Новые синтетические агонисты tlr9

Новые синтетические агонисты tlr9

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Связанные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной патентной заявки США №60/953251, поданной 1 августа 2007 года, предварительной патентной заявки США №60/983601, поданной 30 октября 2007 года, предварительной патентной заявки США №60/987151, поданной 12 ноября 2007 года, и предварительной патентной заявки США №61/015292, поданной 20 декабря 2007 года, полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки.

Область изобретения

Изобретение относится к синтетическим химическим композициям, которые являются применимыми для модуляции иммунных ответов, опосредованных Toll-подобным рецептором (TLR). В частности, изобретение относится к агонистам Toll-подобного рецептора 9 (TLR9), которые дают уникальные профили цитокинов и хемокинов.

Сущность связанной области техники

Toll-подобные рецепторы (TLR) присутствуют во множестве клеток иммунной системы, и было показано, что они вовлечены во врожденный иммунный ответ (Hornung V. et al., (2002) J.Immunol. 168:4531-4537). У позвоночных такое семейство состоит из одиннадцати белков, называемых TLR1-TLR11, которые известны как распознающие молекулярные образы, ассоциированные с патогенами бактерий, грибов, паразитов и вирусов (Poltorak A. et al. (1998) Science 282:2085-2088; Underhill D.M. et al., (1999) Nature 401: 811-815; Hayashi F. et al., (2001) Nature 410: 1099-1103; Zhang D. et al., (2004) Science 303: 1522-1526; Meier A. et al., (2003) Cell. Microbiol. 5:561-570; Campos M.A. et al., (2001) J. Immunol. 167:416-423; Hoebe K. et al., (2003) Nature 424: 743-748; Lund J. (2003) J.Exp.Med. 198:513-520; Heil F. et al., (2004) Science 303: 1526-1529; Diebold S.S. et al., (2004) Science 303: 1529-1531; Hornung V. et al., (2004) J.Immunol. 173:5935-5943).

TLR являются ключевыми средствами, посредством которых позвоночные распознают и организуют иммунный ответ на инородные молекулы и также обеспечивают возможности, посредством которых связаны врожденные и адаптивные иммунные ответы (Akira S. et al., (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145). Некоторые TLR расположены на поверхности клеток для определения и развития ответа на внеклеточные патогены, и другие TLR расположены внутри клетки для определения и развития ответа на внутриклеточные патогены.

Известно, что TLR9 распознает неметилированные CpG участки в бактериальной ДНК и в синтетических олигонуклеотидах (Hemmi H. et al., (2000) Nature 408:740-745). Другие модификации фосфоротиоатных олигонуклеотидов, содержащие CpG, также могут влиять на их способность действовать как модуляторы иммунного ответа посредством TLR9 (см., например, Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al., (1996) Biochem. Pharmacol. 52:1537-1544; Zhao et al., (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:495-502; Zhao et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:3453-3458; Zhao et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 1051-1054; Yu D. et al. (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:2585-2588; Yu D. et al (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2263-2267; и Kandimalla E. et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813). Было показано, что естественные агонисты TLR9 обладают противоопухолевой активностью (например, рост и ангиогенез опухоли), приводя к эффективному противораковому ответу (например, антилейкемия) (Smith J.B. и Wickstrom E. (1998) J.Natl. Cancer Inst 90:1146-1154). Кроме того, было показано, что агонисты TLR9 работают синергически с другими противоопухолевыми соединениями (например, цетуксимаб, иринотекан) (Vincenzo D. et al. (2006) Clin.Cancer Res. 12(2):577-583).

