Модифицированный коагулирующий фактор viia с продленным временем полужизни

Модифицированный коагулирующий фактор viia с продленным временем полужизни

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области слитых с альбумином полипептидов фактора VII (FVII) и фактора VIIa (FVIIa). Более конкретно, изобретение относится к последовательностям кДНК, кодирующим человеческие фактор VII, фактор VIIa и производные, генетически слитые с кДНК, кодирующими человеческий сывороточный альбумин, который может быть связан через олигонуклеотиды, которые кодируют промежуточные пептидные линкеры, где подобные кодированные производные демонстрируют улучшенную стабильность и удлиненное функциональное время полужизни в плазме, к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим такие последовательности кДНК, клеткам-хозяевам, трансформированным такими рекомбинантными векторами экспрессии, рекомбинантным полипептидам и производным, которые имеют биологическую активность немодифицированного белка дикого типа, но обладают повышенной стабильностью и удлиненным сроком годности, и к способам получения таких рекомбинантных белков и их производных. Изобретение также охватывает вектор переноса для применения в генной терапии человека, который содержит такие модифицированные последовательности ДНК.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Фактор VII и фактор VIIa

Гемофилия А представляет собой врожденное нарушение свертываемости крови. Она представляет собой следствие дефицита фактора коагуляции крови VIII, связанного с Х-хромосомой, и поражает почти исключительно мужчин, число случаев заболевания составляет между одним и двумя людьми на 10000 человек. Дефект Х-хромосомы передается носителями женского пола, которые сами гемофилией не страдают. Клиническое проявление гемофилии А состоит в повышенной тенденции к кровотечению. До введения в обиход лечения концентратами фактора VIII продолжительность жизни человека с тяжелой формой гемофилии составляла менее 20 лет. Использование концентратов фактора VIII из плазмы и позже рекомбинантных форм фактора VIII значительно улучшило ситуацию для пациентов, страдающих гемофилией, существенно увеличив среднюю продолжительность их жизни, давая большинству из них возможность жить более или менее нормальной жизнью. Гемофилия В, которая в 5 раз меньше распространена, чем гемофилия А, вызвана нефункциональным или недостающим фактором IX и лечится концентратами фактора IX из плазмы или рекомбинантной формой фактора IX. Как при гемофилии А, так и при гемофилии В самой серьезной медицинской проблемой при лечении болезни является образование алло-антител к заменяющим факторам. До 30% всех пациентов, страдающих гемофилией А, вырабатывает антитела к фактору VIII. Антитела к фактору IX встречаются реже, но с более тяжелыми последствиями, поскольку они менее восприимчивы к терапии путем индукции иммунной толерантности.

Принятая в настоящее время модель коагуляции констатирует, что физиологическим триггером коагуляции является образование комплекса между тканевым фактором (TF) и фактором VIIa (FVIIa) на поверхности клеток, экспрессирующих TF, которые обычно расположены вне сети сосудов. Это приводит к активации фактора IX и фактора X, что, в конечном счете, приводит к получению некоторого количества тромбина. В петле положительной обратной связи тромбин активирует фактор VIII и фактор IX, так называемый "врожденный" рычаг каскада коагуляции крови, усиливая, таким образом, образование фактора Ха, который необходим для формирования полного вброса тромбина, чтобы получить полный гемостаз. Было показано, что при введении сверхфизиологических концентраций фактора VIIa гемостаз достигается без необходимости в факторе VIIIa и факторе IXa. Клонирование кДНК для фактора VII (US 4784950) позволило разработать активированный фактор VII в качестве фармацевтического продукта. Фактор VIIa впервые был успешно применен в 1988 году. С тех пор количество показаний для применения фактора VIIa устойчиво растет, выявляя его потенциал для того, чтобы стать универсальным гемостатическим средством для остановки кровотечения (Erhardtsen, Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis 2002, Vol.23, Supplement 1, стр.47-52). Однако короткое время полужизни фактора VIIa, составляющее около 2 часов, ограничивает возможности его применения.

