Способы лечения воспалительной боли

Способы лечения воспалительной боли

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к антителу к CGRP для применения при профилактике и/или лечении воспалительной боли и/или симптомов воспалительной боли, а также к способу лечения и/или профилактики воспалительной боли и/или симптомов воспалительной боли с применением антитела к CGRP.

Уровень техники

Воспалительный процесс представляет собой сложную последовательность биохимических и клеточных событий, активируемых в ответ на повреждение ткани или наличие посторонних веществ, которая приводит к опуханию и боли (Levine and Taiwo, 1994, Textbook of Pain, 45-56). Боль при артритах является наиболее распространенной воспалительной болью. Ревматоидная болезнь является одним из самых распространенных хронических воспалительных заболеваний в развитых странах, а ревматоидный артрит - частая причина инвалидности. Точная этиология ревматоидного артрита неизвестна, однако современные гипотезы предполагают, что важную роль могут играть как генетические, так и микробиологические факторы (Grennan & Jayson, 1994, Textbook of Pain, 397-407). Считалось, что почти 16 миллионов американцев имеют симптоматический остеоартрит (ОА) или дегенеративную болезнь суставов, при этом большинство из них старше 60 лет, и, как ожидают, общая заболеваемость вырастет до 40 миллионов по мере увеличения возраста популяции, что делает это колоссальной проблемой здравоохранения (Houge & Mersfelder, 2002, Ann Pharmacother., 36, 679-686; McCarthy et al., 1994, Textbook of Pain, 387-395). Большинство пациентов с остеоартритом обращаются за медицинской помощью из-за ассоциированной боли. Артрит оказывает значительное влияние на психосоциальную и физическую функцию и, как известно, является ведущей причиной инвалидности в преклонном возрасте. Анкилозирующий спондилит также является ревматическим заболеванием, которое вызывает артрит позвоночника и крестцово-подвздошных сочленений. Он варьирует от периодических приступов боли в пояснице, которые происходят в течение жизни, до тяжелой хронической болезни, которая поражает позвоночник, периферические суставы и другие органы тела.

Другим типом воспалительной боли является висцеральная боль, которая включает боль, ассоциированную с воспалительной болезнью кишечника (ВБК). Висцеральная боль является болью, связанной с внутренними органами, которые включают органы брюшной полости. Указанные органы включают половые органы, селезенку и часть пищеварительной системы. Боль, связанная с внутренними органами, может быть подразделена на висцеральную боль органов пищеварения и висцеральную боль непищеварительных органов. Часто встречающиеся желудочно-кишечные (ЖК) заболевания, которые вызывают боль, включают функциональное расстройство кишечника (ФРК) и воспалительную болезнь кишечника (ВБК). Данные ЖК заболевания охватывают широкий спектр патологических состояний, которые в настоящее время поддаются лечению лишь в незначительной степени, и включают, в отношении ФРК, гастроэзофагеальный рефлюкс, диспепсию, синдром раздраженного кишечника (СРК) и синдром функциональной абдоминальной боли (СФАБ), а также, в отношении ВБК, болезнь Крона, илеит и неспецифический язвенный колит, все из которых систематически вызывают висцеральную боль. Другие типы висцеральной боли включают боль, связанную с дисменореей, циститом и панкреатитом, а также тазовую боль.

Существует особо важная медицинская потребность в выявлении новых фармацевтически активных соединений, которые нарушают ключевые стадии процесса воспалительной боли и в особенности предназначены для лечения и/или профилактики боли при артрите и/или симптомов боли при артрите.

Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение антитела к CGRP эффективно при профилактике и/или лечении воспалительной боли, боли при артрите и, в частности, боли при остеоартрите.

CGRP (пептид, связанный с геном кальцитонина) представляет собой нейропептид из 37 аминокислот, который действует как нейромедиатор в центральной нервной системе. Он связывается с высокой аффинностью с рецептором CGRP, с подобным рецептору кальцитонина рецептором (CRLR), активируя аденилатциклазу и продукцию протеинкиназы А.