Определенные агонисты TLR9 состоят из 3'-3' связанных ДНК структур, содержащих ядерный динуклеотид CpR, где R представляет собой модифицированный гуанозин (патент США № 7276489). Кроме того, специфические химические модификации позволили получить специфические аналоги олигонуклеотидов, которые создают особые модуляции иммунного ответа. В частности, исследования взаимосвязи структуры и активности позволили определить синтетические структуры и новые соединения на основе ДНК, которые создают специфические модуляции иммунного ответа, и такие модуляции отличаются от таковых, созданных неметилированными динуклеотидами CpG (Kandimalla E. et al., (2005) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 102:6925-6930; Kandimalla E. et al. (2003) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100: 14303-14308; Cong Y. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 310:1133-1139; Kandimalla E. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 306:948-953; Kandimalla E. et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2393-2400; Yu D. et al. (2003) Bioorg. Med.Chem. 11:459-464; Bhagat L. et al., (2003) Biochem.Biophys.Res. Commun. 300:853-861; Yu D. et al., (2002) Nucleic Acids Res.: 30:4460-4469; Yu D. et al. (2002) J.Med.Chem. 45:4540-4548, Yu D. et al., (2002) Biochem.Biophys.Res.Commun. 297:83-90; Kandimalla E. et al., (2002) Bioconjug. Chem.13:966-974; Yu D. et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:1613-1619; Yu D. et al. (2001) Bioorg.Med.Chem. 9: 2803-2808; Yu D. et al. (2001) Bioorg. Med.Chem.Lett. 11:2263-2267; Kandimalla E. et al. (2001) Bioorg.Med.Chem. 9:807-813; Yu D. et al. (2000) Bioorg.Med.Chem.Lett. 10:2585-2588; Putta M. et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34:3231-3238).

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что уникальная модификация последовательности, окружающей сердцевинный динуклеотид CpR, связь между нуклеотидами или линкеры, соединяющие олигонуклеотиды, дают новые агонисты TLR9, которые дают отличающиеся in vitro и in vivo профили цитокинов и хемокинов. Такая способность «модифицировать в соответствии с требованиями заказчика» цитокиновый и хемокиновый ответ на олигонуклеотид, содержащий CpR, дает способность предотвращать и/или лечить различные патологические состояния главным образом, специфическим для заболевания или даже специфическим для пациента. Следовательно, существует необходимость в новых соединениях - аналогах олигонуклеотидов для обеспечения таких «модифицированных в соответствии с требованиями заказчика» ответов.

КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение обеспечивает новые соединения на основе олигонуклеотидов, которые индивидуально обеспечивают определенные профили иммунного ответа посредством их взаимодействий как агонистов TLR9. Агонисты TLR9 по изобретению характеризуются специфическими и уникальными химическими модификациями, которые обеспечивают их определенные профили активации иммунного ответа.

Агонисты TLR9 по изобретению вызывают иммунные ответы в различных типах клеток и в различных экспериментальных моделях in vitro и in vivo, каждый агонист обеспечивает определенный профиль иммунного ответа. Агонисты TLR9 по изобретению также являются применимыми в профилактике и/или лечении различных заболеваний или отдельно, или в комбинации с, или совместно вводимыми с другими лекарственными средствами, или в виде адъювантов для антигенов, используемых в вакцинах. Как таковые они применимы в качестве средств для исследования иммунной системы, а также для сравнения иммунных систем различных видов животных, таких как люди и мыши.

Следовательно, в первом аспекте изобретение обеспечивает агонисты TLR9 на основе олигонуклеотидов («соединение»).

Во втором аспекте изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие агонист TLR9 на основе олигонуклеотидов по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

В третьем аспекте изобретение обеспечивает вакцину. Вакцины по настоящему аспекту включают фармацевтическую композицию по изобретению и дополнительно включают антиген.

В четвертом аспекте изобретение обеспечивает способы для создания TLR9-опосредованного иммунного ответа у пациента, указанные способы включают введение пациенту соединения, фармацевтической композиции или вакцины по изобретению.

В пятом аспекте изобретение обеспечивает способы для терапевтического лечения пациента, имеющего заболевание или расстройство, такие способы включают введение пациенту соединения фармацевтической композиции или вакцины по изобретению.

В шестом аспекте изобретение обеспечивает способы для профилактики заболевания или расстройства, такие способы включают введение пациенту соединения фармацевтической композиции или вакцины по изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой схему синтеза для линейного синтеза иммуномодулирующих соединений по изобретению. DMTr=4,4'-диметокситритил; СЕ=цианоэтил.

