Варианты альфа-амилазы bacillus licheniformis с повышенной термостабильностью и/или сниженной кальциевой зависимостью

Варианты альфа-амилазы bacillus licheniformis с повышенной термостабильностью и/или сниженной кальциевой зависимостью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Прилагается список последовательностей, включающий SEQ ID NO:1-6, содержание которого включено в данный документ в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представлены нуклеиновые кислоты и кодируемые ими полипептиды. Указанные полипептиды имеют альфа-амилазную активность, где полипептид является модифицированной формой альфа-амилазы Bacillus, в частности альфа-амилазы Bacillus licheniformis, и полипептид характеризуется изменением по меньшей мере одного из следующих свойств относительно указанной исходной альфа-амилазы: субстратной специфичности, связывания субстрата, паттерна расщепления субстрата, термостабильности, рН-профиля активности, рН-профиля стабильности, устойчивости к окислению, Са²⁺-зависимости, уменьшенной и увеличенной pI и улучшенных моющих свойств, специфической активности, стабильности, например, при высоких температурах и/или в условиях низких рН, в частности при низких концентрациях кальция.

Полипептиды, описанные в данном документе, пригодны для обработки крахмала, получения этанола, создания детергента, мойки посуды, чистки твердых поверхностей, расшлихтовки текстильного изделия и/или производства подсластителей.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Крахмал состоит из смеси амилозы (15-30% в/в) и амилопектина (70-85% в/в). Амилоза состоит из линейных цепей α-1,4-связанных молекул глюкозы с молекулярным весом (MW) от приблизительно 60000 до приблизительно 800000. Амилопектин представляет собой разветвленный полимер, содержащий те же самые α-1,4-связанные молекулы глюкозы, а также α-1,6 точки разветвления через каждые 24-30 глюкозных остатков; его MW может достигать до 100 миллионов.

Сахара из крахмала в виде концентрированного паточного сиропа на сегодняшний день получают в ходе ферментативного процесса, включающего: (1) разжижение (или уменьшение вязкости) твердого крахмала под действием альфа-амилазы с образованием декстринов, имеющих среднюю степень полимеризации, равную приблизительно 7-10; и (2) осахаривание получаемого разжиженного крахмала, то есть гидролизата крахмала, под действием амилоглюкозидазы (также называемой глюкоамилазой). Получаемый сироп имеет высокое содержание глюкозы. Значительная часть глюкозного сиропа, получаемого промышленным способом, в дальнейшем ферментативно изомеризуется с образованием декстроза-фруктозной смеси, известной как изосироп.

Альфа-амилазы (ЕС 3.2.1.1) гидролизуют крахмал, гликоген и родственные полисахариды путем расщепления внутренних α-1,4-гликозидных связей случайным образом. Эти ферменты имеют ряд важных применений в промышленности, включая разжижение крахмала, расшлихтовку текстильного изделия, модификацию крахмала в бумажной и целлюлозной промышленности, переработку зерна, выпекание и пивоварение. Альфа-амилазы также могут быть использованы в детергентах автоматической мойки посуды и в составе детергента для стирки белья, включая те, которые содержат отбеливатели, для удаления крахмальных пятен во время мойки.

Альфа-амилазы выделяют из огромного числа бактерий, грибов, растений и животных. Многие промышленно важные альфа-амилазы выделяют из видов Bacillus, например Bacillus licheniformis, отчасти из-за высокой способности Bacillus секретировать амилазы в ростовую среду. Хотя альфа-амилазу В. Licheniformis можно получить экономично, этот фермент, как и другие альфа-амилазы, не используется в некоторых сферах применения, несмотря на то, что альфа-амилаза В. Licheniformis имеет значительную структурную гомологию с этими альфа-амилазами. В последние годы были сделаны попытки создания вариантов альфа-амилазы с улучшенными свойствами в связи со специфическим использованием, таким как разжижение крахмала и расшлихтовка текстильного изделия.