Было показано, что при спинальном введении приникающие центрально низкомолекулярные селективные CGRP-антагонисты оказались эффективными при лечении нейропатических и ноцицептивных болей (Adwanikar et al., Pain 2007), что позволяет предположить, что удаление эндогенного CGRP в спинном мозге оказывает антиноцицептивное действие. Кроме того, показали, что интратекальное введение иммунной сыворотки против CGRP восстанавливало ноцицептивное поведение в моделях артрита на грызунах (Kuraishi, Y., et al. Neurosci. lett (1998) 92, 325-329).

Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение антитела к CGRP оказалось эффективно, в случае периферического сайта действия, при профилактике и/или лечении воспалительной боли и, в частности, боли при остеоартрите, при периферическом введении. Указанный периферический путь введения обеспечивает очевидное преимущество по сравнению с требованием введения антител интратекально или спинально, что представляется более рискованным и неудобным методом.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении предложено применение антитела к антагонисту CGRP для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения воспалительной боли и/или симптомов воспалительной боли, где полученное лекарственное средство предназначено для периферического введения.

В настоящем изобретении также предложен способ профилактики и/или лечения воспалительной боли и/или симптомов воспалительной боли у индивида, включающий периферическое введение указанному индивиду терапевтически эффективного количества антитела к антагонисту CGRP.

В одном из вариантов осуществления антитело к антагонисту CGRP при введении действует периферически.

Описание фигур

Фиг.1: модель боли при остеоартрите. Антитело G2 вводили в дозе 1 и 10 мг/кг, внутривенно (1 мл/кг, в/в), а "неактивное" антитело (не связывается с CGRP) вводили в дозе 10 мг/кг в/в, в качестве отрицательного контроля. Оба антитела растворяли в растворе носителя, содержащем PBS + 0,01% Tween 20. В данном исследовании целекоксиб использовали в качестве положительного контроля. Его суспендировали в растворе 0,5% метилцеллюлозы и 0,025% Tween 20 и вводили перорально с пищей (1 мл/кг) в дозе 30 мг/кг, два раза в день, в течение всей продолжительности исследования. Болевые ответы оценивали в день 2, 3, 7 и 10 после начала фармакологического исследования (день 0) и оценивали согласно полностью слепому методу. Приведенные данные представляют собой среднее ± SEM для группы из 6 крыс. *p<0,05 и p<0,01 в сравнении с базовым значением (тест Даннетта в GraphPad Prism). На фигуре, слева направо, столбик 1 = базовая линия, столбики 2-5 = неактивное антитело, столбики 6-9 = G2 при дозе 1 мг/мл, столбики 10-13 = G2 при дозе 10 мг/мл, столбики 14-17 = целекоксиб 30 мг/мл.

Фиг.2: данные анализа связывания демонстрируют, что антитело G1 ингибирует связывание α-CGRP с CGRP1 рецептором.

Фиг.3a: уровень концентрации антитела к CGRP (мкг/мл) в сыворотке в зависимости от времени после в/в введения 10 мг/кг, измеренный с помощью анти-IgG ELISA.

Фиг.3b: уровень концентрации антитела к CGRP (мкг/мл) в сыворотке в зависимости от времени после в/в введения 10, 30, 100 мг/кг, измеренный с помощью анти-IgG ELISA.

Фиг.4: аланиновое сканирование с использованием C-концевого фрагмента CGRP (CGRP 25-37). Изменение аффинности выражено в кратности потери аффинности и показывает, что антитело G1 к CGRP связывается с C-концевой областью α-CGRP человека.

Фиг.5: конкуренция в растворе с использованием Biacore: для определения специфичности G1 использовали CGRP, фрагменты CGRP или пептиды, сходные по последовательности с CGRP.

