против krs для ингибирования метастазирования злокачественной опухоли или миграции злокачественных клеток

Способ ингибирования метастазирования злокачественной опухоли или миграции злокачественных клеток посредством снижения клеточного уровня лизил-трнк-синтетазы (варианты), композиция и применение вектора экспрессии или антитела против krs для ингибирования метастазирования злокачественной опухоли или миграции злокачественных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к новой функции лизил-тРНК-синтетазы. Более конкретно, изобретение относится к способу контроля метастазирования злокачественных опухолей или миграции злокачественных клеток посредством модуляции клеточного уровня лизил-тРНК-синтетазы, к применению вектора экспрессии, содержащего конструкцию, ингибирующую экспрессию KRS, для профилактики или лечения злокачественной опухоли, к применению средства, ингибирующего активность KRS для профилактики или лечения злокачественной опухоли, к способу скрининга средства, модулирующего метастазирование злокачественной опухоли или миграцию злокачественных клеток, к способу скрининга средства, ингибирующего взаимодействие между KRS и 67LR.

Предшествующий уровень техники

Опухоль развивается в результате бесконтрольной беспорядочной патологической клеточной пролиферации. В частности, если такая опухоль демонстрирует деструктивный рост, инвазивность и метастазирование, то ее рассматривают как злокачественную. Инвазивность представляет собой инфильтрацию или разрушение окружающих тканей и, в частности, в результате такого поведения разрушается базальный слой тканей, что приводит к локальному распространению и иногда к попаданию опухоли в систему кровообращения. Под метастазированием понимают распространение опухолевых клеток из исходного места возникновения в другие области по лимфатическим или кровеносным сосудам. В широком смысле метастазирование также означает непосредственное распространение опухолевых клеток через серозную полость тела или другое пространство.

В настоящее время для лечения злокачественной опухоли широко применяют хирургическое вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию, самостоятельно или совместно. Хирургическое вмешательство представляет собой способ удаления пораженной ткани. Таким образом, с помощью хирургического вмешательства можно эффективно удалить опухоль в конкретной области, например в случае молочной железы, опухолей кишечника и кожи. Однако опухоль, расположенная в позвоночнике, или лечение рассеянной опухоли, например лейкоз, невозможно вылечить посредством хирургического вмешательства.

Химиотерапия блокирует репликацию или метаболизм клеток, и ее используют для лечения рака молочной железы, рака легких и рака яичка. Однако из пациентов со злокачественными опухолями, которые получали лечение посредством химиотерапии, были отмечены тяжелые побочные эффекты при системной химиотерапии. Обычными, но неприятными примерами таких побочных эффектов являются тошнота и рвота. Побочные эффекты химиотерапии могут оказывать влияние на жизнь пациента, так как быстро снижают его адаптивность. Кроме того, одним из основных побочных эффектов химиотерапии также является DLT (лимитирующая дозу токсичность), которую следует учитывать при введении лекарственного средства. Примером DLT для противораковых средств является мукозит, например, который представляет собой антиметаболическое цитотоксическое средство, 5-фторурацил, и метотрексат, противоопухолевый антибиотик, например доксорубицин. Если у пациента серьезные побочные эффекты химиотерапии, то его необходимо госпитализировать и вводить обезболивающие средства, снижающие боль. Таким образом, побочные эффекты химиотерапии и лучевой терапии при лечении пациентов со злокачественными опухолями являются серьезной проблемой.

Генотерапия представляет собой способ лечения или профилактики заболеваний, вызываемых генетической изменчивостью клеток человека, например различных генетических нарушений, злокачественных опухолей, сердечно-сосудистых заболеваний, инфекционных заболеваний и аутоиммунных заболеваний, на основе преимуществ способа рекомбинации ДНК, так пациенту для коррекции генетического дефекта или для активации или добавления функций клеток вводят терапевтический ген. Более точно, при генотерапии лечение заболевания проходит за счет нацеливания терапевтического гена на орган-мишень, индуцируя в клетках экспрессию терапевтического или нормального белка. Преимуществами генотерапии является превосходная специфичность и повышение степени и скорости восстановления, которые трудно регулировать при введении других лекарственных средств, которые обеспечивают длительное введение. Генотерапия не предназначена для лечения симптомов заболевания, но предназначена для лечения или устранения причины заболевания. Для успешной терапии важно доставить терапевтический ген в клетку-мишень, улучшив тем самым степень его экспрессии, что является основным подходом в генотерапии.

