Бактериальные факторы вирулентности и варианты их применения

Бактериальные факторы вирулентности и варианты их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к бактериальным патогенам. Более конкретно, изобретение частично относится к секретируемым белкам бактериальных патогенов и способам их применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Escherichia coli представляет собой исключительно изменчивый организм. В дополнение к тому, что она является представителем нормальной кишечной флоры, штаммы E. coli могут также вызывать инфекции мочевого пузыря, менингит и диарею. Вызывающие диарею E. coli включают, по меньшей мере, пять типов E. coli, которые вызывают различные симптомы, варьирующие от холероподобной диареи до острого колита. Каждый тип вызывающих диарею E. coli обладает конкретным набором факторов вирулентности, включая адгезины, инвазины и/или токсины, которые отвечают за индукцию конкретного типа диареи.

Энтеропатогенная E. coli (EPEC) представляет собой преобладающую причину детской диареи во всем мире. Заболевание EPEC характеризуется водянистой диареей различной тяжести, с рвотой и лихорадкой, часто сопровождающимися потерей жидкости. В дополнение к отдельным вспышкам в дневных медицинских и детских учреждениях в развивающихся странах EPEC представляет серьезную угрозу здоровью младенцев (<6 месяцев). По всему миру EPEC представляет собой ведущую причину опосредованной бактериями диареи у младенцев, и, по оценкам, EPEC является причиной гибели нескольких сотен тысяч детей в год.

Энтерогеморрагическая E. coli, также называемая продуцирующей шигатоксин E. coli (STEC) или продуцирующей веротоксин E. coli (VTEC), вызывает более тяжелую диарею, чем EPEC (энтероколит) и примерно в 10% случаев данное заболевание прогрессирует в заболевание почек - гемолитико-уремический синдром (HUS), который зачастую является фатальным. EHEC O157:H7 представляет собой наиболее распространенный серотип в Канаде и Соединенных Штатах, и ассоциирован с загрязнением пищи и воды (3). Другие серотипы EHEC также вызывают значительные проблемы в Азии, Европе и Южной Америке, и, в меньшей степени, в Северной Америке. EHEC колонизирует крупный рогатый скот и вызывает повреждения A/E, но не вызывает заболевание у взрослых животных, и вместо этого микроорганизмы выбрасываются в окружающую среду. Однако это вызывает серьезные проблемы здравоохранения, поскольку для инфицирования людей достаточно относительно небольшого количества EHEC.

В отличие от диареи другого происхождения, вызываемой E. coli, например, вызываемых E. coli, образующими энтеротоксины, диарея, вызванная EHEC и EPEC, не опосредована токсином. Вместо этого, EPEC и EHEC связываются с поверхностью кишечника (EPEC с тонким кишечником, EHEC с толстым кишечником) и вызывают характерный гистологический очаг повреждения, называемый очагом прикрепления и сглаживания (A/E) (8).

Очаги A/E отмечаются растворением поверхности ресничного эпителия кишечника и потерей эпителиальных микроворсинок (сглаживание) в участках прикрепления бактерий. Связавшись, бактерии остаются на чашевидных выступах или ложах. В основе данного ложа в эпителиальной клетке лежат некоторые компоненты цитоскелета, включая актин и ассоциированные с актином цитоскелетные белки. Образование очагов A/E и богатых актином лож под прикрепленными бактериями является гистопатологическим признаком A/E патогенов (1, 2).

Данная патология может имитироваться на культивируемых клетках in vitro, и образование лож может наблюдаться путем флуоресцентного окрашивания актина (2, 11). Образование A/E-очагов может быть ответственным за разрушение ресничного слоя и микроворсинок, секреции жидкости и диареи.

EPEC и EHEC принадлежат к семейству A/E-патогенов, включая несколько EPEC-подобных животных патогенов, которые вызывают заболевания у кроликов (REPEC), свиней (PEPEC) и мышей (Citrobacter rodentium). Данные патогены содержат островки патогенности (PAI), которые кодируют специализированные системы секреции и секретируемые факторы вирулентности, критичные в плане развития заболевания. Гены, требуемые для образования A/E-очагов, как полагают, кластеризованы вместе в один хромосомный островок патогенности, известный как локус сглаживания энтероцитов (LEE), которые включают регуляторные элементы, систему секреции III типа (TTSS), секретируемые эффекторные белки и связанные с ними шапероны (4-8).