Фиг.6: последовательности CGRP человека, яванского макака, крысы, мыши, собаки и кролика. Неконсервативные между видами остатки подчеркнуты, эпитоп G1 выделен жирным шрифтом.

Фиг.7: данные показывают, что G1 ингибирует нейрогенную гиперемию на коже, начиная с 90 минут после обработки. G1 вводили внутривенно (1 мл/кг). Данные получены от 6-8 или 13 крыс в группе. *p=0,05, **p=0,01 в сравнении с группой, получавшей носитель (фосфатно-соляной буфер), в каждый момент времени (AVOVA).

Таблица 1: Kd и IC50 антител к CGRP измеряли при 25°C против человеческого α-CGRP [muMab7E9 = мышиный предшественник G1. Его K_D для крысиного β-CGRP = 1 нМ. RN4901 = мышиное антитело, узнающее тот же эпитоп, что и G1, но демонстрирующее ту же аффинность и селективность в крысах (β-CGRP K_D = 17 нм); G1 = гуманизированное антитело на основе muMab7E9 (K_D в отношении крысиного βCGRP = 0,1 нМ)].

Таблица 2: аффинности связывания G1, определенные с помощью Biacore

Описание изобретения

Общие методики

При осуществлении настоящего изобретения на практике, если не указано иное, используют стандартные методики молекулярной биологии (включая генноинженерные методики), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах знаний специалиста в данной области техники. Такие методики полностью описаны в литературе, такой как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. CeIMs, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (MuIMs et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (VT. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott Company, 1993).

Определения

"Антитело" представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., по меньшей мере, через один сайт узнавания антигена, расположенный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в настоящей заявке данный термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также и их фрагменты (такие, как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, dAb), одноцепочечные антитела (ScFv), их мутанты, химерные антитела, диатела, слитые белки, включающие часть антитела, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, включающую сайт узнавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такое как IgG, IgA или IgM (или их подкласс), при этом антитело необязательно должно принадлежать к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей иммуноглобулины можно отнести к различным классам. Существуют пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, причем некоторые из них дополнительно могут быть разделены на подклассы (изотипы), например IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Структуры и трехмерные конфигурации субъединиц различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

"Fv" представляет собой фрагмент антитела, который содержит полноразмерный антиген-узнающий и связывающий сайт. В двухцепочечных типах Fv данная область состоит из димера вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, связанных прочной, нековалентной связью. В одноцепочечных типах Fv один вариабельный домен тяжелой и один вариабельный домен легкой цепи могут быть соединены ковалентной связью через гибкий пептидный линкер, в результате чего легкая и тяжелая цепи могут связываться с образованием димерной структуры, аналогичной димеру двухцепочечного Fv. Именно в такой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающую специфичность на поверхности VH-VL димера. Впрочем, даже один вариабельный домен (или половина Fv, включающая только 3 CDR, специфичных в отношении антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем весь связывающий сайт.

Fab-фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов дополнением нескольких остатков на C-конце домена CH1 тяжелой цепи, включающем один или более остатков цистеина из шарнирных областей антитела. F(ab)2-фрагмент является бивалентным фрагментом, включающим два Fab-фрагмента, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области.

Антитело может иметь один или более связывающих сайтов (для соединения с антигеном). Если в антителе присутствует более одного связывающего сайта, связывающие сайты могут быть идентичными друг другу или могут быть различными. Например, природный иммуноглобулин содержит два идентичных связывающих сайта, одноцепочечное антитело или Fab-фрагмент имеют один связывающий сайт, тода как "биспецифичное" или "бифункциональное" антитело (диатело) имеет два различных связывающих сайта, относительно последовательности и/или распознавания антигена/эпитопа.

"Выделенное антитело" является антителом, которое: (1) не связано с компонентами природного окружения, включая другие антитела природного окружения, которые сопровождают антитело в его нативном состоянии, (2) не содержит других белков из тех же видов, (3) экспрессировано клеткой, которая принадлежит к другому виду, или (4) не встречается в природе.