FVII представляет собой одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, который секретируется клетками печени в кровоток как неактивный профермент в 406 аминокислот. Он содержит 10 γ-карбокси-остатки глютаминовой кислоты (положения 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 и 35), расположенные в N-концевом Gla-домене белка. Для биосинтеза остатков Gla требуется витамин K. С C-концевой стороны Gla-домена расположены два домена эпидермального фактора роста, за которыми идет сопровождаемый домен сериновой протеазы трипсинового типа. Дополнительные посттрансляционые модификации FVII включают гидроксилирование (Asp 63) и гликозилирование N-(Asn145 и Asn322), а также O-типа (Ser52 и Ser60).

FVII преобразуется в свою активную форму, фактор VIIa, протеолизом одной пептидной связи Arg152-Ile153, что приводит к образованию двух полипептидных цепей - N-концевой легкой цепи (24 кДа) и C-концевой тяжелой цепи (28 кДа), которые удерживаются вместе одним дисульфидным мостиком. В противоположность другим зависимым от витамина К факторам коагуляции, для случая FVII не был описан никакой активационный пептид, который бы отщеплялся во время активации этих других факторов коагуляции, зависимых от витамина К. Сайт расщепления Arg152-Ile153 и некоторые аминокислоты ниже демонстрируют гомологию активационному сайту расщепления других зависимых от витамина К полипептидов.

Существенным для достижения активной конформации фактора VIIa является образование солевого мостика после активационного расщепления между Ile153 и Asp343. Активационное расщепление фактора VII может быть достигнуто in vitro с помощью фактора Ха, фактора XIIa, фактора 1Ха, фактора VIIa, фактора 7 активации протеазы (FSAP) и тромбина. Mollerup et al. (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505), сообщили, что некоторое расщепление также имеет место в тяжелой цепи в Arg290 и/или Arg315.

Фактор VII присутствует в плазме в концентрации 500 нг/мл. 1%, например, 5 нг/мл фактора VII присутствует как фактор VIIa. Было найдено, что время полужизни в плазме фактора VII равно приблизительно 4 часам, а фактора VIIa - приблизительно 2 часам. Хотя время полужизни фактора VIIa, равное 2 часам, сравнительно велико для активированного фактора коагуляции (для других активированных факторов коагуляции оно куда более порядка минут из-за необратимого ингибирования серпинами типа антитромбина III), это, тем не менее, представляет собой серьезный недостаток для терапевтического применения фактора VIIa, поскольку приводит к необходимости многократных внутривенных инъекций или непрерывного вливания, чтобы достичь гемостаза. Это сильно увеличивает стоимость лечения и создает неудобства для пациента. До нынешнего момента коммерчески не доступен никакой фармацевтический препарат фактора VIIa с улучшенным временем полужизни в плазме; также не опубликовано никаких данных, показывающих варианты FVII/FVIIa с удлиненным временем полужизни in vivo. Поскольку фактор VII/VIIa имеет потенциал для того, чтобы использоваться как универсальное гемостатическое средство, все еще существует большая медицинская потребность в разработке форм фактора VIIa, который имеет более длительное функциональное время полужизни in vivo.

Ballance et al. (WO 01/79271) описывает слитые полипептиды множества различных терапевтических белков или вариантов и/или фрагментов указанных терапевтических белков, которые, когда они слиты с человеческим сывороточным альбумином или вариантами и/или фрагментами указанного альбумина, как предсказывается, имеют увеличенное функциональное время полужизни in vivo и удлиненный срок хранения. Описаны длинные перечни потенциальных партнеров по слитию клеток без показа посредством экспериментальных данных, почти для всех этих белков, что соответствующие слитые с альбумином полипептиды на деле сохраняют биологическую активность партнера по слитию терапевтического белка и имеют улучшенные свойства. Также согласно WO 01/79271 каждый член из перечня терапевтических белков может быть слит во многих различных ориентациях с альбумином, например, две молекулы терапевтического белка могут быть слиты одна с N-концом, а другая - с С-концом альбумина, или одна молекула терапевтического белка может быть слита или с N-концом, или С-концом альбумина, или множественные области каждого белка могут быть слиты с множественными областями другого белка. Среди множества терапевтических белков, перечисленных в WO 01/79271, как потенциальные партнеры альбумина по слитию упомянуты факторы IX и FVII/FVIIa, но ни для одного из этих белков не представлены никакие экспериментальные доказательства принципа действия.