LEE содержит 41 ген, что делает его одним из наиболее сложных PAI. Основная функция LEE TTSS представляет собой доставку эффекторов в клетки-хозяина, где они нарушают функции клеток-хозяев и опосредуют заболевание (9, 10, 34). Идентифицировано пять кодируемых LEE эффекторов (Tir, EspG, EspF, Map и EspH) (35-40). Tir (перемещаемый рецептор интимина) перемещается в клетки-хозяина, где он связывается с цитоскелетными и сигнальными белками хозяина и инициирует полимеризацию актина в участке прикрепления бактерии (31, 44), что приводит к образованию ложеобразных актиновых структур, лежащих под прикрепленными бактериями, которые непосредственно взаимодействуют с внеклеточной петлей Tir посредством белка внешней мембраны бактерии интимина. CesT играет роль в качестве шаперона для стабильности и секреции Tir (18, 19).

В А/Е-патогенах охарактеризованы четыре других кодируемых в LEE TTSS-перемещаемых эффектора: EspH усиливает удлинение актиновых лож (40); EspF играет роль в разъединении плотных контактов между кишечными эпителиальными клетками (38); EspG родственен связанному с микротрубочками Shigella эффектору VirA (36, 55); и Map локализован в митохондриях (37), но также играет роль в динамике актина (48). Ler (кодируемый в LEE регулятор) является единственным идентифицированным кодируемым в LEE регулятором.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение, в частности, основано на идентификации нескольких новых общих секретируемых белков A/E-патогенов.

В одном аспекте изобретение относится к композициям, включающим полипептид или его фрагмент, или его вариант, или надосадочную жидкость культуры клеток, включающую такой полипептид, где по существу чистый полипептид включает аминокислотную последовательность, по существу идентичную последовательности любой одной или нескольким из SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или их фрагментам, или вариантам. Изобретение также относится к композициям, включающим молекулу нуклеиновой кислоты, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, по существу идентичную любой одной или нескольким последовательностям из SEQ ID NO: 1-21 или 60-72; и к композициям, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, по существу идентичный любой одной или нескольких последовательностей из SEQ ID NO: 22-43, или их фрагментам. Композиции могут дополнительно включать физиологически приемлемый носитель, или дополнительно включать адъювант. Композиции могут также включать полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, такую как EspA, EspB, EspD, EspP, Tir, шигатоксин 1, шигатоксин 2, или интимин. Полипептиды или молекулы нуклеиновой кислоты могут быть по существу чистыми.

В альтернативных аспектах изобретение также относится к бактериям или к их препаратам, где бактерия включает мутацию в гене, таком как nleA, nleB, nleC, nleD, nleE, nleF, nleG, nleH, или в их гомологе, или включает мутацию в бактериальном геноме в нуклеотидной последовательности, которая является по существу идентичной в отношении SEQ ID NO: 1-21 или 60-72. В некоторых вариантах осуществления бактерия может представлять собой A/E-патоген, например энтерогеморрагическую E. coli (EHEC; например, EHEC О157:H7 или EHEC О157:NM), энтеропатогенную E. coli (EPEC; например, EPEC О127:H6) или Citrobacter rodentium. В некоторых вариантах осуществления мутация может ослаблять вирулентность или может происходить в нуклеотидной последовательности в геноме A/E-патогена, которая по существу идентична последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-21 или 60-72. Бактерия может предоставляться в виде композиции, в комбинации с адъювантом. В некоторых вариантах осуществления бактерия может быть живой. В некоторых вариантах осуществления бактерия может быть убитой. Способ введения может быть пероральным или парентеральным.