Необходимым медиатором для встраивания терапевтического гена в клетку-мишень является переносчик гена. Идеальный переносчик гена не должен оказывать негативного влияния на человека, должен активно продуцироваться, эффективно переносить ген в клетку-мишень и непрерывно экспрессировать ген. Получение переносчика гена является главным способом в генотерапии. Наиболее характерными переносчиками генов, широко используемыми для генотерапии в настоящее время, являются вирусные переносчики, такие как носители из аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, ретровирусов, и невирусные носители, такие как липосомы, полиэтиленамин и тому подобное.

В качестве генотерапевтической стратегии для контроля опухолевых клеток использовали способы с применением гена опухолевого супрессора, с применением компетентного по репликации онколитического вируса, с применением "суицидального" гена и с применением иммунорегуляторного гена и тому подобное. Способ использования гена опухолевого супрессора представляет собой лечение злокачественной опухоли посредством специфической доставки пациенту гена опухолевого супрессора, такого как p53, туда, где ген является дефектным или измененным. Кроме того, способ использования компетентного по репликации онколитического вируса представляет собой лечение злокачественной опухоли, используя нарушенную активность гена опухолевого супрессора в опухолевых тканях, посредством переноса вирусного переносчика гена, способного к специфическому росту в опухолевых клетках организма человека. Эти два способа представляют собой стратегии непосредственного уничтожения опухолевых клеток. Альтернативно, к ним относят способ с использованием "суицидального" гена. Характерным примером терапии "суицидальным" геном является лечение заболевания посредством доставки гена HSV-TK и химических средств против злокачественных опухолей, таких как ганцикловир, которые могут индуцировать гибель опухолевых клеток. С другой стороны, способ введения иммунорегуляторного гена представляет собой вид непрямых способов лечения, благодаря которым в живой организм вводят один или несколько генов, таких как интерлейкин 12, интерлейкин 4, интерлейкин 7, гамма-интерферон и фактор некроза опухоли и тому подобное для того, чтобы индуцировать распознавание T-клетками опухолевых клеток или апоптоз посредством блокирования белка, связанного с развитием опухоли. С другой стороны, к таким непрямым способам лечения также относится способ уничтожения опухолевых клеток посредством блокировки доставки питательных веществ, посредством экспрессии ингибирующих ангиогенез факторов, таких как ангиостатин или эндостатин и тому подобное.

Метастазирование является критическим показателем летальности злокачественной опухоли. Рецептор ламинина 67 кДа (67LR) представляет собой рецептор неинтегринового типа, встроенный в плазматическую мембрану и связанный с инвазией и метастазированием злокачественной опухоли (Nelson, J. et al., The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci. Rep. 28, 33-48 (2008)). 67LR образуется в результате димеризации своего предшественника, размером 37 кДа (37LRP), хотя подробности молекулярного взаимодействия в этом процессе преобразования не изучены. 37LRP идентичен рибосомальной субъединице p40, которая вовлечена в образование полисомы (Auth, D. & Brawerman, G. A 33-kDa polypeptide with homology to the laminin receptor: component of translation machinery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4368-4372 (1992)). В злокачественных опухолях часто отмечают высокие уровни 67LR (Nelson, J. et al., The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci. Rep. 28, 33-48 (2008); Menard, S., Castronovo, V., Tagliabue, E. & Sobel, M. E. New insights into the metastasis-associated 67 kD laminin receptor. J. Cell. Biochem. 67, 155-165 (1997)). Однако регуляторный и молекулярный механизм присутствия на мембране 67LR еще не были определены. В настоящей работе авторы настоящего изобретения обнаружили, что лизил-тРНК-синтетаза (KRS) усиливает клеточную миграцию и метастазирование злокачественной опухоли, стабилизируя 67LR на плазматической мембране.

