Способ прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия

Способ прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия

Реферат

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия.

Известен способ прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg и 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфных вариантов гена GSTM1 (см. Лазарашвили Н.А., Роль системы «оксиданты-антиоксиданты» и генетического биохимического полиморфизма в патогенезе профессиональных аллергических дерматозов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, Москва, 2006 г., с.48-86).

Однако известный способ прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов имеет малую информативность и, как следствие малой информативности способа, им можно прогнозировать только то, что при наличии делеции в гене GSTM1 заболевание может развиться в первые 5 лет от начала работы с вредными производственными факторами. Этот способ имеет низкую точность прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.

Задачей настоящего изобретения является усовершенствование способа прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов путем повышения его информативности, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия за счет повышения информативности.

Указанная задача достигается тем, что в известном способе прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc и 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g, oпpeдeлeниe нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфных вариантов гена GSTM1, дополнительно определяют полиморфный вариант гена GSTT1 при проведении полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg и 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg, причем при обнаружении одновременно делеций и GSTM1-del, и GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 прогнозируют ранние сроки развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия в течение первых 3-х лет от начала контакта с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия с тяжелым течением в виде распространенных форм профессиональных аллергических дерматозов и частыми рецидивами, при наличии одной из делеций GSTM1-del или GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 прогнозируют развитие профессиональных аллергических дерматозов в течение от 3-х до 5-и лет после начала контакта с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия, при отсутствии делеций и GSTM1-del, и GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 прогнозируют развитие профессиональных аллергических дерматозов не менее чем через 5 лет работы в контакте с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия.

Проведенные исследования по патентным и научно-техническим информационным источникам показали, что предлагаемый способ неизвестен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям “новизна” и “изобретательский уровень”.

Предлагаемый способ может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных широко используемым оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.

Следовательно, заявленный способ является доступным и практически применимым.

Таким образом, предложена совокупность приемов, позволяющих обеспечить повышение информативности получаемых результатов, что, в свою очередь, позволит повысить точность прогнозирования сроков развития течения профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени.

Предлагаемый способ основан на исследовании комплекса диагностических тестов, при этом наличие или отсутствие делеций GSTM1-del и GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 играет основную роль при прогнозировании сроков развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия.

В таблице 1 представлена последовательность использованных праймеров при выделении генетического материала в процессе полимеразной цепной реакции.

Предлагаемый способ пояснен на чертеже.

На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов амплификации GST-τ1 и GST-µ1 в 3% агарозном геле, где М - маркер, 1 - GST-µ1 0/0, GST-τ1 +/+, 2 - GST-µ1 +/+, GST-τ1 +/+, 3 - GST-µ1 +/+, GST-τ1 +/+, 4 - GST-µ1 +/+, GST-τ1 +/+, 5 - GST-µ1 +/+, GST-τ1 0/0, 6 - GST-µ1 0/0, GST-τ1 0/0.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

У пациентов осуществляют забор венозной крови. Кровь исследуют в соответствии с предлагаемым способом. Из 100 мкл цельной крови выделяют ДНК-сорбент однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) готовят серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавляют 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc и 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g, 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg и 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg.

Объем полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом используют реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР».

Реакцию амплификации проводят по следующей программе.

При использовании амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-Технология), когда температура достигнет 95°С (режим паузы), ставят пробирки в ячейки амплификатора и выдерживают их при температуре 95°С - 5 мин. Далее выдерживают пробирки 45 циклов: при 95°С - 10 с, при 65°С - 10 с, при 72°С - 10 с, а в конце при 72°С - 2 мин.

При использовании амплификаторов «Gradient Palm Cycler» («MAXYGEN»), «GeneAmp PCR System 2700», «PalmCycler», когда температура достигнет 95°С (режим паузы), пробирки ставят в ячейки амплификатора и продолжают программу при температуре 95°С - 5 мин. Далее пробирки выдерживают 45 циклов: при 95°С - 15 с, при 65°С - 15 с, при 72°С - 20 с, а в конце при 95°С - 2 мин.

После проведения амплификации осуществляют анализ продуктов реакции в 3% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете (фиг.1). Гомозиготы или гетерозиготы по нормальному аллелю «+» определяют по наличию на электрофореграммах продукта амплификации размером 271 н.п. для GST-µ1 и фрагмента 315 н.п. для GST-τ1. Отсутствие соответствующего фрагмента указывает на гомозиготность индивидуума по делеции гена.