Фиг.2 представляет собой схему синтеза для параллельного синтеза иммуномодулирующих соединений по изобретению. DMTr=4,4'-диметокситритил; СЕ=цианоэтил.

На фиг.3А-3С изображена активность NF-κB в клетках HEK293, экспрессирующих TLR9, которые культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 2 ниже. Коротко, клетки HEK293 стимулировали 10 мкг/мл иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 18 часов и уровень NF-κB определяли с использованием SEAP (секретируемая форма человеческой эмбриональной щелочной фосфатазы) анализа.

На фиг.3D-3G изображена активность NF-κB в клетках HEK293, экспрессирующих TLR9, которые культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 2 ниже. Коротко, клетки HEK293 стимулировали 0 (PBS/среда), 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 или 10 мкг/мл иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 18 часов и уровень NF-κB определяли с использованием SEAP (секретируемая форма человеческой эмбриональной щелочной фосфатазы) анализа. На фиг.3D-3G более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили активации TLR9.

На фиг.4А и 4В изображены концентрации цитокинов и хемокинов из человеческих PBMC, которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, PBMC выделяли из свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.4А и 4В более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает определенные профили цитокинов и хемокинов.

На фиг.4С-4Н изображены концентрации цитокинов и хемокинов из человеческих PBMC, которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, PBMC выделяли из свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 0 (PBS/среда), 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 или 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.4С-4Н более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает определенные профили цитокинов и хемокинов.

На фиг.4I-4N изображены концентрации цитокинов и хемокинов из человеческих PBMC, которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, PBMC выделяли из свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 0 (PBS/среда), 1,0 или 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.4I-4N более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили цитокинов и хемокинов.

На фиг.4О-4FF изображены концентрации цитокинов и хемокинов из человеческих PBMC, которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, PBMC выделяли из свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 0 (PBS/среда), 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 или 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.4О-4FF более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили цитокинов и хемокинов.

На фиг.5А-5В изображены концентрации цитокинов и хемокинов человеческих плазматических дендритных клеток (pDc), которые выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали в соответствии с примером 3 ниже. Коротко, pDc выделяли из PBMC свежеполученной крови здоровых людей-добровольцев и культивировали с 10 мкг/мл дозой иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 24 часов. Надосадочные жидкости собирали и анализировали уровни цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex. На фиг.5А и 5В более полно продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили цитокинов и хемокинов.

На фиг.6А-6F изображена пролиферация человеческих В-клеток, индуцированная иммуномодулирующими олигонуклеотидами по изобретению. Человеческие В-клетки выделяли, культивировали, обрабатывали и анализировали по примеру 4 ниже. Коротко, человеческие В клетки выделяли из свежеполученных PBMC здоровых людей-добровольцев и культивировали с различными дозами иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению в течение 68 часов и возбуждали ³Н-тимидином в течение 6-8 часов. Поглощение ³Н-тимидинома определяли с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика. На фиг.6А-6F в общем продемонстрировано, что введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили пролиферации клеток, которые варьируются в зависимости от композиции основания, уникальной модификации и количества вводимого олигонуклеотида.

На фиг.7А изображена индукция цитокинов и хемокинов сыворотки у мышей C57BL/6, которых лечили в соответствии с примером 5 ниже. Коротко, через 2 часа после того, как мышам вводили подкожно 1 мг/кг дозу иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению, сыворотку получали и анализировали в отношении уровня цитокинов и хемокинов с помощью многоканального анализа Luminex.

На фиг.7В изображена индукция цитокинов сыворотки у мышей BALB/c, которых лечили в соответствии с примером 5 ниже. Коротко, через 2 часа после того, как мышам вводили подкожно 1 мг/кг дозу иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению, сыворотку получали и анализировали в отношении уровня IL-12 посредством ELISA.