Шеффилд экспрессировал полипептид фактора IX (фактора протромбина, состоящего из 415 аминокислот), слитого с альбумином, и показал в фармакокинетических экспериментах, что поведение полипептида фактора IX, слитого с альбумином, в плане клиренса у кроликов более точно напоминало поведение фактора IX, нежели альбумина, с демонстрацией только умеренного увеличения окончательного времени полужизни (менее чем двукратного) (Sheffield W.P. et al. (2004) Br. J. Haematol. 126:565-573).

Исходя из результатов Шеффилда и из-за высокой гомологии между факторами IX и VII (оба являются факторами протромбина, зависимыми от витамина K) и их сопоставимого размера, специалист в данной области предположил бы, что фактор VII также не выиграет от слияния с альбумином в отношении функционального времени полужизни in vivo.

Техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, таким образом, состояла в том, чтобы разработать функциональные слитые белки FVIIa-альбумин, которые сохраняют биологическую активность и демонстрируют увеличенное функциональное время полужизни in vivo.

В этом отношении биологическая активность полипептида фактора VII/VIIa относится к его способности активировать факторы коагуляции IX и Х в присутствии тканевого фактора, после того как он сам активирован.

Функциональное время полужизни в плазме in vivo относится к времени полужизни биологической активности слитого полипептида фактора VII/VIIa, когда он введен в плазму. Предпочтительно, плазма представляет собой человеческую плазму.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что слитые с альбумином полипептиды, содержащие, по меньшей мере, один полипептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, слитые с альбумином, или его фрагмент, или вариант, в котором, по меньшей мере, одна молекула фактора VII или фактора VIIa расположена на N-конце слитого белка, дают слитые полипептиды с биологически активной частью фактора VII/фактора FVIIa.

Одним аспектом изобретения являются, таким образом, биологически активные слитые белки, в которых полипептиды фактора VII/VIIa слиты с N-концом человеческого сывороточного альбумина. Слитые белки демонстрируют, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, более 40%, даже более предпочтительно, более 70% и, наиболее предпочтительно, более 90% молярной специфической активности фактора VII/VIIa дикого типа.

Дополнительно, к удивлению, было найдено, что в отличие от слитий фактора IX с N-концом человеческого сывороточного альбумина, как опубликовано Шеффилдом, альбуминовые слития фактора VII/VIIa с N-концом человеческого сывороточного альбумина давали слитые белки фактора VII/FVIIa, которые не только сохраняли биологическую активность фактора VII/FVIIa, но также показывали значительное увеличение функционального времени полужизни в плазме фактора VII/VIIa in vivo.

Экспрессия конструкций слитого альбумина с желаемой частью FVII/FVIIa на С-конце альбумина не была успешной, потому что экспрессированные слитые с альбумином белки не секретировались как интактные молекулы. После перехода через клеточную мембрану наблюдалась расщепление с получением зрелой молекулы FVII/FVIIa, у которой, из-за нарушенного гамма-карбоксилирования, была пониженная молярная специфическая активность, и альбуминовой части с пропептидом FVII, присоединным к ее С-концу. Таким образом, в противоположность раскрытию Ballance et al., было найдено, что только слияние части FVII/FVIIa с N-концом человеческого сывороточного альбумина дает слитый белок с желаемыми биологическими свойствами, соответственно, сохранение биологической активности FVII/FVIIa и увеличенное время полужизни в плазме.

Следующим аспектом изобретения являются, таким образом, биологически активные слитые белки, в которых полипептиды фактора VII/VIIa слиты с N-концом альбумина, которые демонстрируют значительное увеличение функционального времени полужизни в плазме по сравнению с неслитым фактором VII/VIIa. В предпочтительных вариантах осуществления полипептиды FVII/FVIIa, слитого с альбумином, по настоящему изобретению, содержащие полипептид FVII/FVIIa, имеют удлиненное функциональное время полужизни in vivo или более долго длящуюся или повышенную терапевтическую активность по сравнению со временем полужизни in vivo или терапевтической активностью неслитого FVII/FVIIa.

Одним аспектом настоящего изобретения является, таким образом, FVII/FVIIa, слитый с N-концом альбумина, что приводит к удлинению времени полужизни в плазме по сравнению со временем полужизни неслитого FVII/FVIIa, по меньшей мере, на 100%, предпочтительно, более чем на 200%, даже более предпочтительно, более чем на 500% и, наиболее предпочтительно, более чем на 1000%.