KRS относится к аминоацил-тРНК-синтетазам (ARS), которые связывают узнаваемые ими аминокислоты и тРНК для синтеза белка. Эти древние ферменты кроме каталитической активности обладают множеством других функций (Park, S. G., Ewalt, K. L. & Kim, S. Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: new perspectives on housekeepers. Trends Biochem. Sci. 30, 569-574 (2005)). Кроме того, некоторые ARS млекопитающих, в том числе KRS, образуют молекулярный комплекс (Lee, S. W., Cho, B. H., Park, S. G. & Kim, S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes: beyond translation. J. Cell. Sci. 117, 3725-3734 (2004); Han, J. M., Kim, J. Y. & Kim, S. Molecular network and functional implications of macromolecular tRNA synthetase complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303, 985-993 (2003)), который служит молекулярным резервуаром (Ray, P. S., Arif, A. & Fox, P. Macromolecular complexes as depots for releasable regulatory proteins. Trends Biochem. Sci. 32, 158-164 (2007)) и контролирует большое число функций составляющих белков. KRS человека содержит уникальный N-концевой участок, участвующий во взаимодействиях с РНК и другими белками (Rho, S. B. et al. Genetic dissection of protein-protein interactions in multi-tRNA synthetase complex. Proc. Natl. Sci. Acad. USA 96, 4488-4493 (1999); Francin, M., Kaminska, M., Kerjan, P. & Mirande. M. The N-terminal domain of mammalian Lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain. J. Biol. Chem. 211, 1762-1769 (2002)).

Техническая проблема

Для определения значимости этого пептида для функциональной разносторонности KRS человека авторы настоящего изобретения выделили N-концевой пептид KRS человека длиной 116 аминокислот и использовали его в качестве затравки для скрининга связывающихся с ним белков из библиотеки кДНК клеток HeLa с использованием дрожжевой двухгибридной системы. В этой работе на основании скрининга авторы настоящего изобретения в качестве одного из потенциальных связывающихся белков идентифицировали 37LRP/p40 и исследовали функциональное значение взаимодействия KRS и рецептора ламинина. Для определения значимости этого пептида в отношении функциональной разносторонности KRS человека, авторы настоящего изобретения выделили N-концевой пептид KRS человека из 116 аминокислот и использовали его в качестве затравки для скрининга связывающихся с ним белков из библиотеки кДНК клеток HeLa с использованием дрожжевой двухгибридной системы. В этой работе на основании скрининга авторы настоящего изобретения в качестве одного из потенциальных связывающихся белков идентифицировали 37LRP/p40 и исследовали функциональное значение взаимодействия KRS и рецептора ламинина.

В результате авторы настоящего изобретения обнаружили, что лизил-тРНК-синтетаза (KRS) усиливает клеточную миграцию и метастазирование опухоли, стабилизируя 67LR в плазматической мембране, оказывая воздействие на метастазирование злокачественной опухоли или миграцию злокачественных клеток посредством рецептора ламинина в плазматическую мембрану, таким образом, достигнув настоящее изобретение.

Целью настоящего изобретения является получение нового применения лизил-тРНК-синтетазы в отношении метастазирования злокачественной опухоли или миграции злокачественных клеток.

Для достижения указанной выше цели настоящее изобретение относится к способу контроля метастазирования злокачественной опухоли посредством модуляции клеточного уровня лизил-тРНК-синтетазы.

Для достижения другой цели настоящее изобретение относится к способу контроля миграции злокачественных клеток посредством модуляции клеточного уровня лизил-тРНК-синтетазы.

Для достижения еще одной цели настоящее изобретение относится к композиции для профилактики и лечения злокачественной опухоли, которая содержит вектор экспрессии, содержащий в качестве эффективного компонента промотор и функционально связанный с ним полинуклеотид или антитело против KRS, где полинуклеотид кодирует антисмысловую РНК или миРНК против полинуклеотида KRS.