В промышленности сохраняется потребность в идентификации и оптимизации амилаз, пригодных для различных сфер применения, включая промышленные процессы разжижения. Эти кислые амилазы второго поколения будут обладать улучшенными технологическими и/или эксплуатационными характеристиками по сравнению с промышленными стандартными ферментами, например, из Bacillus licheniformis. Таким образом, сохраняется потребность в таком варианте альфа-амилазы, который по сравнению с соответствующей исходной альфа-амилазой (то есть не мутированной альфа-амилазой) будет иметь альфа-амилазную активность и характеризоваться изменением по меньшей мере одного из вышеупомянутых свойств относительно указанной исходной альфа-амилазы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из аспектов изобретения относится к варианту исходной альфа-амилазы В. Licheniformis, где данный вариант имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 90% идентична последовательности SEQ ID NO:4 и содержит замену S239, соответствующую SEQ ID NO:4, и где указанный вариант проявляет альфа-амилазную активность. Вариант может содержать SEQ ID NO:2; альтернативно, он может по существу состоять из SEQ ID NO:2 или состоять из SEQ ID NO:2. Вариант может представлять замену S239: либо S239Q, либо S239A. Другой аспект изобретения относится к варианту, который по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен последовательности SEQ ID NO:4 или по меньшей мере приблизительно на 98% идентичен данной последовательности.

Другой аспект изобретения относится к варианту, имеющему измененную температуру плавления по сравнению с альфа-амилазой SEQ ID NO:4.

Альтернативно, рассматриваемый вариант не требует дополнительного кальция.

Другой аспект изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей вариант исходной альфа-амилазы В. Licheniformis, где указанный вариант имеет замену S239, соответствующую SEQ ID NO:4, и по меньшей мере приблизительно на 90% идентичен последовательности SEQ ID NO:4 и где указанный вариант проявляет альфа-амилазную активность. Выделенная нуклеиновая кислота может содержать SEQ ID NO:2 или кодировать любой из вариантов, обсуждаемых выше и здесь. Другой аспект изобретения относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту в функционально связанном виде. В следующем аспекте изобретения нуклеиновая кислота рассматривается в составе клетки-хозяина, возможно в векторе, содержащем указанную нуклеиновую кислоту в этой клетке-хозяине. Клетка-хозяин может быть бактерией или грибом. Бактерия может быть грамположительной бактерией, выбранной из группы, состоящей из Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans и S. murinus; или грамотрицательной бактерией, где указанная грамотрицательная бактерия является Escherichia coli и видом Pseudomonas.

Другой аспект относится к композиции для разжижения крахмала, содержащей вариант, обсуждаемый выше или здесь, и где указанная композиция находится в растворе. Следующий вариант осуществления изобретения относится к способу разжижения крахмала, включающему применение композиции по отношению к молотой кукурузе или крахмальной суспензии в течение времени, достаточного для разжижения указанного крахмала. Композиция может быть добавлена к молотой кукурузе или крахмальной суспензии в концентрации 40-60 мкг/г сухого твердого вещества. Крахмальный раствор может быть раствором кукурузного крахмала. Следующий аспект изобретения относится к разжижению крахмальной суспензии при температуре от приблизительно 85°С до приблизительно 105°С. Альтернативно или в качестве дополнения, крахмальная суспензия может быть разжижена при рН от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5. Продукт разжижения может быть, кроме того, подвергнут брожению для получения этанола. Более того, предполагается то, что этап брожения производит по меньшей мере приблизительно на 2,5% (по объему) этанола больше, чем дикий тип. При этом с коммерческой точки зрения указанные этапы разжижения и брожения могут проводиться одновременно в одном и том же реакционном резервуаре. Это может быть осуществлено в присутствии кальция, но также может быть выполнено без дополнительного кальция, который добавляют в состав реакционной смеси.

Другой аспект относится к композиции для осахаривания крахмала, с использованием любого из вариантов, обсуждаемых выше или здесь. Способ осахаривания крахмала заключается в применении композиции, содержащей вариант, в течение времени, достаточного для осахаривания указанного крахмала. Дополнительный кальций не должен быть добавлен.