На фиг.7С изображена индукция цитокинов сыворотки у мышей BALB/c, которых лечили в соответствии с примером 5 ниже. Коротко, через 2 часа после того, как мышам подкожно вводили 0,25 или 1 мг/кг дозу иммуномодулирующих олигонуклеотидов по изобретению, сыворотку получали и анализировали в отношении уровня IL-12 посредством ELISA. На фиг.7А-7F более полно продемонстрировано, что in vivo введение иммуномодулирующих олигонуклеотидов, содержащих новые основания, линкеры и/или уникальные модификации по изобретению, дает особые профили активации TLR9, что обнаруживает применение при множестве заболеваний.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение обеспечивает новые соединения на основе олигонуклеотидов, которые индивидуально обеспечивают особые профили иммунного ответа посредством их взаимодействий в качестве агонистов с TLR9. Агонисты TLR9 по изобретению характеризуются уникальными химическими модификациями, которые обеспечивают их особые профили активации иммунного ответа. Все публикации, указанные в настоящем описании, отражают уровень знаний в области техники и являются, таким образом, включенными в виде ссылки полностью. Любое противоречие между указаниями этих ссылок и настоящей спецификацией должно быть разрешено в пользу последней.

Агонисты TLR9 по изобретению вызывают иммунные ответы различных типов клеток и в различных экспериментальных моделях in vivo и in vitro, причем каждый агонист обеспечивает особый профиль иммунного ответа. По существу, они являются применимыми в качестве средств для изучения иммунной системы, а также для сравнения иммунных систем различных видов животных, таких как люди и мыши. Агонисты TLR9 по изобретению также являются применимыми в профилактике и лечении различных заболеваний или отдельно, или в комбинации с, или при совместном введении с другими лекарственными средствами, или в качестве добавок к антигенам, таким как вакцины.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин «2'-замещенный нуклеозид» или «2'-замещенный арабинозид» обычно включает нуклеозиды или арабинонуклеозиды, в которых гидроксильная группа в 2'-положении пентозного или арабинозного компонента замещена с образованием 2'-замещенного или 2'-О-замещенного рибонуклеозида. В определенных вариантах осуществления изобретения такое замещение осуществляют низшей углеводородной группой, содержащей 1-6 насыщенных или ненасыщенных атомов углерода, атомами галогена или арильной группой, имеющей 6-10 атомов углерода, где такая углеводородная или арильная группа может быть незамещенной или может быть замещенной, например, галогеном, гидрокси, трифтометил, циано, нитро, ацил, ацилокси, алкокси, карбоксил, карбоалкокси или аминогруппами. Примеры 2'-О-замещенных рибонуклеозидов или 2'-О замещенных арабинозидов включают, без ограничения, 2'-амино, 2'-фтор, 2'-аллил, 2'-О-алкил и 2'-пропаргил рибонуклеозиды или арабинозиды, 2'-О-метилрибонуклеозиды или 2'-О-метиларабинозиды и 2'-О-метоксиэтоксирибонуклеозиды или 2'-метоксиэтоксирабинозиды.

Термин «3'» при использовании направленно обычно относится к области или положению в полинуклеотиде или олигонуклеотиде 3' (относительно 3'-положения олигонкулеотида) из другого участка или положения в том же самом полинуклеотиде или олигонуклеотиде.

Термин «5'» при использовании направленно обычно относится к области или положению в полинуклеотиде или олигонуклеотиде 5' (относительно 5'-положения олигонуклеотида) из другого участка или положения в том же самом полинуклеотиде или олигонуклеотиде.

Термин «около» обычно обозначает, что точное число не является критичным. Следовательно, количество остатков нуклеозидов в олигонуклеотидах не является критичным, и олигонуклеотиды, имеющие на один или два меньше остатков нуклеозидов или от одного до нескольких дополнительных нуклеозидных остатков, предусматриваются как эквиваленты каждого из вариантов осуществления изобретения, описанных выше.

Термин «воспаление дыхательных путей» обычно включает, без ограничения, воспаление в респираторном тракте, вызванное аллергенами, включая астму.