Для достижения еще одной цели настоящее изобретение относится к способу профилактики и лечения злокачественной опухоли, включающему введение индивиду, при необходимости, эффективного количества вектора экспрессии, содержащего промотор и функционально связанный с ним полинуклеотид или антитело против KRS, где полинуклеотид кодирует антисмысловую РНК или миРНК против полинуклеотида KRS.

Для достижения еще одной цели настоящее изобретение относится к применению вектора экспрессии, содержащего промотор и функционально связанный с ним полинуклеотид или антитело против KRS для получения средства против злокачественной опухоли, где полинуклеотид кодирует антисмысловую РНК или миРНК против полинуклеотида KRS.

Для достижения еще одной цели настоящее изобретение относится к композиции для профилактики и лечения злокачественной опухоли, содержащей в качестве активного компонента средство, ингибирующее активность KRS.

Для достижения еще одной цели настоящее изобретение относится к способу профилактики и лечения злокачественной опухоли, включающему введение индивиду, при необходимости, эффективного количества средства, ингибирующего активность KRS.

Для достижения еще одной цели настоящее изобретение относится к применению средства, ингибирующего активность KRS для получения терапевтического средства против злокачественной опухоли.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга средства, регулирующего метастазирование злокачественной опухоли или миграцию злокачественных клеток, включающему:

(a) приведение тестируемого средства в контакт с KRS в присутствии тестируемого средства;

(b) измерение активности KRS и выбор тестируемого средства, изменяющего активность KRS; и

(c) тестирование того, может ли выбранное средство регулировать метастазирование опухоли или миграцию злокачественных клеток.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга средства, ингибирующего взаимодействие между KRS и 67LR, включающему:

(a) приведение тестируемого средства в контакт с KRS и рецептором ламинина (67LR) в присутствии тестируемого средства; и

(b) тестирование того, может ли выбранное средство регулировать взаимодействие между KRS и рецептором ламинина.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики рака легких или рака молочной железы, включающему:

(a) анализ сверхэкспрессии 67LR в образце; и

(b) анализ сверхэкспрессии KRS в образце со сверхэкспрессией 67LR.

Техническое решение

Ниже в настоящем документе приведено подробное описание настоящего изобретения.

В настоящем изобретении авторы настоящего изобретения сначала определили, что KRS оказывает воздействие на метастазирование злокачественной опухоли или миграцию злокачественных клеток. То есть авторы настоящего изобретения определили, что KRS оказывает воздействие на метастазирование злокачественной опухоли или миграцию злокачественных клеток благодаря рецептору ламинина в плазматической мембране.

Определение

Если не определено иначе все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое известно среднему специалисту в данной области, к которой принадлежит изобретение. Общие определения большинства из терминов, используемых в настоящем изобретении, предоставлены специалисту в следующих ссылках: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. Кроме того, для удобства читателя в практическом осуществлении изобретения предоставлены приведенные ниже определения.

Как используется в настоящем документе "экспрессия" относится к образованию белка или нуклеиновой кислоты в клетках.

Как используется в настоящем документе "клетка-хозяин" относится к прокариотической или эукариотической клетке, содержащей гетерологичную ДНК, которую вводят в клетку любым способом, например посредством электропорации, осаждения фосфатом кальция, микроинъекции, трансформации, инфицирования вирусами и/или тому подобное.

Термин "выделенный" означает, что вещество извлекают из его исходного окружения (например, из природной среды, если оно является природным). Например, природные нуклеиновая кислота, полипептид или клетка, находящиеся у живущего животного, не являются выделенными, но те же полинуклеотид, полипептид или клетка, отделенные от некоторых или всех совместно находящихся в природной системе веществ, являются выделенными, даже если их затем обратно вводят в природную систему. Такие нуклеиновые кислоты могут представлять собой часть вектора, и/или такие нуклеиновые кислоты или полипептиды могут составлять часть композиции и могут являться выделенными в том смысле, что вектор или композиция не являются частью их природного окружения.