В альтернативных вариантах изобретение также относится к способу выявления A/E-патогена в образце путем предоставления образца; и выявления нуклеотидной последовательности, по существу идентичной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-21 или 60-72, или ее фрагменту, или варианту; нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидную последовательность, по существу идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по существу идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 22-43, 59 или 73-84, или ее фрагменту, или варианту, где присутствие нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности указывает на присутствие A/E-патогена в образце (например, в яйце, фекалиях, крови или кишечнике). Выявление может включать в себя контакт нуклеотидной последовательности с зондом или праймером, по существу идентичным последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-21 или 60-72, или нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидную последовательность, по существу идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или их части, или может включать в себя контакт аминокислотной последовательности с антителом, которое специфически связывается с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или его фрагментом, или вариантом.

В альтернативных вариантах изобретение также относится к способам индукции иммунного ответа против A/E-патогена или его компонента, или для снижения колонизации A/E-патогеном или выделения A/E-патогена из животного (например, человека; жвачного, такого как овцы, козы, крупный рогатый скот, и т.д.; или любого другого животного, такого как свиньи, кролики, домашняя птица (например, утки, куры, индейки) и т.д.), путем идентификации животного, инфицированного A/E-патогеном или имеющего риск инфицирования им; и введения животному эффективного количества композиции, включающей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу идентичную последовательности любой одной или нескольких SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84; нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, по существу идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84; молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, по существу идентичную последовательности любой одной или нескольких из SEQ ID NO: 1-21 или 60-72; или надосадочную жидкость клеточной культуры, содержащую такие полипептиды, что, таким образом, вызывает иммунный ответ или снижает колонизацию A/E-патогеном или выделение A/E-патогена из животного.

В альтернативных аспектах изобретение также относится к способу ослабления вирулентности A/E-патогена, путем предоставления A/E-патогена; и мутации гена, такого как nleS, nleB, nleC, nleD, nleE, nleF, nleG, или nleH, или их гомолога в A/E-патогене, или мутации одной или нескольких нуклеотидных последовательностей в геноме A/E-патогена, где нуклеотидная последовательность выбрана из SEQ ID NO: 1-21 или 60-72, с ослаблением за счет этого вирулентности.

В альтернативных аспектах изобретение также относится к способу скрининга соединения, которое ослабляет вирулентность A/E-патогена, путем предоставления системы (например, клетки, например, клетки EHEC, EPEC или C. rodentium, экспериментального животного или системы in vitro), включающей: полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу идентичную последовательности любой одной или нескольких из SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или их фрагменту, или варианту; нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, по существу идентичную последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или их фрагменту, или варианту; или молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, по существу идентичную любой одной или нескольких последовательностей из SEQ ID NO: 1-21, или 60-72, или их варианту, или фрагменту; предоставления тестируемого соединения; и определения того, модулирует ли тестируемое соединение экспрессию, секрецию или биологическую активность полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты, где изменение, например снижение экспрессии, секреции, или биологической активности полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты, указывает на соединение, которое ослабляет вирулентность A/E-патогена.

В альтернативных вариантах изобретение также относится к способу продукции фактора вирулентности A/E-патогена путем предоставления рекомбинантной клетки, включающей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по существу идентичную любой из SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или их фрагменту, или варианту; нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептидную последовательность, по существу, идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или их фрагмента, или варианта; или молекулу нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, по существу идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-21, или 60-72, или их фрагменту, или варианту; выращивания рекомбинантной клетки в условиях, которые обеспечивают экспрессию и/или секрецию полипептида, и, необязательно, выделения полипептида. В некоторых вариантах осуществления полипептид может секретироваться из клетки.

В альтернативных вариантах изобретение также относится к способу лечения или профилактики инфекции, вызываемой A/E-патогеном, путем идентификации млекопитающего, имеющего инфекцию, вызванную A/E-патогеном или имеющего риск такой инфекции; и введения млекопитающему эффективного количества соединения, которое ослабляет вирулентность A/E-патогена, где соединение ингибирует экспрессию или секрецию полипептида, включающего аминокислотную последовательность, по существу идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или их фрагменту, или варианту. В некоторых вариантах осуществления соединение может представлять собой антисмысловую молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную в отношении нуклеотидной последовательности, по существу идентичной любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-21, или 60-72, или их фрагменту, или варианту, или может представлять собой siРНК.