В дальнейшем удивительном аспекте настоящего изобретения авторы обнаружили, что полипептиды слитого с альбумином FVII/FVIIa без линкера показывают значительно пониженную биологическую активность, тогда как полипептиды слитого с альбумином FVII/FVIIa, в которых части FVII/FVIIa отделены от альбумина линкером, демонстрируют зависящее от длины линкера повышение биологической активности фактора VII/VIIa. Часть, соответствующая пептиду фактора VII или фактора VIIa, связана с частью, соответствующей альбумину, пептидным линкером, что позволяет, таким образом, слитой молекуле принять конформацию, которая позволяет достичь более высокой молярной специфической активности по сравнению со слитой молекулой без такой линкерной последовательности.

Следовательно, дальнейшим аспектом настоящего изобретения являются полипептиды связанного с альбумином фактора VII/VIIa содержащие линкерный пептид между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и N-концом альбумина, которые имеют повышенную активность биологического фактора VII/VIIa, например, измеренную как молярную специфическую активность, по сравнению со слитыми белками фактора VII/VIIa без таких линкеров. Увеличение молярной специфической активности слитых белков, в которых часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, слита с N-концом альбумина через пептидный линкер, по сравнению с соответствующими слитыми белками без такого линкера, составляет, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, по меньшей мере, 50% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 100%. Эти несущие линкер полипептиды слитого с альбумином фактора VII/VIIa также демонстрируют увеличенное функциональное время полужизни in vivo по сравнению с фактором FVIIa дикого типа. Однако химические линкеры или линкерные системы, такие как, без ограничения, авидин-биотин, будут функционировать аналогично, коль скоро имеются сопоставимые интервалы между частью фактора VII/FVIIa и альбуминовой частью. Ниже термин "пептидный линкер" или ему подобные включают такие другие функциональные линкерные средства, когда они пригодны.

Изобретение охватывает терапевтические полипептиды фактора VII/VIIa, связанного с N-концом альбумина, композиции, фармацевтические композиции, составы и наборы. Изобретение также охватывает применение указанных терапевтических слитых с альбумином полипептидов при определенных медицинских показаниях. Изобретение также охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые с альбумином полипептиды по настоящему изобретению, а также векторы, содержащие эти нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, трансформированные этими нуклеиновыми кислотами и векторами, и способы получения слитых с альбумином полипептидов по настоящему изобретению путем использования этих нуклеиновых кислот, векторов и/или клеток-хозяев.

Изобретение также обеспечивает композицию, содержащую полипептид слитого с альбумином фактора VII/FVIIa, содержащий пептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, необязательно, пептидный линкер, и альбумин, или его фрагмент, или вариант и фармацевтически приемлемый носитель. Еще одной целью изобретения является обеспечение способа лечения пациентов, страдающих нарушениями свертываемости крови. Способ включает стадию введения эффективного количества полипептида, связанного с альбумином FVII/FVIIa.

Еще одной целью изобретения является обеспечение молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность полинуклеотида, кодирующую полипептид связанного с альбумином фактора VII/VIIa, содержащий пептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, необязательно, пептидный линкер, и альбумин, или его фрагмент, или вариант, а также вектора, который содержит такую молекулу нуклеиновой кислоты. Указанная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, расположена на 3'-конце последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пропептид, опосредующий гамма-карбоксилирование слитой части, относящейся к фактору VII/VIIa.

Изобретение также обеспечивает способ получения полипептида слитого с альбумином фактора VII/FVIIa, содержащего пептид фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмент, или вариант, пептидный линкер и альбумин, или его фрагмент, или вариант, где способ включает:

(а) обеспечение нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид связанного с альбумином фактора VII/VIIa, которую можно экспрессировать в клетке млекопитающего;

(b) экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в организме с образованием полипептида связанного с альбумином фактора VII/VIIa; и

(c) очистку полипептида связанного с альбумином фактора VII/VIIa.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к полипептидам слияния с альбумином и способам лечения, предотвращения или смягчения симптомов заболеваний или нарушений. Используемый здесь термин "полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa" относится к полипептиду, который образован путем слияния, по меньшей мере, одной молекулы фактора VII/VIIa (или ее фрагмента, или варианта) с N-концом, по меньшей мере, одной молекулы альбумина (или ее фрагмента, или варианта), причем обе части необязательно разделены пептидным линкером.