Термин "модулирует" в отношении видов биологической активности KRS относится к изменению клеточного уровня KRS. Модуляция видов биологической активности KRS может представлять собой положительную регуляцию (т.е. активацию или стимуляцию) или отрицательную регуляцию (т.е. ингибирование или супрессию). Например, модуляция может вызывать изменение клеточного уровня KRS, стабильности белка, ферментативной модификации (например, фосфорилирования) KRS, характеристик связывания (например, связывания с регуляторным элементом транскрипции мишени) или любого другого биологического, функционального или иммунологического свойств KRS. Изменение активности может происходить, например, вследствие повышения или снижения экспрессии гена KRS, стабильности мРНК, кодирующей белок KRS, эффективности трансляции, или вследствие изменения других видов биологической активности фактора транскрипции KRS (например, регулирующего экспрессию отвечающего за KRS гена). Способ действия модулятора KRS может быть прямым, например, за счет связывания с белком KRS или с генами, кодирующими белок KRS. Изменение также может быть непрямым, например, вследствие связывания и/или модификации (например, ферментативно) другой молекулы, которая модулирует KRS другим способом (например, киназа, специфически фосфорилирующая KRS).

Термин "полипептид" в настоящем документе попеременно используют с терминами "полипептиды" и "белок(ки)", и он относится к полимеру из аминокислотных остатков как, например, обычно в природных белках.

Термин "полипептид KRS" относится к полипептиду, известному как лизил-тРНК-синтетаза. Указанный полипептид KRS может представлять собой полипептид с аминокислотной последовательностью с SEQ ID NO:1 (инвентарный номер GenBank NP_005539,1). И KRS по изобретению содержит его функциональные эквиваленты.

Термин "функциональные эквиваленты" относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% гомологична аминокислотной последовательности (т.е. идентична), предпочтительно, по меньшей мере на 80%, а более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, например, на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100% гомологична аминокислотной последовательности, который обладает по существу одинаковой физиологической активностью с полипептидом с последовательностью SEQ ID NO:1. "По существу одинаковая физиологическая активность" означает взаимодействие с рецептором ламинина плазматической мембраны и регуляцию метастазирования опухоли или миграции клеток опухоли. Функциональные эквиваленты могут включать, например, пептиды, получаемые в результате добавления, замены или делеции любой аминокислоты из SEQ ID NO:1. Аминокислотные замены предпочтительно являются консервативными заменами. Примеры консервативных замен природных аминокислот являются следующими: алифатические аминокислоты (Gly, Ala, Pro), гидрофобные аминокислоты (Ile, Leu, Val), ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Trp), кислые аминокислоты (Asp, Glu), основные аминокислоты (His, Lys, Arg, Gln, Asn) и серосодержащие аминокислоты (Cys, Met). Кроме того, функциональные эквиваленты также включают варианты с делецией любой аминокислотной последовательности в KRS по изобретению. Аминокислотные делеции или замены, предпочтительно, расположены в областях, которые напрямую не вовлечены в физиологическую активность полипептида по изобретению. И аминокислотные делеции, предпочтительно, расположены в областях, которые не вовлечены в физиологическую активность KRS. Кроме того, функциональные эквиваленты также включают варианты с добавлением нескольких аминокислот на обоих концах аминокислотной последовательности KRS или внутри последовательности. Кроме того, функциональные эквиваленты по изобретению также включают производные полипептидов, содержащие модификации некоторых из химических структур полипептида по изобретению при сохранении основного каркаса и физиологической активности полипептида по изобретению. Примеры этих модификаций включают структурные модификации для изменения стабильности, хранимости, летучести или растворимости полипептида по изобретению.

Идентичность или гомология последовательностей определены в настоящем документе как доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которая идентична аминокислотной последовательности KRS (SEQ ID NO:1), после выравнивания последовательностей и внесения, если необходимо, пропусков для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая любые консервативные замены (как описано выше) как составляющие идентичности последовательностей. Ни одно из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, делеций или вставок в аминокислотную последовательность KRS не следует рассматривать как влияющую на идентичность или гомологию последовательностей. Таким образом, идентичность последовательностей можно определить стандартными способами, которые широко используют для сравнения сходства положения аминокислот двух полипептидов. Используя компьютерную программу, например BLAST или FASTA, два полипептида выравнивают для оптимального совпадения их соответствующих аминокислот (или по всей длине одной или обеих последовательностей, или по предопределенной части одной или обеих последовательностей). В программах предусмотрены штраф за введение пропуска по умолчанию и штраф за пропуск по умолчанию, и в сочетании с компьютерной программой можно использовать оценочную матрицу, такую как PAM 250 (стандартная оценочная матрица; см. Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)). Например, процент идентичности можно рассчитать, как указано ниже. Общее количество идентичных совпадений умножают на 100, а затем делят на сумму длины более длинной последовательности в пределах подбираемого участка и числа пропусков, внесенных в более длинную последовательность для выравнивания двух последовательностей.