"Моноклональное антитело" относится к гомогенной популяции антител, где моноклональное антитело состоит из аминокислот (природных и неприродных), которые включены в селективное связывание антигена. Популяция моноклональных антител является высокоспецифичной, будучи направленной против одного антигенного сайта. Термин "моноклональное антитело" охватывает не только интактные моноклональные антитела и полноразмерные моноклональные антитела, но также и его фрагменты (такие, как Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные фрагменты (ScFv), его мутанты, слитые белки, включающие часть антитела, а также любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт узнавания антигена необходимой специфичности и обладает способностью связываться с антигеном. Данный термин не должен быть ограничен в том, что касается источника антитела или способа, которым оно было получено (например, с применением гибридомы, фаговой селекции, рекомбинантной экспрессии, трансгенных животных и т.д.).

Используемые в настоящей заявке "гуманизированные" антитела относятся к формам антител, которые не являются человеческими (например, мышиным) и представляют собой специфические химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие, как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, который не является человеческим. Большей частью гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменены остатками CDR из видов, не относящихся к человеку (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, обладающие необходимой специфичностью, аффинностью и биологической активностью. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими. Кроме того, гуманизированное антитело может включать остатки, которые не присутствуют ни в реципиентном антителе, ни в последовательностях донорной CDR или каркасной области, а включены для дополнительного улучшения и оптимизации эффективности антитела. Как правило, гуманизированное антитело включает по существу все, по меньшей мере, из одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все CDR области соответствуют областям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, а все или по существу все FR области представляют собой области консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело оптимально также включает, по меньшей мере, фрагмент константной области или домен (Fc) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. Антитела могут содержать Fc-области, которые модифицированы, как описано в WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител содержат одну или более одной CDR (одну, две, три, четыре, пять, шесть), которые изменены по сравнению с исходным антителом, которые также именуются как одна или более одной CDR, "происходящие из" одной или более одной CDR исходного антитела.

Используемое в настоящей заявке "человеческое антитело" означает антитело, аминокислотная последовательность которого соответствует аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или получена с использованием любой из методик получения человеческих антител, известных в данной области техники или раскрытых в настоящей заявке. Данное определение человеческого антитела включает антитела, содержащие, по меньшей мере, один полипептид тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина или, по меньшей мере, один полипептид легкой цепи человеческого иммуноглобулина. Одним из таких примеров является антитело, включающее полипептиды легкой цепи мышиного антитела и полипептиды тяжелой цепи человеческого антитела. Человеческие антитела могут быть получены с применением различных способов, известных в данной области техники. В одном из вариантов осуществления человеческое антитело выбрано из фаговой библиотеки, экспрессирующей человеческие антитела (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Человеческие антитела также могут быть получены путем введения локуса человеческого иммуноглобулина в трансгенное животное, например мышь, у которой гены эндогенных иммуноглобулинов были частично или полностью инактивированы. Подобный подход описан в патентах США 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 и 5,661,016. В альтернативе человеческое антитело может быть получено путем иммортализации человеческих В-лимфоцитов, которые продуцируют антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты могут быть выделены у индивидуума или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, стр. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; а также патент США 5,750,373.

Одноцепочечное антитело (scFc) представляет собой антитело, в котором VL и VH области спарены с образованием моновалентной молекулы через синтетический линкер, который позволяет получить их в виде одной белковой цепи (Bird et al. Science, 242: 423-426 (1988) и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)).

Диатела представляют собой бивалентные, биспецифические антитела, в которых VH и VL домены экспрессированы на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который слишком короток и поэтому не допускает спаривания между двумя указанными доменами на одной цепи, в результате чего домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи, образуя два антигенсвязывающих сайта.