В альтернативных вариантах изобретение также относится к рекомбинантному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, по существу идентичную последовательности SEQ ID NO: 22-43, 59, или 73-84, или к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, по существу идентичную последовательности SEQ ID NO: 1-21 или 60-72; и/или к вектору, включающему такие нуклеотидные последовательности; и/или к клетке-хозяину (например, к A/E-патогену, такому как энтерогеморрагическая E. coli (EHEC), энтеропатогенная E. coli (EPEC) или Citrobacter rodentium), включающей такие векторы. Вектор может иметь способность интегрироваться в геном A/E-патогена или может не обладать такой способностью.

В альтернативных аспектах изобретение также относится к применению композиций, бактерий, полипептидов, или молекул нуклеиновой кислоты по изобретению, для получения лекарственного средства для индукции иммунного ответа против A/E-патогена, или его компонента, или для снижения выделения, или колонизации A/E-патогена у животного.

В альтернативных аспектах изобретение также относится к наборам, включающим реагент для выявления в образце A/E-патогена и вкладыш в упаковку с инструкциями для выявления в образце A/E-патогена. Реагент может включать в себя зонд, или праймер-зонд, или праймер, по существу идентичный в отношении: нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из одной или нескольких из последовательностей SEQ ID NO: 1-21, или 60-72, или их фрагмента, или варианта, или нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, по существу идентичный одной или нескольким последовательностям SEQ ID NO: 22-43, 59, 73-84, или их фрагменту, или варианту, или антитело, которое специфически связывается с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из одной или нескольких последовательностей из SEQ ID NO: 22-43, 59, 73-84, или их фрагмента, или варианта.

«A/E-патоген» представляет собой патоген, например патогенную бактерию E. coli, который может связываться с поверхностями кишечника животного, например млекопитающего, например крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, кроликов, собак, кошек, и т.д., или видов птиц, например кур, уток, индеек, и т.д., и вызывать появление характерного гистологического очага повреждения, называемого очагом прикрепления и сглаживания (A/E) (8). В целом, инфекция, вызванная A/E-патогеном, может приводить к диарее, энтероколиту, заболеванию почек (например, к гемолитико-уремическому синдрому).

Однако инфекция, вызываемая A/E-патогеном, не обязательно проявляется в симптомах заболевания; млекопитающее-хозяин, инфицированное A/E-патогеном, может являться носителем патогена и оставаться здоровым и не больным. Таким образом, млекопитающие, инфицированные A/E-патогеном или имеющие риск такого инфицирования, включают животных, например сельскохозяйственных животных, таких как домашняя птица, например кур, индеек, уток, или жвачные, например крупный рогатый скот, овцы, козы, и т.д., или других сельскохозяйственных животных, например свиней, у которых не проявляются симптомы заболевания, а также включают людей, чувствительных к тяжелому кишечному заболеванию в результате инфекции, вызываемой A/E-патогеном.

Неограничивающие примеры A/E-патогенов включают энтерогеморрагическую E. coli (EHEC) (также известную как продуцирующая шигатоксин E. coli (STEC) или продуцирующая веротоксин E. coli (VTEC)), например серотипы EHEC 0157 (например, EHEC0157:H7, геномная последовательность которой описана в инвентарных номерах AE005594, AE005595, AP002566, AE 005174, NC_002695 или NC_002655) или 0158, 05, 08, 018, 026, 045, 048, 052, 055, 075, 076, 078, 084, 91, 0103, 0104, 0111, 0113, 0114, 0116, 0118, 0119, 0121, 0125, 028, 0145, 0146, 0163, 0165; энтеропатогенную E. coli (EPEC); а также патогенную E. coli, инфицирующую мышей (например, Citrobacter rodentium); свиней; овец; собак; и других млекопитающих.

Многие штаммы A/E-патогенов коммерчески доступны, например, посредством American Type Culture Collection (ATCC), Manassus, Виргиния, США. A/E-патогены могут также выделяться из инфицированных субъектов, например, непосредственным высеванием на сорбитный агар MacConkey, дополненный цефиксимом и теллуритом, или путем иммуномагнитного обогащения с последующим высеванием на ту же среду (72, 107, 108).