Полипептид слитого с альбумином фактора VII/FVIIa по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, фрагмент или вариант фактора VII/FVIIa и, по меньшей мере, фрагмент или вариант человеческого сывороточного альбумина, которые связаны друг с другом, например, генетическим слиянием (т.е. слитый с альбумином полипептид генерирован трансляцией нуклеиновой кислоты, в которой полинуклеотид, кодирующий весь фактор VII/FVIIa или его часть, присоединен «в рамке» к 5'-концу полинуклеотида, кодирующего весь альбумин или его часть, и они необязательно связаны полинуклеотидом, который кодирует линкерную последовательность, вводя линкерный пептид между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью).

В одном варианте осуществления изобретение обеспечивает полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa, включающий биологически активный и/или терапевтически активный фактор VII/VIIa, слитый с N-концом полипептида сывороточного альбумина, или, альтернативно, состоящий из него.

В других вариантах осуществления изобретение обеспечивает слитый полипептид с альбумином, включающий биологически активный и/или терапевтически активный фрагмент фактора VII/VIIa и пептидный линкер, слитый с N-концом сывороточного альбумина, или, альтернативно, состоящий из этого.

В других вариантах осуществления изобретение обеспечивает слитый с альбумином полипептид, включающий биологически активный и/или терапевтически активный вариант фактора VII/VIIa, слитый с N-концом полипептида сывороточного альбумина, и, необязательно, пептидный линкер, или, альтернативно, состоящий из этого.

В дальнейших вариантах осуществления изобретение обеспечивает полипептид слитого с альбумином фактора VII/VIIa, включающий биологически активные и/или терапевтически активные фрагмент или вариант FVII/FVIIa, слитые с N-концом фрагмента или варианта сывороточного альбумина, и, необязательно, пептидный линкер, или, альтернативно, состоящий из этого.

В некоторых вариантах осуществлениях изобретение обеспечивает слитый с альбумином полипептид, включающий зрелую часть FVII/FVIIa, слитую с N-концом зрелой части сывороточного альбумина, и, необязательно, пептидный линкер, или, альтернативно, состоящий из этого.

В соответствии с WO 01/79271 полипептид слития с альбумином, содержащий FVII/FVIIa, может использоваться как терапевтическое средство при показаниях "нарушения свертываемости крови", "гемофилия A и B", "нарушение функции печени" и "геморрагические случаи, связанные с хирургическим вмешательством".

Другим аспектом изобретения является то, что слитый с альбумином полипептид, содержащий FVII/FVIIa, может также использоваться терапевтически при других показаниях. Наиболее предпочтительными показаниями являются "случаи кровотечения и хирургическое вмешательство у пациентов с врожденной или приобретенной гемофилией с ингибиторами к факторам коагуляции (FVIII или FIX)", "обращение дефицитов гемостаза, развившихся как последствие лечения лекарственными средствами, такими как лекарственные средства против тромбоцитов или лекарственные средства против коагуляции", "улучшение вторичного гемостаза", "дефициты гемостаза, развившиеся во время инфекций или во время болезней, такие как дефицит витамина К или тяжелое заболевание печени", "резекция печени", "дефициты гемостаза, развившиеся в результате укусов змеи", "гастроинтестинальные кровотечения", "травма", "последствия массивного переливания (дилюционная коагулопатия)", "дефициты фактора коагуляции отличных от FVIII и FIX", "VWD", "дефицит FI", "дефицит FV", "дефицит FVII", "дефицит FX", "дефицит FXIII", "HUS", "врожденные или приобретенные тромбоцитарные болезни и нарушения, подобные тромбоцитопении, ITP, ТТР, синдром HELLP, синдром Бернара-Сулье, тромбастения Гланцмана, HIT", "синдром Чедиака-Хигаси", "синдром Германски-Пудлака", "синдром Ренду-Ослера", "пурпура Геноха-Шенлейна" и "заживление ран".