Термин «аллерген» обычно относится к антигену или антигенной части молекулы, обычно белка, который вызывает аллергический ответ при воздействии на пациента. Обычно пациент имеет аллергию на аллерген, как указывается, например, посредством тестов с волдырями и покраснением или любых способов, известных в области техники. Говорят, что молекула является аллергеном, даже если только небольшая группа пациентов имеет аллергический иммунный ответ (например, IgE) при воздействии молекулы.

Термин «аллергия» обычно включает, без ограничения, пищевую аллергию, дыхательную аллергию и кожную аллергию.

Термин «антиген» обычно относится к веществу, которое распознается и селективно связывается антителом или рецептором антигена Т клеток. Антигены могут включать, но не ограничиваются, пептиды, белки, нуклеозиды, нуклеотиды и их комбинации. Антигены могут быть естественными или синтетическими и обычно вызывают иммунный ответ, который специфичен для такого антигена.

Термин «аутоиммунное расстройство» обычно относится к расстройствам, при которых «свой» антиген подвергается атаке иммунной системы. Такой термин включает, без ограничения, системную красную волчанку, рассеянный склероз, сахарный диабет I типа, синдром раздраженного кишечника, болезнь Крона, ревматоидный артрит, септический шок, универсальную алопецию, острый диссеминированный энцефаломиелит, болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилит, синдром антифосфолипидных антител, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, буллезный пемфигоид, болезнь Чагаса, хроническую обструктивную болезнь легких, заболевания брюшной полости, дерматомиозит, эндометриоз, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, болезнь Хашимото, гнойный гидраденит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, интерстициальный цистит, очаговую склеродермию, злокачественную миастению, нарколепсию, нейромиотонию, пузырчатку, пернициозную анемию, полимиозит, первичный билиарный цирроз, шизофрению, синдром Шегрена, височный артериит («гигантоклеточный артериит»), васкулит, витилиго, вульводинию и гранулематоз Вегенера, аутоиммунную астму, септический шок, псориаз и малярию.

Термин «рак» обычно относится к, без ограничения, любому злокачественному новообразованию или опухоли, вызванной нарушенной или неконтролируемой пролиферацией и/или делением клеток. Рак может развиваться у людей и/или животных и может возникнуть в любой и во всех тканях. Лечение пациента с раком с помощью изобретения может включать введение соединения, фармацевтической композиции или вакцины по изобретению с воздействием на нарушенную или неконтролируемую пролиферацию и/или деление клеток.

Термин «носитель» обычно охватывает любое вспомогательное вещество, разбавитель, наполнитель, соль, буфер, стабилизатор, масло, липид, пузырьки, содержащие липиды, микросферы, липосомальные инкапсуляции или другие материалы, хорошо известные в области техники для применения в фармацевтических композициях. Необходимо понимать, что характеристики носителя, вспомогательного вещества или разбавителя будут зависеть от пути введения для определенного применения. Получение фармацевтически приемлемых композиций, содержащих такие материалы, описано в, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.

Термин «фармацевтически приемлемый» или «физиологически приемлемый» обычно относится к материалу, который не влияет на эффективность соединения по изобретению и является совместимым с биологической системой, такой как клетка, культура клеток, ткань или организм. Предпочтительно биологической системой является живой организм, такой как позвоночное.

Термин «совместное введение» или «вводимый совместно» обычно относится к введению по меньшей мере двух различных веществ, достаточно близко по времени для модуляции иммунного ответа. Предпочтительно совместное введение относится к одновременному введению по меньшей мере двух различных веществ.

Термин «фармацевтически эффективное количество» обычно относится к количеству, достаточному для развития желаемого биологического эффекта, такого как полезный результат. Следовательно, «фармацевтически эффективное количество» будет зависеть от контекста, в котором его вводят. Фармацевтически эффективное количество можно вводить в одном или более профилактических или терапевтических введениях.