"Химерные антитела" относятся к антителам, в которых одна часть каждой из аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепи гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу, тогда как другой сегмент цепей гомологичен соответствующим последовательностям другого вида или класса. Как правило, в химерных антителах вариабельная область и легкой, и тяжелой цепей имитирует вариабельные области антител, полученных из млекопитающего одного вида, тогда как константные фрагменты гомологичны последовательностям в антителах, полученных из другого вида. Одно очевидное преимущество таких химерных форм состоит в том, что, например, вариабельные области могут быть получены удобным способом из известных на данный момент источников, с использованием общедоступных гибридом или В-лимфоцитов из организмов-хозяев за исключением человека, в комбинации с константными областями, полученными, например, из препаратов клеток человека. Хотя вариабельная область обладает преимуществом легкости получения и на ее специфичность не влияет ее источник, константная область, являющаяся человеческой, с меньшей вероятностью будет вызывать иммунный ответ у субъекта-человека при введении антител, по сравнению с константной областью из источника, не относящегося к человеку. Впрочем, определение не ограничивается данным конкретным примером.

"Функциональная Fc-область" обладает, по меньшей мере, одной эффекторной функцией Fc-области нативной последовательности. Примеры "эффекторных функций" включают связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; негативную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток; BCR) и т.д. Такие эффекторные функции, как правило, требуют, чтобы Fc-область была объединена со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и могут быть оценены с помощью различных анализов, известных в данной области техники для оценки таких эффекторных функций антитела.

"Fc-область нативной последовательности" включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc- природной области. "Вариант Fc-области" включает аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-области модификацией, по меньшей мере, одной аминокислоты, но в то же время сохраняет, по меньшей мере, одну эффекторную функцию Fc-области нативной последовательности. Предпочтительно, вариант Fc-области содержит замену, по меньшей мере, одной аминокислоты по сравнению с Fc-областью нативной последовательности или с Fc-областью исходного полипептида, например, приблизительно от одной до десяти аминокислотных замен и предпочтительно приблизительно от одной до пяти аминокислотных замен в Fc-области нативной последовательности или в Fc-области исходного полипептида. Вариант Fc-области в настоящей заявке предпочтительно обладает, по меньшей мере, приблизительно 80% идентичностью последовательности с Fc-областью нативной последовательности и/или с Fc-областью исходного полипептида и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 90% идентичностью последовательности, более предпочтительно, по меньшей мере, приблизительно 95%, по меньшей мере, приблизительно 96%, по меньшей мере, приблизительно 97%, по меньшей мере, приблизительно 98%, по меньшей мере, приблизительно 99% идентичностью последовательности с Fc-областью нативной последовательности и/или с Fc-областью исходного полипептида.

Используемая в настоящей заявке "антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность" и "ADCC" относится к клеточноопосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например, натуральные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени, а затем вызывают лизис этой клетки-мишени. Активность ADCC интересующей молекулы может быть оценена с помощью анализа ADCC in vitro, такого как описанного в патентах США 5,500,362 или 5,821,337. Эффекторные клетки, применяемые в таких анализах, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и NK-клетки. Альтернативно или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы может быть оценена in vivo, например, в животной модели, такой как описанная в Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

Используемый в настоящей заявке "Fc-рецептор" и "FcR" описывает рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительный FcR представляет собой нативную последовательность человеческого FcR. Кроме того, предпочтительный FcR представляет собой рецептор, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор), и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и формы, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга указанных рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), имеющие сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются в основном своими цитоплазматическими доменами. Обзор FcR приведен в Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; и de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" также включает неонатальный рецептор FcRn, который ответственен за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; и Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