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является обеспечение человеческого фактора VII и человеческого фактора VIIa или их фрагментов или вариантов, слитых с N-концом человеческого альбумина или их фрагментов и вариантов с более продолжительным функциональным временем полужизни in vivo по сравнению с человеческим фактором VII и человеческим фактором VIIa, или их фрагментами, или вариантами. Другая цель изобретения состоит в том, чтобы обеспечить человеческий фактор VII и человеческий фактор VIIa, или их фрагменты, или варианты, слитые с N-концом человеческого альбумина, или фрагменты, или варианты с увеличенной молярной специфической активностью. Чтобы достичь этой цели, слития фактора VII или фактора VIIa с N-концом сывороточного альбумина обеспечиваются необязательно с промежуточным пептидным линкером между FVII/FVIIa и альбумином.

В настоящем описании термины "человеческий сывороточный альбумин (HSA)" и "человеческий альбумин (НА)" взаимозаменяемы. Термины "альбумин" и "сывороточный альбумин" являются более широкими и охватывают человеческий сывороточный альбумин (и его фрагменты и варианты), так же как альбумин других разновидностей (и их фрагменты и варианты). Вместо альбумина также могут использоваться другие подобные альбумину белки, например, без ограничения, человеческий альфа-фетопротеин (как он описан в WO 2005/024044), так же как их функциональные фрагменты или варианты.

Термин "альбумин", как он используется здесь, совокупно относится к полипептиду альбумина или к аминокислотной последовательности, или к фрагменту, или варианту альбумина, имеющим одну или более функциональных активностей (например, биологических активностей) альбумина. В частности "альбумин" относится к человеческому альбумину или его фрагментам, особенно к зрелой форме человеческого альбумина, как показано здесь в SEQ ID No:22 или к альбумину других позвоночных или его фрагментам, или аналогам, или вариантам этих молекул или их фрагментам.

Альбуминовая часть слитых с альбумином полипептидов может содержать полноразмерную последовательность НА, как описано выше, или может включать один или более ее фрагментов, которые способны к стабилизации или продлению терапевтической активности. Такие фрагменты могут иметь 10 и более аминокислот в длину, или могут включать приблизительно 15, 20, 25, 30, 50 или более смежных аминокислот из последовательности НА, или могут включать часть или все домены НА.

Альбуминовая часть слитых с альбумином полипептидов по настоящему изобретению может представлять собой вариант нормального НА. Часть, относящаяся к фактору VII слитых с альбумином полипептидов по настоящему изобретению, может также быть вариантами полипептидов фактора VII, как описано здесь. Термин "варианты" включает вставки, удаления и замены, консервативные или неконсервативные, где такие изменения, в основном, не изменяют существенным образом активный центр или активный домен, которые сообщают терапевтическую активность полипептидам фактора VII.

В частности, слитые с альбумином полипептиды по настоящему изобретению могут включать встречающиеся в природе полиморфные варианты человеческого альбумина и фрагменты человеческого альбумина. Альбумин может быть получен из любого позвоночного, особенно любого млекопитающего, например человека, коровы, овцы или свиньи. Альбумины не-млекопитающих включают, без ограничения, альбумины курицы и лосося. Альбуминовая часть слитого с альбумином полипептида может быть получена от иного животного, нежели часть, соответствующая FVII/FVIIa.

Вообще говоря, фрагмент или вариант альбумина будет длиной, по меньшей мере, 20, предпочтительно, по меньшей мере, 40, наиболее предпочтительно, более чем 70 аминокислот. Вариант альбумина может предпочтительно состоять из, по меньшей мере, одного целого домена альбумина или фрагментов указанных доменов, например доменов 1 (аминокислоты 1-194 SEQ ID NO:22), 2 (аминокислоты 195-387 SEQ ID NO:22), 3 (аминокислоты 388-585 SEQ ID NO:22), 1+2 (1-387 SEQ ID NO:22), 2+3 (195-585 SEQ ID. NO:22) или 1+3 (аминокислоты 1-194 SEQ ID NO:22+аминокислоты 388-585 SEQ ID NO:22), или, альтернативно, содержать их. Каждый домен сам по себе образован двумя гомологичными субдоменами, а именно 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 и 512-585 с гибкими межсубдоменными линкерными областями, содержащими остатки от Lys106 до Glu119, от Glu292 до Val315 и от Glu492 до Ala511.

Альбуминовая часть слитого с альбумином полипептида по изобретению может содержать, по меньшей мере, один субдомен, или домен НА, или его консервативные модификации.