«Белок», «пептид» или «полипептид» представляет собой любую цепь из двух или нескольких аминокислот, включающих встречающие в природе или неприродные аминокислоты или аналоги аминокислот, вне зависимости от посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования или фосфорилирования). «Аминокислотная последовательность», «полипептид», «пептид» или «белок» по изобретению могут включать пептиды или белки, которые имеют аномальные связи, перекрестные связи или концевое кэпирование, непептидные связи или альтернативные модифицирующие группы. Такие модифицированные пептиды также входят в объем изобретения. Термин «модифицирующие агенты», как подразумевается, включает структуры, непосредственно присоединенные к пептидной структуре (например, ковалентным присоединением), а также те, которые непрямым образом присоединены к пептидной структуре (например, путем стабильной нековалентной ассоциации или путем ковалентного присоединения к дополнительным аминокислотным остаткам, или их миметики, аналоги или производные, которые могут фланкировать центральную пептидную структуру). Например, модифицирующая группа может присоединяться к N-концу или к С-концу пептидной структуры или к области пептида или пептидомиметика, фланкирующего центральный домен.

Альтернативно, модифицирующая группа может присоединяться к боковой цепи, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка пептидной структуры или к области пептида или пептидомиметика, фланкирующего центральный домен (например, через эпсилон-аминогруппу остатка(-ов) лизина, через карбоксигруппу остатка(-ов) аспарагиновой кислоты или остатка(-ов) глутаминовой кислоты, через гидроксигруппу остатка(-ов) тирозина, остатка(-ов) серина или остатка(-ов) треонина или другой подходящей реакционноспособной группы боковой цепи аминокислоты). Модифицирующие группы, ковалентно связанные с пептидной структурой, могут присоединяться посредством и с использованием способов, хорошо известных в данной области, для связывания химических структур, включающих, например, связи амида, алкиламино, карбамата или мочевины.

Термины «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» охватывают РНК (плюс- и минус-цепи) и ДНК, включающую кДНК, геномную ДНК, и синтетическую (например, химически синтезированную) ДНК. Нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной или одноцепочечной. Когда нуклеиновая кислота одноцепочечная, она может являться смысловой цепью или антисмысловой цепью. Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой любую цепь из двух или большего числа ковалентно связанных нуклеотидов, включая встречающиеся в природе или неприродные нуклеотиды, или аналоги или производные нуклеотидов. «РНК» означает последовательность двух или большего числа ковалентно связанных, встречающихся в природе или модифицированных рибонуклеотидов. Одним из примеров модифицированной РНК, включенной в данный термин, является фосфотиоатная РНК. Под «ДНК» подразумевается последовательность двух или большего числа ковалентно связанных, встречающихся в природе или модифицированных рибонуклеотидов. Под «кДНК» подразумевается комплементарная или копийная ДНК, продуцированная с РНК-матрицы под действием РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). «Клон кДНК» означает дуплексную последовательность ДНК, комплементарную интересующей молекуле РНК, которая включена в клонирующий вектор. Под «комплементарностью» подразумевается, что две нуклеиновые кислоты, например ДНК или РНК, содержат достаточное число нуклеотидов, которые способны образовывать пары оснований Уотсона-Крика, образуют область двухцепочечности двух нуклеиновых кислот. Таким образом, аденин в одной цепи ДНК или РНК образует пару с тимином в противоположной комплементарной цепи ДНК или с урацилом в противолежащей комплементарной цепи РНК. Следует понимать, что каждый нуклеотид в молекуле нуклеиновой кислоты не обязательно должен образовывать точную пару оснований Уотсона-Крика с нуклеотидом в противолежащей комплементарной цепи с образованием дуплекса. Молекула нуклеиновой кислоты «комплементарна» в отношении другой молекулы нуклеиновой кислоты, если она гибридизуется, в условиях высокой жесткости, со второй молекулой нуклеиновой кислоты.