При обнаружении одновременно делеции и GSTM1-del, и GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 прогнозируют ранние сроки развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия в течение первых 3-х лет от начала контакта с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия с тяжелым течением в виде распространенных форм профессиональных аллергических дерматозов и частых рецидивов. При наличии одной из делеции GSTM1-del или GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 прогнозируют развитие профессиональных аллергических дерматозов в течение от 3-х до 5-и лет после начала контакта с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия. При отсутствии делеции и GSTM1-del, и GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 прогнозируют развитие профессиональных аллергических дерматозов не менее чем через 5 лет работы в контакте с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия.

Пример 1. Больная Ф., 77 лет.

При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациентки было выявлено, что больная Ф. работала прессовщиком на Московской фабрике по производству детских игрушек, подвергаясь воздействию полистирола. Через год после начала работы по результатам обследования был поставлен диагноз профессиональная экзема.

По данным биохимических исследований: значительное повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, кетодиенов и карбонилов) в сыворотке крови и угнетение антиоксидантной защиты - значительное снижение тиолдисульфидного соотношения.

Согласно предлагаемому способу кровь исследовали следующим образом.

Из 100 мкл цельной крови выделили суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серию разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавили 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc и 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g, 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg и 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg.

Объем полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом использовали реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР».

Реакцию амплификации проводили с использованием амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-технология). При его нагреве до температуры 95°С (режим паузы) пробирки поставили в ячейки амплификатора и выдержали их при температуре 95°С - 5 мин. Далее выдерживали пробирки 45 циклов: при 95°С - 10 с, при 65°С - 10 с, при 72°С - 10 с, а в конце при 72°С - 2 мин.

После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете.

При анализе результатов была выявлены делеции GSTM1-del и GSTT1-del соответственно по генам GSTM1 и GSTT1.

Вывод: у больной Ф. выявлены делеции GSTM1-del и GSTT1-del соответственно по генам GSTM1 и GSTT1, т.е. ферменты глутатион-S-трансфераза M1 и Т1 не синтезируются, следовательно, не осуществляются процессы антиоксидантной защиты. Следствием этого явилось развитие профессиональной экземы с частыми рецидивами в первый же год работы с вредными производственными факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия.

Пример 2. Больная Б., 60 лет.

При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено, что больная Б. работала парикмахером в парикмахерской, подвергаясь воздействию химического состава «Локон». Через 4 года после начала работы по результатам обследования был поставлен диагноз профессиональная экзема конечностей.

По данным биохимических исследований: повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, кетодиенов и карбонилов) в сыворотке крови и угнетение антиоксидантной защиты - снижение тиолдисульфидного соотношения.

Согласно предлагаемому способу кровь исследовали следующим образом.

Из 100 мкл цельной крови выделили суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серию разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавили 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc и 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g, 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg и 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg.

Объем полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом использовали реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР».

Реакцию амплификации проводили с использованием амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-технология). При его нагреве до температуры 95°С (режим паузы) пробирки поставили в ячейки амплификатора и выдержали их при температуре 95°С - 5 мин. Далее пробирки выдерживали 45 циклов: при 95°С - 10 с, при 65°С - 10 с, при 72°С - 10 с, а в конце при 72°С - 2 мин.

После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете.

При анализе результатов была выявлена делеция GSTM1-del по гену GSTM1 и отсутствие делеции по гену GSTT1.

Вывод: у больной Б. выявлена делеция GSTT1-del по гену GSTT1 и отсутствие делеции по гену GSTM1, т.е. фермент глутатион-S-трансфераза M1 не синтезируется, а фермент глутатион-S-трансфераза Т1 синтезируется. Следовательно, процессы антиоксидантной защиты осуществляются не в полной мере. Следствием этого явилось развитие профессиональной экземы конечностей через 4 года работы с вредным производственным фактором раздражающего и сенсибилизирующего действия.