Полипептид по настоящему изобретению может быть получен путем выделения из природных веществ или способами генетической инженерии. Например, молекулу ДНК, кодирующую KRS или его функциональные эквиваленты (например, SEQ ID NO:2 (инвентарный номер GenBank D32053)), конструируют любым общепринятым способом. Молекулу ДНК можно синтезировать, проводя ПЦР с использованием подходящих праймеров. Альтернативно, молекулу ДНК также можно синтезировать стандартным известным в данной области способом, например, с применением автоматического ДНК-синтезатора (коммерчески доступный в Biosearch или Applied Biosystems). Сконструированную молекулу ДНК вставляют в вектор, содержащий по меньшей мере одну контролирующую экспрессию последовательность (например, промотор, энхансер), которая функционально связана с последовательностью ДНК так, чтобы контролировать экспрессию молекулы ДНК, и полученным рекомбинантным вектором экспрессии трансформируют клетки-хозяева. Трансформированные клетки культивируют в среде и условиях, подходящих для экспрессии последовательности ДНК, и из среды для культивирования выделяют по существу чистый полипептид, кодируемый последовательностью ДНК. Выделение чистого полипептида можно проводить известным в данной области способом, например хроматографией. В отношении этого термин "по существу чистый полипептид" означает полипептид по изобретению, который по существу не содержит любых других белков, происходящих из клеток-хозяев. Относительно способа генетической инженерии для синтеза полипептида по изобретению читатель может обратиться к следующей литературе: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second (1998) and Third (2000) Editions; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif. 1991; и Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255, 12073-12080, 1990.

Альтернативно полипептид по изобретению можно легко синтезировать химически известным в данной области способом (Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY, 1983). В качестве типичного способа, они не ограничиваются, но включают жидко- или твердофазный синтез, конденсацию фрагментов, химические реакции с F-MOC или T-BOC (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

Рецептор ламинина по изобретению (67LR) массой 67 кДа представляет собой встроенный в плазматическую мембрану, неинтегриновый рецептор, и, например, он может иметь любую нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность из представленных в инвентарных номерах GenBank NM_002295, S37431, AF284768, S37431, AF284768, J03799, XP 370865, XP 001083023.

Термины "нуклеиновая кислота", "последовательность ДНК" или "полинуклеотид" относятся к полимеру из дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов в одно- или двухцепочечной форме, и, если не ограничено иным образом, включает известные аналоги природных нуклеотидов, которые гибридизуются с нуклеиновыми кислотами сходным с природными нуклеотидами образом.

Термин "нуклеотид, кодирующий KRS или ее функциональные эквиваленты" может включать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, или полипептид, который гомологичен аминокислотной последовательности указанного полипептида по меньшей мере на 70%. Нуклеиновая кислота включает ДНК, кДНК или РНК. Полинуклеотид может иметь нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или аминокислотную последовательность с гомологией с SEQ ID NO:1 по меньшей мере 70%. Предпочтительно, полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO. 2. Нуклеиновая кислота может быть выделена из природного источника или получена известным в данной области способом генной инженерии.

Термин "аналог" используют в настоящем документе для обозначения молекулы, которая структурно сходна с эталонной молекулой, но которая модифицирована целенаправленным или контролируемым способом, посредством замены конкретного заместителя эталонной молекулы альтернативным заместителем. Специалист в настоящей области может ожидать, что по сравнению с эталонной молекулой аналог будет иметь такую же, сходную или улучшенную активность. Синтез и скрининг аналогов с идентификацией вариантов известных соединений с улучшенными свойствами (такими как повышенная аффинность связывания с молекулой-мишенью) представляет собой подход, который хорошо известен в области фармацевтической химии.