Изобретение относится к модифицированному полипептиду фактора VII или фактора VIIa, содержащему соединение полипептида фактора VII или фактора VIIa, или его фрагмента, или варианта с N-концом, полипептида альбумина, или его фрагмента, или варианта, необязательно таким образом, что промежуточный пептидный линкер вводится между модифицированным фактором VII или фактором VIIa и альбумином так, что полипептид модифицированного фактора VII или фактора VIIa имеет увеличенное функциональное время полужизни in vivo по сравнению с полипептидом фактора VII или фактора VIIa, который не был связан с альбумином, или так, что молярная специфическая активность FVII/FVIIa, слитого с альбумином, с промежуточным пептидным линкером превышает молярную специфическую активность FVII/FVIIa, слитого с альбумином, без промежуточного пептидного линкера.

"Фактор VII/VIIa", как этот термин используется в настоящей заявке, означает терапевтический полипептид, состоящий или из неактивированной формы (фактор VII), или из активированной формы (фактор VIIa), или их смесей. "Фактор VII/VIIa" в рамках вышеупомянутого определения включает полипептиды, которые имеют аминокислотную последовательность нативного человеческого фактора VII/VIIa. Он также включает полипептиды с немного модифицированной аминокислотной последовательностью, например с модифицированным N-концом или С-концом, что включает концевые аминокислотные удаления или добавления, коль скоро эти полипептиды по существу сохраняют биологическую активность фактора VIIa. "Фактор VII" в рамках вышеупомянутого определения также включает природные аллельные вариации, которые могут существовать и происходить от человека к человеку. "Фактор VII" в рамках вышеупомянутого определения дополнительно включает варианты FVII/FVIIa. Такие варианты отличаются одним или более аминокислотными остатками от последовательности дикого типа. Примеры таких различий могут включать усечение N- и/или С-конца на один или более аминокислотных остатков (например, от 1 до 10 аминокислотных остатков) или добавление одного или более дополнительных остатков на N-и/или С-конце, так же как и консервативные аминокислотные замены, т.е. замены, выполняемые в рамках групп аминокислот с похожими характеристиками, например (1) малых аминокислот, (2) кислых аминокислот, (3) полярных аминокислот, (4) основных аминокислот, (5) гидрофобных аминокислот и (6) ароматических аминокислот. Примеры таких консервативных замен представлены в следующей таблице.

Таблица 1
(1)	Аланин	Глицин
(2)	Аспарагиновая кислота	Глютаминовая кислота
(3а)	Аспарагин	Глютамин
(3b)	Серин	Треонин
(4)	Аргинин	Гистидин	Лизин
(5)	Изолейцин	Лейцин	Метионин Валин
(6)	Фенилаланин	Тирозин	Триптофан

Слитые белки демонстрируют, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, более 40%, даже более предпочтительно, более 70% и, наиболее предпочтительно, более 90% молярной специфической активности неслитого фактора VII/VIIa дикого типа, или соответствующего фрагмента FVII/FVIIa, или их варианта.

Полипептид FVII/VIIa по настоящему изобретению, связанный через промежуточный пептидный линкер с N-концом альбумина, имеет повышенную молярную специфическую активность по сравнению с молярной специфической активностью гомологичного фактора VII/VIIa, слитого с альбумином, без промежуточного пептидного линкера. Увеличение молярной специфической активности полипептида, связанного с альбумином фактора VII/VIIa по настоящему изобретению, по сравнению с молярной специфической активностью полипептида, слитого с альбумином фактора VII/VIIa, без промежуточного пептидного линкера, составляет, по меньшей мере, 25%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 100% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 200%. Активность фактора VII/VIIa состоит в способности преобразовывать субстратный фактор Х в активный фактор Ха. Активность FVIIa фактора полипептида VII/VIIa, слитого с альбумином, может быть предпочтительно измерена с использованием STACLOT®. Молярная специфическая активность, как она используется в настоящем изобретении, означает: активность, измеренная в анализе STACLOT® после активации слитого белка, связанного с альбумином FVII, в Международных единицах (IU) на 100 IU антигена фактора VII/VIIa, как измерено ELISA.