Термин «в комбинации с» обычно обозначает введение соединения по изобретению и другого средства, применимого для лечения заболевания или состояния, которое не прекращает эффект соединения антагонизма TLR9 в курсе лечения пациента. Такое введение может осуществляться в любом порядке, включая одновременное введение, а также в разделенном по времени порядке с перерывом от нескольких секунд до нескольких дней. Такое комбинированное лечение может также включать более чем однократное введение соединения по изобретению и/или независимо другого средства. Введение соединения по изобретению и другого средства может осуществляться одним и тем же или различными путями.

Термин «индивид» или «пациент» обычно относится к млекопитающему, такому как человек. Млекопитающие обычно включают, но не ограничиваются, людей, нечеловекообразных приматов, крыс, мышей, кошек, собак, лошадей, крупный рогатый скот, коров, свиней, овец и кроликов.

Термин «ингибитор киназ» обычно относится к молекулам, которые антагонизируют или ингибируют зависимую от фосфорилирования передачу клеточного сигнала и/или путей роста в клетке. Ингибиторы киназ могут быть естественными или синтетическими и включают небольшие молекулы, которые возможно вводить в качестве пероральных лекарственных средств. Ингибиторы киназ обладают способностью быстро и специфически ингибировать активацию целевых молекул киназ. Протеинкиназы являются привлекательными мишенями для лекарственных средств частично потому, что они регулируют широкое множество сигнальных и ростовых путей и включают множество различных белков. По существу, они обладают значительной эффективностью в лечении заболеваний, включающих передачу сигнала киназами, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания, воспалительные заболевания, диабет, макулярную дегенерацию и неврологические расстройства. Примеры ингибиторов киназ включают сорафениб (Nexavar®), Sutent®, дасатиниб, DasatinibTM, ZactimaTM, TykerbTM и STI571.

Термин «линейный синтез» обычно относится к синтезу, который начинается на одном конце олигонуклеотида и прогрессирует линейно к другому концу. Линейный синтез допускает включение и идентичных или неидентичных (в отношении длины, состава оснований или включаемых химических модификаций) мономерных единиц в олигонуклеотид.

Термин «млекопитающее» широко предназначен для включения теплокровных позвоночных животных, включая, без ограничения, людей.

Термин «модифицированный нуклеозид» обычно представляет собой нуклеозид, который включает модифицированное гетероциклическое основание, модифицированный сахарный компонент или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления изобретения модифицированным нуклеозидом является неестественный пиримидиновый или пуриновый нуклеозид, как описано в настоящем описании. Для целей изобретения модифицированный нуклеозид, аналог пиримидина или пурина или неестественный пиримидин или пурин, могут быть использованы взаимозаменяемо и относятся к нуклеозидам, которые включают неестественное основание и/или неестественный сахарный компонент. Для целей изобретения основание расценивают как неестественное, если оно не является гуанином, цитозином, аденином, тимином или урацилом.

Термин «модуляция» или «модулирующий» обычно относится к изменению, такому как увеличение ответа или количественная разница в ответе, опосредованном TLR9.

Термин «линкер» обычно относится к любому компоненту, который может быть прикреплен к олигонуклеотиду посредством ковалентных или нековалентных связей посредством сахара, основания или скелета. Линкер может использоваться для прикрепления одного или больше нуклеозидов или может быть прикреплен к 5' и/или 3'-концевому нуклеотиду в олигонуклеотиде. В определенных вариантах осуществления изобретения такой линкер может быть ненуклеотидным линкером.

Термин «ненуклеотидный линкер» обычно относится к химическому компоненту, иному, чем нуклеотидный линкер, который может быть прикреплен к олигонуклеотиду посредством ковалентной или нековалентной связи. Предпочтительно такой ненуклеотидный линкер имеет от около 2 ангстрем до около 200 ангстрем в длину и может быть или в цис-, или в трансориентации.

Термин «нуклеотидная связь» обычно относится к химической связи для объединения двух олигонуклеотидов посредством их сахаров (например, 3'-3', 2'-3', 2'-5', 3'-5'), состоящих из атома фосфора и заряженной или нейтральной группы (например, фосфодиэфира, фосфоротиоата или фосфородитиоата) между соседними нуклеозидами.