"Комплементзависимая цитотоксичность" и "CDC" относятся к лизису мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), находящейся в комплексе с когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ CDC, например, как описано Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Используемые в настоящей заявке термины "G1" и "антитело G1" используют попеременно и относятся к антителу, продуцируемому экспрессирующими векторами, имеющими номера АТСС-РТА-6867 и АТСС-РТА-6866. Аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи приведена в SEQ ID NO:1 и 2. Фрагменты CDR антитела G1 (включая CDR Чотиа и Кэбата) схематически показаны на Фиг.5 WO2007/054809, содержание которой настоящим полностью включено путем отсылки. Полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепи, приведены в SEQ ID NO:9 и 10. Свойства антитела G1 описаны в Примерах WO2007/054809, полное содержание которых настоящим полностью включено путем отсылки. G1 представляет собой гуманизированное моноклональное блокирующее антитело (IgG2), которое блокирует связывание и активность нейропептида CGRP (a и b), а также его эффект нейрогенной вазодилатации, вызванной секрецией CGRP. G1 представляет собой моноклональное IgG2Δa антитело к антагонисту CGRP, полученного из мышиного предшественника антитела к антагонисту CGRP, обозначенного muMAb7E9, как идентифицировано в скрининге с использованием клеток селезенки, полученных из мыши, иммунизированной человеческим и крысиным CGRP, которые были слиты с клетками плазмоцитомы мыши. G1 был создан путем переноса CDR легкой и тяжелой цепи, полученных из muMAb7E9, в самую близкую последовательность человеческой зародышевой линии, с последующим введением, по меньшей мере, 1 мутации в каждую CDR и 2 каркасных мутаций в V_H. Две мутации были введены в Fc-домен G1 в целях супрессии активации человеческого Fc-рецептора. Было показано, что G1 и muMab7E9 распознают один и тот же эпитоп.

Используемые в настоящей заявке термины "G2" и "антитело G2" используются попеременно и относятся к мышиному моноклональному антителу CGRP крысы, как описано в статье Wong HC et al. Hybridoma 12:93-106 (1993). Аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи приведена в SEQ ID NO:19 и 20. Полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей, приведены в SEQ ID NO:27 и 28. Фрагменты CDR антитела G2 приведены в SEQ ID NO:21-26. Было показано, что G2 распознает тот же эпитоп, что и G1.

Используемое в настоящей заявке "иммуноспецифическое" связывание антител относится к антигенспецифическому связывающему взаимодействию, которое встречается между антигенсвязывающим сайтом антитела и специфическим антигеном, распознаваемым данным антителом (то есть антитело взаимодействует с конкретным белком в ELISA или другом иммуноанализе и не взаимодействует на детектируемом уровне с другими белками).

Эпитоп, который "специфично связывается" или "предпочтительно связывается" (используемый попеременно в настоящем описании) с антителом или полипептидом, является термином, хорошо известным в уровне техники, при этом способы определения такого специфичного или селективного связывания также известны в уровне техники. Считается, что молекула проявляет "специфичное связывание" или "предпочтительное связывание", если она взаимодействует или связывается, с более высокой частотой, более высокой скоростью, с более высокой продолжительностью и/или с более высокой аффинностью, со специфической клеткой или веществом, чем с другими клетками или веществами. Антитело "специфично связывается" или "предпочтительно связывается" с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, с большей скоростью и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими веществами. Также при прочтении данного определения следует понимать, что, например, антитело (или фрагмент, или эпитоп), которое специфично или селективно связывается с одной мишенью, может специфично или селективно связываться с другой мишенью или же нет. Кроме того, "специфичное связывание" или "предпочтительное связывание" не обязательно требует (хотя и может включать) исключительное связывание. Как правило, но не обязательно, ссылка на связывание означает предпочтительное связывание.

Термины "полипептид", "олигопептид", "пептид" и "белок" попеременно используются в настоящей заявке для отсылки к полимерам аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, может включать модифицированные аминокислоты и может прерываться компонентами, которые не являются аминокислотами. Данные термины также охватывают аминокислотный полимер, модифицированный естественным путем или искусственно; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидизация, ацетилирование, фосфорилирование или любая другая манипуляция или модификация, такая как конъюгирование с метящим компонентом. Также в определение включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включающих, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в уровне техники. Следует понимать, что поскольку полипептиды настоящего изобретения основаны на антителе, данные полипептиды могут существовать в виде одиночных цепей или ассоциированных цепей.

"Полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", попеременно используемые в настоящем изобретении, относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут являться дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами или любым субстратом, который может быть включен в полимер ДНК- или РНК-полимеразой. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. В случае присутствия модификации нуклеотидной структуры она может быть произведена до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован после полимеризации, например, путем конъюгирования с метящим компонентом. Другие типы модификаций включают, например, "кэпы", замену одного или более природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфоамидаты, карбаматы и т.д.) и заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), модификации, содержащие боковые группировки, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модификации интеркаляторами (например, акридин, псорален и т.д.), модификации, содержащие хелатообразователи (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), содержащие алкилирующие соединения, с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.), а также модифицированные формы полинуклеотида(ов). Кроме того, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть замещена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована с получением дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами или может быть конъюгирована с твердыми носителями. 5'- и 3'-концевая ОН-группа может быть фосфорилирована или замещена аминами или органическими кэпирующими группами из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы также могут быть дериватизированы в стандартные защитные группы. Полинуклеотиды также могут содержать аналогичные формы рибозных или дезоксирибозных сахаров, общеизвестных в уровне техники, включая, например 2'-O-метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидорибозу, карбоциклические аналоги сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и неосновные нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одна или более фосфодиэфирных связей может быть замещена альтернативными связывающими группами. Указанные альтернативные связывающие группы включают, помимо прочих, варианты осуществления, в которых фосфат замещен на P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), "(O)NR₂ ("амидат"), P(O)R, P(O)OR', СО или СН₂ ("формацеталь"), в которых каждый R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С), необязательно содержащий эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралдил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предшествующее описание применимо ко всем упомянутым в настоящем описании полинуклеотидам, включая РНК и ДНК.

"Вариабельная область" антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, одной или в комбинации. Вариабельные области каждой из тяжелой и легкой цепей состоят из четырех каркасных областей (FR), связанных тремя областями, определяющими комплементарность (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вместе посредством FR и, вместе с CDR другой цепи, вносят вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител. Существуют, по меньшей мере, два метода определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовой вариабельности последовательности (т.е. Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); и (2) метод, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Используемая здесь CDR может относиться к CDR, определенной с помощью любого из методов или комбинации обоих методов.

"Константная область" антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, одной или в комбинации.

Используемое в настоящей заявке "антитело к антагонисту CGRP" (попеременно называемое "антитело к CGRP") относится к антителу, способному связываться с CGRP и ингибировать биологическую активность CGRP и/или последующий сигнальный путь (пути), опосредованный(ые) CGRP. Антитело к антагонисту CGRP охватывает антитела, которые блокируют, оказывают антагонистическое действие, подавляют или снижают (в том числе существенно) биологическую активность CGRP. В рамках настоящего изобретения следует четко понимать, что термин "антитело к антагонисту CGRP" охватывает все ранее идентифицированные термины, наименования, а также функциональные состояния и характеристики, посредством которых собственно CGRP, биологическая активность CGRP или проявления биологической активности по существу сводятся к нулю, уменьшаются или нейтрализуются в любой значимой степени. Примеры антител к антагонисту CGRP приведены в настоящей заявке.

Используемый в настоящей заявке "по существу чистый" относится к веществу, которое, по меньшей мере, на 50% является чистым (то есть не содержит примесей), более предпочтительно является чистым, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно является чистым, по меньшей мере, на 95%, более предпочтительно является чистым, по меньшей мере, на 98%, более предпочтительно является чистым, по меньшей мере, на 99%.

"Клетка-хозяин" включает отдельную клетку или культуру клеток, которая может являться или является реципиентом для вектора(ов), предназна