Полипептиды фактора FVII/FVIIa, связанного с альбумином, по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, на 25% более высокую молярную специфическую активность по сравнению со слитым с альбумином фактором VII/FVIIa без промежуточного пептидного линкера и демонстрируют увеличение функционального времени полужизни in vivo по сравнению с несвязанной формой полипептида фактора VII или фактора VIIa. Функциональное время полужизни in vivo может быть определено, как описано у Lindley et al. (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor VIIa, Clin. Pharmacol Ther. (1994) 55: 638-648).

Полипептиды фактора FVII/FVIIa, связанного с альбумином, по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, на 25% более высокую молярную специфическую активность по сравнению со слитым с альбумином фактором VII/FVIIa без промежуточного пептидного линкера, и их функциональное время полужизни in vivo обычно увеличено, по меньшей мере, на 100%, предпочтительно, по меньшей мере, на 200%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, на 500% по сравнению с несвязанной формой полипептида фактора VII или фактора VIIa.

Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой, таким образом, полипептиды фактора FVII/FVIIa, связанного с альбумином, с пептидным линкером, состоящим, по меньшей мере, из одной аминокислоты, предпочтительно, по меньшей мере, из 3 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, из 7 аминокислот и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, из 25 аминокислот.

Функциональное время полужизни in vivo формы дикого типа человеческого фактора VII составляет приблизительно 4 часа в человеческом организме. Функциональное время полужизни полипептидов фактора VII, связанного с альбумином, по настоящему изобретению, составляет обычно, по меньшей мере, приблизительно 8 часов, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 12 часов, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 24 часа.

Функциональное время полужизни in vivo формы дикого типа человеческого фактора VIIa дикого типа составляет приблизительно 2 часа в человеческом организме. Функциональное время полужизни полипептидов фактора VIIa, связанного с альбумином, по настоящему изобретению составляет обычно, по меньшей мере, приблизительно 4 часа, предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 6 часов, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 12 часов.

Согласно изобретению часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, соединена с альбуминовой частью пептидным линкером. Линкер является предпочтительно гибким и неиммуногенным и создает интервал между человеческим альбумином и FVII/FVIIa, который минимизирует потенциальную интерференцию этих двух партнеров по слитию, что приводит к повышенной активности FVII/FVIIa слитого белка. Примеры линкеров включают (GGGGS)_N, или (GGGS)_N, или (GGS)_N, где N представляет собой целое число, большее или равное 1, и где G представляет собой глицин, a S представляет собой серин. Эти аминокислоты принадлежат к группе природных аминокислот и были выбраны как примеры для всех возможных природных аминокислот.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения пептидный линкер между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью содержит консенсусные сайты для посттрансляционых модификаций. Предпочтительно, такие модификации состоят из сайтов гликозилирования. Более предпочтительно, такие модификации состоят, по меньшей мере, из одного сайта N-гликозилирования структуры Asn-X-Ser/Thr, где Х обозначает любую аминокислоту кроме пролина. Даже более предпочтительно, такие сайты N-гликозилирования вставлены около амино- и/или карбокси-конца пептиднного линкера так, что они способны экранировать потенциальные неоэпитопы, которые могут образоваться в последовательностях, где часть, относящаяся к фактору VII/VIIa, переходит в пептидный линкер, и где пептидный линкер переходит в последовательность альбуминовой части соответственно.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидный линкер между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и альбуминовой частью состоит из последовательностей пептида, которые служат как естественные междоменные линкеры в человеческих белках. Предпочтительно, такие последовательности пептида в их естественном окружении расположены рядом с белковой поверхностью и доступны для иммунной системы, так что можно предположить существование естественной толерантности в отношении этой последовательности. Примеры приведены в таблице 2.

Таблица 2
Последовательность	Белок	Номер доступа	Положение линкера
EPQ GGGGSGGGGSG Е	Фотокадгерин-10	Q9P2E7	Около мембраны, внеклеточный
GGVGGGGGGAGI	Рецептор ANP	Р17342	Крайний N-конец, внеклеточный
PAR GGGGGG KAR	Frizzled-8	Q9H461	Междоменный, секретируется
GGPGGGGGGGPGG	Frizzled-8	Q9H461	С-конец, секретируется
TSR GGGGSGGG ЕРР	LRRFN2	Q9ULH4	Междоменный, внеклеточный

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидный линкер между частью, относящейся к фактору VII/VIIa, и