Термин «соединение на основе олигонуклеотидов» относится к полинуклеозиду, образованному из множества связанных нуклеозидных единиц. Нуклеозидные единицы могут быть частью или могут быть частично сделаны из вирусов, бактерий, обломков клеток, сиРНК или микроРНК. Такие олигонуклеотиды также могут быть получены из существующих источников нуклеиновых кислот, включая геномную или кДНК, но предпочтительно получены синтетическими методами. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения такая нуклеозидная единица включает гетероциклическое основание и пентофуранозил, трегалозу, арабинозу, 2'-деокси-2'-замещенный нуклеозид, 2'-деокси-2'-замещенную арабинозу, 2'-О-замещенную арабинозу или гексозную сахарную группу. Нуклеозидные остатки могут быть связаны друг с другом с помощью любого из множества известных межнуклеотидных связей. Такие межнуклеозидные связи включают, без ограничения, фосфодиэфир, фосфоротиоат, фосфородитиоат, алкилфосфонат, алкилфосфонотиоат, фосфотриэфир, фосфорамидат, силоксан, карбонат, карбоалкокси, ацетамидат, карбамат, морфолино, борано, тиоэфир, мостиковый фосфорамидат, мостиковый метиленфосфонат, мостиковый фосфоротиоат и сульфоновые межнуклеозидные связи.

Термин «соединения на основе олигонуклеотидов» также охватывает полинуклеозиды, имеющие одну или больше стереоспецифичных межнуклеозидных связей (например, (R_p)- или (S_p)-фосфоротиоат, алкилфосфонат или фосфотриэфирные связи). Как используется в настоящем описании, термины «олигонуклеотид» и «динуклеотид» широко предназначены для включения полинуклеозидов и динуклеозидов, имеющих любые такие межнуклеозидные связи, включают ли эти связи фосфатную группу или нет. В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения такие межнуклеозидные связи могут быть фосфодиэфирными, фосфоротиоатными или фосфородитиоатными связями или их комбинациями.

Термин «пептид» в общем относится к полипептидам, которые имеют достаточную длину и состав для влияния на биологический ответ, например продукцию антител или активность цитокинов, является ли пептид гаптеном или нет. Термин «пептид» может включать модифицированные аминокислоты (или естественные, или неестественные), где такие модификации включают, но не ограничиваются, фосфорилирование, гликозилирование, пегилирование, липидизацию и метилирование.

Термин «агонист TLR9» в общем относится к соединению на основе олигонуклеотида, которое способно усиливать, индуцировать или модулировать иммунную стимуляцию, опосредованную TLR9.

Термин «лечение» в общем относится к подходу, предназначенному для получения целебного или желаемого результата, который может включать облегчение симптомов или отсрочку или облегчение прогрессирования заболевания.

Определенные агонисты TLR9 по изобретению показаны в таблице I ниже. В этой таблице агонисты TLR9 на основе олигонуклеотидов имеют все фосфоротиоатные (PS) связи за исключением тех, где указано. Однако специалисту в области техники понятно, что могут быть использованы фосфодиэфирные (РО) связи или комбинация PS и PO связей. За исключением того, где указано, все нуклеотиды представляют собой деоксирибонуклеотиды.

G₁=7-деаза-dG; G₂=AraG; G₃=7-деаза-араG; A/G/C/U=2'-O-метилрибонуклеозиды; dU=U₁=2'-деокси-U; ο=афосфодиэфирная связь; рο=5'-монофосфат; ps=5'фосфоротиоатная связь; pm=метилфосфонат (неионный линкер); L=1,5-пентандиоловый линкер; L=1,2-дидеоксирибоза; L₁=триэтиленгликолевый линкер; L₂=тетраэтиленгликолевый линкер; L₃=гексаэтиленгликолевый линкер, М=цис,цис-1,3,5-циклогексантриоловый линкер; m=цис,транс-1,3,5-циклогексантриоловый линкер; Х=глицериновый линкер; X₁=1,2,4-бутантриоловый линкер; Х₂=линкер 1,3,5-трис(2-гидроксиэтил)циануровая кислота; Х₃=изобутантриоловый линкер; Y=1,3-пропандиоловый линкер; Y₁=1,2-этилендиоловый линкер; Y₂=1,4-бутандиоловый линкер; Y₃=1,5-пентандиоловый линкер; Z=1,3,5-пентантриоловый линкер.

Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении иммуностимулирующей активности в клетках HEK293, экспрессирующих TLR9, как описано в примере 2. Результаты, показанные на фиг.3А, 3В, 3С, 3D и 3Е, демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов будут изменять их TLR9 опосредованный профиль активации NF-κB

через 18 часов после введения. В общем, полученные данные демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов могут быть использованы для увеличения или снижения активации NF-κB.

Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении иммуностимулирующей активности в анализе человеческих PBMC в отношении IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, IL-1Rα, IL-2R и MCP-1, как описано в примере 3. Результаты, показанные на фиг.4А-4FF, демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов будут изменять их TLR9 опосредованный профиль активации IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, IL-1Rα, IL-2R и MCP-1 в человеческих PBMC. В общем, полученные данные демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов могут быть использованы для увеличения или снижения активации IL-2, IL-10, IL-8, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, IL-1Rα, IL-2R и MCP-1.

Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении иммуностимулирующей активности в анализе человеческих pDC в отношении IL-12, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β и TNFα, как описано в примере 3. Результаты, показанные на фиг.5А и 5В, демонстрируют, что специфические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов изменяют их TLR9 опосредованный профиль иммунной активации в человеческих pDC. В общем, полученные данные демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов могут использоваться для увеличения или снижения активации IL-12, IL-6, IFN-α, IP-10, MIP-1α, MIP-1β и TNFα.

Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении иммуностимулирующей активности в анализе пролиферации человеческих В-клеток, как описано в примере 4. Результаты, показанные на фиг.6А, 6В, 6С, 6D, 6Е и 6F, демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов изменяют их TLR9 опосредованную пролиферативную активность В-клеток и этот профиль активации может быть дозозависимым в зависимости от химической модификации. В общем, полученные данные демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'связанных олигонуклеотидов могут быть использованы для регуляции пролиферации В-клеток.

Примерные агонисты TLR9 из таблицы I исследовали в отношении in vivo иммуностимулирующей активности у мышей C57B1/6 и BALB/c, как описано в примере 5. Результаты, показанные на фиг.7А, 7В, 7D, 7Е и 7F, демонстрируют, что специфические химические модификации 3'-3'-связанных олигонуклеотидов изменяют их TLR9 опосредованный in vivo профиль иммунной активации в моделях на мышах. В общем, полученные данные демонстрируют, что такие специфические химические модификации 3'-3'-связанных олигонуклеотидов могут изменять in vivo концентрации цитокинов и/или хемокинов, что находит применение при множестве заболеваний.

Как описано выше, изобретение обеспечивает в первом аспекте синтетические агонисты TLR9 на основе олигонуклеотидов. На основании определенных химических модификаций основания, сахара, связи или линкера агонисты TLR9 могут обладать повышенной стабильностью при ассоциации и/или удвоении с другими молекулами агониста TLR9 при удержании приемлемого 5'-конца.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ненуклеозидные линкеры могут включать, но не ограничиваются, перечисленные в таблице II.

Таблица IIХарактерные ненуклеотидные линкеры
Глицерин (1,2,3-пропантриол)	1,1,1-трис(гидроксиметил)нитрометан
1,2,4-бутантриол	1,1,1-трис(гидроксиметил)пропан
2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол	1,2,6-гексантриол
2-(гидроксиметил)-1,4-бутандиол	3-метил-1,3,5-пентантриол

1,3,5-пентантриол	1,2,3-гептантриол
1,1,1-трис(гидроксиметил)этан	2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол
	N-[трис(гидроксиметил)метил]акрил-амид