Используемый здесь термин «надосадочная жидкость клеточной культуры» в основном относится к надосадочной жидкости, полученной в результате культивирования бактерии или другого организма (например, дрожжей) или клетки (например, клетки насекомых), которая способна секретировать один или несколько полипептидов, включающих аминокислотную последовательность, по существу, идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 22-43, 59, 73-84, или их фрагменту, или варианту, или их иммуногенной части, в клеточную культуральную среду. В некоторых вариантах осуществления надосадочная жидкость культуры клеток является по существу чистой, т.е., по существу, лишенной бактериальных клеток или лизата таких клеток.

В некоторых вариантах осуществления надосадочная жидкость клеточной культуры также может содержать один или несколько из полипептидов EspA, EspB, EspD, Tir, интимина, шигатоксина 1 или 2, или EspP, или их фрагментов, или агрегатов.

Бактерия может представлять собой A/E-патоген, например EHEC, EPEC или Citrobacter rodentium, которая, в некоторых вариантах осуществления может модифицироваться или мутироваться, или преимущественно экспрессировать или секретировать описанные здесь белки, или может представлять собой некоторую другую бактерию, например непатогенную бактерию, например непатогенную E. coli, такую как HB101, или не-A/E-патоген, который был модифицирован или мутирован, например, рекомбинантным или другим способом, так что он стал секретировать один или несколько описанных здесь белков, например полипептид, включающий аминокислотную последовательность, по существу идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 22-43, 59, 73-84, или их фрагменту, или варианту, или его иммуногенную часть, в клеточную культуральную среду. В некоторых вариантах осуществления бактерия не является EHEC или EPEC.

В некоторых вариантах осуществления, в которых бактерия является A/E-патогеном, она также может нести дальнейшую модификацию, которая ослабляет ее способность экспрессировать или секретировать полипептид (например, EspA, EspB, EspD, Tir, интимин, шигатоксин 1 или 2, или EspP), который в норме будет секретировать его в отсутствие модификации. В некоторых вариантах осуществления другой организм (например, дрожжи) или клетка (например, клетка насекомого) модифицированы или мутированы, например, рекомбинантным или другим способом, так что они секретируют один или несколько описанных здесь белков, например полипептид, включающий аминокислотную последовательность, по существу идентичную любой из последовательностей SEQ ID NO: 22-43, или ее иммуногенной части, в клеточную культуральную среду.

Соединение является «по существу чистым» или «выделенным», когда оно отделено от компонентов, которые сопутствуют ему в природе. Обычно соединение является по существу чистым, когда оно составляет, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, или 60%, или, более обычно, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% по массе от всего материала образца.

Таким образом, полипептид, который химически синтезирован или продуцирован рекомбинантной технологией, в основном по существу лишен ассоциированных с ним в природе компонентов. Полипептид также в основном является, по существу чистым, если он отделен от ассоциированных с ним в природе компонентов физическими методами, такими как центрифугирование, преципитация, колоночная хроматография, гель-электрофорез, ВЭЖХ, и т.д.

Молекула нуклеиновой кислоты, в основном, является по существу чистой или «выделенной», когда она не является непосредственно слитой (т.е. ковалентно связанной) с кодирующей последовательностью, к которой она обычно прилегает в имеющемся в природе геноме организма, из которого происходит ДНК по изобретению. Поэтому «выделенный» ген или молекула нуклеиновой кислоты, как подразумевается, означает ген или молекулу нуклеиновой кислоты, которая не фланкирована молекулами нуклеиновой кислоты, которые обычно (в природе) фланкируют ген или молекулу нуклеиновой кислоты (как в геномных последовательностях), и/или полностью или частично очищена от других транскрибируемых последовательностей (например, в библиотеке кДНК или РНК). Например, выделенная нуклеиновая кислота по изобретению может быть по существу выделена от комплексной клеточной среды, в которой он присутствует в природе. В некоторых случаях выделенный материал образует часть композиции (например, неочищенный экстракт содержит другие вещества), буферной системы или смеси реагентов.