Пример 3. Больная Р., 51 год

При анализе анамнеза и профессионального маршрута пациента было выявлено, что больная Р. работала сборщиком микросхем на заводе «Компонент» в течение 34 лет, в контакте с эпоксидной смолой, припоем ПОС 61 (оловянно-свинцовым), в состав которого входит никель. Через 34 года после начала работы по результатам обследования в Научно-исследовательском институте медицины труда РАМП был поставлен диагноз профессиональная экзема верхних конечностей.

По данным биохимических исследований: незначительное повышение содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов, кетодиенов и карбонилов) в сыворотке крови и незначительное угнетение антиоксидантной защиты - снижение тиолдисульфидного соотношения.

Согласно предлагаемому способу кровь исследовали следующим образом.

Из 100 мкл цельной крови выделили суммарную ДНК однопробирочным методом с использованием комплекта для выделения "ДНК-сорб-В" (ТУ9398-071-01897593-2008), в соответствии с инструкцией к используемому комплекту.

Из полученного препарата ДНК (объемом 50 мкл) приготовили серии разведений в ТЕ-буфере до конечной концентрации 1-3 нг/мкл, добавили 10 мг конечного раствора ДНК в пробирку для осуществления полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc и 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g, 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg и 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg.

Объем полимерной цепной реакции - 25 мкл, при этом использовали реагенты производства ЦНИИ Эпидемиологии: «ПЦР-смесь-2-blue», смесь десоксинуклеотидтрифосфатов «dNTPs (Т)», «Воск для ПЦР», «Минеральное масло для ПЦР».

Реакцию амплификации проводили с использованием амплификатора «Терцик» (фирма ДНК-технология). При его нагреве до температуры 95°С (режим паузы) пробирки поставили в ячейки амплификатора и выдержали их при температуре 95°С - 5 мин. Далее выдерживали пробирки 45 циклов: при 95°С - 10 с, при 65°С - 10 с, при 72°С - 10 с, а в конце при 72°С - 2 мин.

После проведения амплификации осуществили анализ продуктов реакции в 3% полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ-свете.

При анализе результатов было выявлено отсутствие делеций по генам GSTM1 и GSTT1.

Вывод: у больной Р. выявлено отсутствие делеций по генам GSTM1 и GSTT1, т.е. ферменты глутатион-S-трансфераза M1 и Т1 синтезируются в полной мере, следовательно, процессы антиоксидантной защиты осуществляются удовлетворительно. Однако они несколько снижены под воздействием производственных факторов. Следствием этого являлось развитие профессиональной экземы верхних конечностей спустя 34 года после начала работы с вредным производственным фактором раздражающего и сенсибилизирующего действия.

Предлагаемый способ прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов позволяет повысить точность прогнозирования сроков развития течения профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия на 50% за счет повышения информативности проводимых исследований, например, при проведении диспансеризации или периодических медицинских осмотров большого количества работающих во вредных и/или опасных условиях труда за короткие (сжатые) сроки времени, а также повысить достоверность прогнозирования сроков развития течения профессиональных аллергических дерматозов при воздействии на организм факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия,

Он может быть применен в клинических, биохимических, молекулярно-генетических лабораториях, укомплектованных оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.

Таблица
Вариант гена	Используемый праймер
GSTM1	5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc
5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g
GSTT1	5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg
5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg

Способ прогнозирования сроков развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия, включающий забор венозной крови, выделение генетического материала, проведение полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc и 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g, определение нуклеотидной последовательности и на основании этого определение полиморфных вариантов гена GSTM1, отличающийся тем, что дополнительно определяют полиморфный вариант гена GSTT1 при проведении полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg и 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg, причем при обнаружении одновременно делеций и GSTM1-del, и GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 прогнозируют ранние сроки развития профессиональных аллергических дерматозов при воздействии факторов раздражающего и сенсибилизирующего действия в течение первых 3 лет от начала контакта с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия с тяжелым течением в виде распространенных форм профессиональных аллергических дерматозов и частыми рецидивами, при наличии одной из делеций GSTM1-del или GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 прогнозируют развитие профессиональных аллергических дерматозов в течение от 3 до 5 лет после начала контакта с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия, при отсутствии делеций и GSTM1-del и GSTT1-del соответственно в генах GSTM1 и GSTT1 прогнозируют развитие профессиональных аллергических дерматозов не менее чем через 5 лет работы в контакте с факторами раздражающего и сенсибилизирующего действия.