Термин "гомологичный", если он относится к белкам и/или белковым последовательностям, означает, что они получены из природного источника или искусственно, на основе общего белка-предшественника или общей белковой последовательности-предшественника. Подобным образом, нуклеиновые кислоты и/или последовательности нуклеиновых кислот являются гомологичными, если они получены из природного источника или искусственно, из общей нуклеиновой кислоты-предшественника или общей последовательности-предшественника нуклеиновой кислоты.

Как используют в настоящем документе, термин "эффективное количество" относится к количеству, демонстрирующему эффект изменения биологической активности KRS (например, уровней в клетках и тому подобное), отличный от нормальных клеток или тканей, или эффект ингибирования убиквитинилирования KRS.

Как используют в настоящем документе, "приведение в контакт" имеет его нормальное значение и относится к комбинированию двух или более средств (например, двух полипептидов) или комбинированию средств и клеток (например, белка и клетки). Приведение в контакт можно проводить in vitro, например, комбинируя два или более средств или комбинируя тестируемое средство и клетку или клеточный лизат в тестовой пробирке или другом контейнере. Приведение в контакт также можно проводить в клетке или in situ, например, приводя в контакт два полипептида в клетке посредством коэкспрессии в клетке или в клеточном лизате рекомбинантных полинуклеотидов, кодирующих два полипептида.

Термин "средство" или "тестируемое средство" включает любое вещество, молекулу, элемент, соединение, структуру или их сочетание. В качестве неограничивающих примеров он включает, например, белок, полипептид, малую органическую молекулу, полисахарид, полинуклеотид и т.п. Оно может представлять собой природный продукт, синтетическое соединение или химическое соединение, или сочетание двух или более веществ. Если не указано иначе, термины "средство", "вещество" и "соединение" можно использовать взаимозаменяемо. Более конкретно, тестируемые средства, которые можно идентифицировать способами по настоящему изобретению, включают полипептиды, миметики бета-изгибов, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения, бензодиазепины, олигомерные N-замещенные глицины, олигокарбаматы, полипептиды, сахариды, жирные кислоты, стероиды, пурины, пиримидины, производные, структурные аналоги или их сочетания. Некоторые тестируемые средства представляют собой синтетические молекулы и другие природные молекулы. Тестируемые средства получают из широкого множества источников, включающего библиотеки синтетических или природных соединений. Комбинаторные библиотеки можно получать из многих типов соединений, которые можно синтезировать поэтапным способом. Большие комбинаторные библиотеки соединений можно конструировать способом кодируемых синтетических библиотек (ESL), описанном в WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/35503 и WO 95/30642. Пептидные библиотеки также можно получать способами фагового дисплея (см., например, Devlin, WO 91/18980). Библиотеки природных соединений в форме бактериальных, грибковых, растительных и животных экстрактов можно получать из коммерческих источников или собирать в полевых условиях. Для получения структурных аналогов известные фармакологические средства можно подвергать направленным или случайным химическим модификациям, таким как ацилирование, алкилирование, этерификация, амидирование.

Тестируемые средства могут представлять собой природные белки или их фрагменты. Такие тестируемые средства можно получать из природного источника, например клетки или тканевого лизата. Также можно получать библиотеки полипептидных средств, например из библиотеки кДНК, коммерчески доступной или получаемой общепринятыми способами. Тестируемые средства также могут представлять собой пептиды, например пептиды из аминокислот в количестве приблизительно от 5 до приблизительно 30, с предпочтительным количеством аминокислот приблизительно от 5 до приблизительно 20 и особенно предпочтительным количеством приблизительно от 7 до приблизительно 15. Пептиды могут представлять собой продукты расщепления природных белков, случайные пептиды или "смещенные" случайные пептиды.