В других обстоятельствах материал может очищаться до достаточной гомогенности, что, например, определяется путем электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) или колоночной хроматографии, такой как ВЭЖХ. Поэтому данный термин включает в себя, например, рекомбинантную нуклеиновую кислоту, введенную в вектор, такой как автономно реплицирующаяся плазмида или вирус; или в геномную ДНК прокариота или эукариота, или ту, которая существует в отдельной молекуле (например, фрагменте кДНК или геномной ДНК, продуцированной путем ПЦР или обработки рестрикционной эндонуклеазой), независимо от других последовательностей. Она также включает рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительных полипептидных последовательностей. Предпочтительно, выделенная нуклеиновая кислота включает в себя, по меньшей мере, примерно 50, 80 или 90 процентов (на основе молярного соотношения) всех присутствующих видов макромолекул. Таким образом, выделенный ген или молекула нуклеиновой кислоты может включать ген или молекулу нуклеиновой кислоты, которая синтезирована химически или рекомбинантными способами. Рекомбинантные ДНК, содержащиеся в векторе, включены в используемое здесь определение «выделенный». Также выделенные молекулы нуклеиновой кислоты включают молекулы рекомбинантной ДНК в гетерологичных клетках-хозяевах, а также частично или по существу очищенные молекулы ДНК в растворе. Полученные in vivo и in vitro РНК-транскрипты молекул ДНК по настоящему изобретению также относятся к «выделенным» молекулам нуклеиновой кислоты. Такие выделенные молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться в производстве кодируемого полипептида, в качестве зонда для выделения гомологичных последовательностей (например, из других видов млекопитающих), для картирования гена (например, путем гибридизации in situ с хромосомами), или для выявления экспрессии гена в ткани (например, в человеческой ткани, такой как периферическая кровь), например, путем анализа нозерн-блоттингом.

По существу чистое соединение может быть получено, например, экстракцией из природного источника; экспрессией рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидное соединение; или путем химического синтеза. Чистота может измеряться с использованием любого подходящего способа, такого как колоночная хроматография, гель-электрофорез, ВЭЖХ, и т.д.

По существу чистый препарат клетки, например бактериальной клетки, представляет собой препарат клетки, в которой контаминирующие клетки, которые не имеют требуемого мутантного генотипа, или не экспрессируют или не секретируют требуемый полипептид в подходящих количествах, составляют менее 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% общего количества клеток в препарате.

Различные гены и последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению может представлять собой рекомбинантные последовательности. Термин «рекомбинантный» означает, что нечто подлежало рекомбинации, так что при ссылке на конструкцию нуклеиновой кислоты термин относится к молекуле, которая составлена последовательностями нуклеиновой кислоты, которые объединены вместе или продуцированы посредством способов молекулярной биологии. При ссылке термина «рекомбинантный» на белок или полипептидную молекулу данный термин означает, что белковая или полипептидная молекула экспрессирована с использованием рекомбинантной конструкции нуклеиновой кислоты, созданной посредством способов молекулярной биологии. При ссылке термина «рекомбинантный» на генетическую композицию данный термин относится к гамете или к потомству с новыми комбинациями аллелей, которые не присутствовали в исходных геномах. Конструкции рекомбинантной нуклеиновой кислоты могут включать нуклеотидную последовательность, которая лигирована с последовательностью нуклеиновой кислоты, с которой она не лигирована в природе или с которой она лигирована в природе в другом положении, или данная нуклеиновая кислота подвергается манипуляциям, приводящим к такому лигированию. Поэтому ссылка на конструкцию нуклеиновой кислоты как на «рекомбинантную» указывает на то, что молекула нуклеиновой кислоты подвергалась манипуляциям с использованием генной инженерии, т.е. за счет человеческого вмешательства.

Рекомбинантные конструкции нуклеиновой кислоты могут, например, вводиться в клетку-хозяина путем трансформации. Такие рекомбинантные конструкции нуклеиновой кислоты могут включать последовательности, происходящие из одного вида клеток-хозяев или из различных видов клеток-хозяев, которые могут выделяться и повторно вводиться в клетки вида хозяина. Последовательности рекомбинантных конструкций нуклеиновой кислоты могут становиться интегрированными в геном клетки-хозяина, в результате исходной трансформации клеток-хозяев, или в результате последующих событий рекомбинации и/или репарации.

Используемый здесь термин «гетерологичный» в отношении нуклеиновой кислоты или белка представляет собой молекулу, с которой манипулировали за счет человеческого вмешательства, так что она локализуется в месте, отличном от места, в котором она находится в природе. Например, последовательность нуклеиновой кислоты из одного вида может вводиться в геном другого вида, или последовательность нуклеиновой кислоты из одного геномного локуса может перемещаться в другой геномный или внехромосомный локус того же вида. Гетерологичный белок включает, например, белок, экспрессированный с гетерологичной кодирующей последовательности или белок, экспрессированный с рекомбинантного гена в клетке, которая в природе не экспрессирует данный белок.

«По существу идентичная» последовательность представляет собой аминокислотную или нуклеотидную последовательность, которая отличается от последовательности сравнения только одной или несколькими консервативными заменами, описанными выше, или одной или несколькими неконсервативными заменами, делециями или вставками, расположенными в тех положениях последовательности, которые не отменяют биологической функции аминокислотной молекулы или молекулы нуклеиновой кислоты. Такая последовательность может характеризоваться идентичностью, составляющей любое целое число от 10% до 99%, или, более конкретно, по меньшей мере, от 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55% или 60%, или, по меньшей мере, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, или 95%, или, как минимум 96%, 97%, 98%, или 99%, в отношении аминокислотной последовательности или последовательности нуклеотидов, использованной для сравнения, с применением, например, программы Align (96) или FASTA. Для полипептидов длина последовательностей сравнения может составлять, по меньшей мере, 2, 5, 10, или 15 аминокислот, или, по меньшей мере, 20, 25, или 30 аминокислот. В альтернативных вариантах осуществления длина последовательностей сравнения может составлять, по меньшей мере, 35, 40, или 50 аминокислот, или свыше 60, 80, или 100 аминокислот. Для молекул нуклеиновой кислоты длина последовательностей сравнения может составлять, по меньшей мере, 5, 10, 15, 20, или 25 нуклеотидов, или, по меньшей мере, 30, 40, или 50 нуклеотидов. В альтернативных вариантах осуществления длина последовательностей сравнения может составлять, по меньшей мере, 60, 70, 80, или 90 нуклеотидов, или свыше 100, 200, или 500 нуклеотидов. Идентичность по последовательности может легко измеряться с использованием программного обеспечения для анализа последовательности (например, пакета программного обеспечения Sequence Analysis Software Package от Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, или программного обеспечения BLAST, доступного от National Library of Medicine, или как описано здесь).

Примеры подходящего программного обеспечения включают в себя программы Pile-up и PrettyBox. Такое программное обеспечение ищет сходные последовательности путем оценки гомологии различных замен, делеций и других модификаций.

Альтернативно или дополнительно, две последовательности нуклеиновой кислоты могут быть «по существу идентичными», если они гибридизуются в условиях высокой жесткости. В некоторых вариантах осуществления условия высокой жесткости представляют собой, например, условия, которые обеспечивают гибридизацию, сравнимую с гибридизацией, которая происходит с использованием ДНК-зонда, по меньшей мере, 500 нуклеотидов в длину, в буфере, содержащем 0,5M NaHPO₄, pH 7,2, 7% SDS, 1 мМ EDTA и 1% BSA (фракция V), при температуре 65ºC, или в буфере, содержащем 48% формамида, 4,8× SSC, 0,2M Tris-Cl, pH 7,6, 1× раствор Denhardt, 10% декстран-сульфат, и 0,1% SDS, при температуре 42°C. (Это обычные жесткие условия для нозерн- или саузерн-гибридизации.) Гибридизации можно проводить в течение периода примерно от 20 до 30 минут, или примерно от 2 до 6 часов, или примерно от 10 до 15 часов, или свыше 24 часов или более. Условия гибридизации высокой жесткости обеспечивают успех многих способов, рутинно выполняемых молекулярными биологами, например ПЦР высокой жесткости, секвенирования ДНК, анализа одноцепочечного конформационного полиморфизма, и гибридизации in situ. В отличие от нозерн- и саузерн-гибридизации, данные способы рутинно выполняются с относительно короткими зондами (например, обычно 16 нуклеотидов или длиннее для ПЦР или секвенирования и примерно 4