Тестируемые средства также могут представлять собой "нуклеиновые кислоты". Тестируемые средства в виде нуклеиновых кислот могут представлять собой природные нуклеиновые кислоты, случайные нуклеиновые кислоты или "смещенные" случайные нуклеиновые кислоты. Например, продукты расщепления прокариотических или эукариотических геномов можно использовать аналогично, как описано выше для белков.

В некоторых предпочтительных способах тестируемые средства представляют собой низкомолекулярные соединения (например, молекулы с молекулярной массой не более чем приблизительно 1000). Предпочтительно, для скрининга таких низкомолекулярных соединений адаптируют и используют высокопроизводительные анализы. Для такого скрининга доступен ряд анализов, например, как описано в Schultz (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:2409-2414; авторы настоящего изобретения (1997) Mol. Divers. 3:61-70; Fernandes (1998) Curr. Opin. Chem. Biol. 2:597-603; и Sittampalam (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:384-91.

Библиотеки тестируемых средств для скрининга способами по настоящему изобретению также можно получать на основе структурного анализа KRS, ее фрагментов или ее аналогов. Такой структурный анализ обеспечивает идентификацию тестируемых средств, которые с большей вероятностью связываются с KRS. Трехмерные структуры KRS можно исследовать рядом способов, например, посредством кристаллической структуры и молекулярного моделирования. В литературе хорошо известны способы исследования структуры белков с применением рентгеноструктурной кристаллографии. См. Physical Bio-chemistry, Van Holde, K. E. (Prentice-Hall, New Jersey 1971), pp. 221-239 и Physical Chemistry with Applications to the Life Sciences, D. Eisenberg & D. C. Crothers (Benjamin Cummings, Menlo Park 1979). Другие средства для разработки тестируемых средств для скрининга KRS предоставляют компьютерное моделирование структур KRS. Способы молекулярного моделирования описаны в литературе, например, в патенте США № 5612894, озаглавленном "System and method for molecular modeling utilizing a sensitivity factor", и в патенте США № 5583973 "Molecular modeling method and system". Кроме того, структуру белков также можно определять посредством нейтронографии и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). См., например, Physical Chemistry, 4th Ed. Moore, W. J. (Prentice-Hall, New Jersey 1972), и NMR of Proteins and Nucleic Acids, K. Wuthrich (Wiley-Interrscience, New York 1986).

Ниже в настоящем документе приведено подробное описание настоящего изобретения.

Авторы настоящего изобретения выявили, что KRS по изобретению взаимодействует с 67LR посредством транслокации KRS в плазматическую мембрану и, таким образом, усиливает миграцию клеток опухоли (или злокачественной опухоли), таким образом, оказывая влияние на метастазирование злокачественной опухоли. Кроме того, авторы настоящего изобретения также выявили, что сверхэкспрессия KRS или ингибирование экспрессии KRS может модулировать метастазирование клеток опухоли (или злокачественной опухоли) в экспериментах in vivo с использованием мышей.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу контроля метастазирования злокачественной опухоли посредством изменения клеточного уровня лизил-тРНК-синтетазы.

Подробнее, если клеточный уровень лизил-тРНК-синтетазы по изобретению снижен, метастазирование злокачественной опухоли может подавляться, а если клеточный уровень лизил-тРНК-синтетазы по изобретению увеличен, метастазирование злокачественной опухоли может индуцироваться.

Снижение или увеличение клеточного уровня регулируется различными хорошо известными в данной области способами, как описано выше. Например, но не ограничиваясь этим, клеточный уровень можно контролировать посредством регуляции транскрипции или посттранскрипционной регуляции. Регуляцию транскрипции можно проводить способом увеличения экспрессии гена, известным в данной области, например, способом увеличения экспрессии гена, посредством получения рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий KRS или ее функциональный эквивалент, функционально связанные с промотором, или способом вставки рядом с геном регулирующей экспрессию последовательности для увеличения экспрессии гена, кодирующего KRS или ее функциональный эквивалент, или способом ингибирования экспрессии гена, например, способом ингибирования активности промотора или функции белка, посредством индукции мутации в областях промотора или гена, способом экспрессии смыслового гена, или миРНК или микроРНК.

Посттранскрипционную регуляцию можно провод