Другой аспект изобретения относится к моющей добавке. Моющая добавка может содержать вариант, обсуждаемый выше или здесь. Моющая добавка может дополнительно содержать фермент, выбранный из группы, состоящей из: целлюлазы, протеазы, аминопептидазы, амилазы, карбогидразы, карбоксипептидазы, каталазы, хитиназы, кутиназы, циклодекстринглюканотрансферазы, дезоксирибонуклеазы, эстеразы, α-галактозидазы, β-галактозидазы, глюкоамилазы, α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, галопероксидазы, инвертазы, лакказы, липазы, маннозидазы, оксидазы, пектинолитического фермента, пептидоглутаминазы, пероксидазы, фитазы, полифенолоксидазы, протеолитического фермента, рибонуклеазы, трансглутаминазы, ксиланазы, пуллуланазы, изоамилазы, каррагиназы или любой комбинации вышеперечисленного. Моющая добавка может быть, кроме того, в виде не пылящего гранулята, микрогранулята, стабилизированной жидкости или защищенного фермента.

Другой аспект изобретения относится к композиции детергента (для очистки поверхностей, стирки и мойки посуды). Рассматриваемая композиция детергента может содержать моющую добавку, описанную выше и здесь. Она может дополнительно содержать один или несколько ферментов, выбранных из группы, состоящей из целлюлазы, протеазы, аминопептидазы, амилазы, карбогидразы, карбоксипептидазы, каталазы, хитиназы, кутиназы, циклодекстринглюканотрансферазы, дезоксирибонуклеазы, эстеразы, α-галактозидазы, β-галактозидазы, глюкоамилазы, α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, галопероксидазы, инвертазы, лакказы, липазы, маннозидазы, оксидазы, пектинолитического фермента, пептидоглутаминазы, пероксидазы, фитазы, полифенолоксидазы, протеолитического фермента, рибонуклеазы, трансглутаминазы, ксиланазы, пуллуланазы, изоамилазы, каррагиназы или любой комбинации вышеперечисленного. Композиция детергента может дополнительно содержать поверхностно-активное вещество в любой комбинации с вышеперечисленным. Композиции детергента могут дополнительно содержать один или несколько поверхностно-активных веществ, моющих компонентов детергента, комплексообразователей, полимеров, систем отбеливания, стабилизаторов, пенообразователей, пеногасителей, антикоррозийных средств, преобразующих грязь в суспензию средств, средств от повторного загрязнения, красителей, бактерицидных средств, гидротропов, оптических отбеливателей, кондиционеров для ткани и отдушек.

Другой аспект изобретения относится к композиции расшлихтовки текстильного изделия, содержащей вариант, обсужденный выше или здесь, в водном растворе и дополнительно содержащей другой фермент. Кроме того, рассматривается способ расшлихтовки текстильного изделия, включающий применение композиции расшлихтовки в течение времени, достаточного для расшлихтовки указанного текстильного изделия. Способ не требует добавления дополнительного кальция.

Следующий аспект изобретения относится к композиции для переработки крахмала, содержащей вариант, обсужденный выше или здесь. Композиция для переработки крахмала может дополнительно содержать глюкоамилазу, изоамилазу, пуллуланазу, фитазу или любую комбинацию вышеуказанного. Композиция для переработки крахмала может быть использована для переработки крахмала путем применения композиции в течение времени, достаточного для переработки указанного крахмала. Не требуется добавлять дополнительный кальций.

Следующий аспект изобретения относится к композиции для выпекания, содержащей вариант, описанный выше или здесь. Другой аспект изобретения относится к способу выпекания с использованием указанной композиции, включающему применение композиции для выпекания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Прилагаемые чертежи включены и составляют часть настоящего описания изобретения, иллюстрируют варианты осуществления изобретения. На чертежах:

На Фиг.1 представлена плазмида pHPLT-LAT, используемая для синтеза вариантов LAT S239.

На Фиг.2 представлен процент остаточной активности вариантов LAT S239 после теплового шока при 95°С в течение 30 минут. По вертикальной оси отложен % остаточной активности после теплового шока. Пунктирная линия представляет 2Х и 3Х превышение стандартного отклонения от имеющейся остаточной активности LAT дикого типа. Варианты S239Q и S239A демонстрируют повышенную термостабильность относительно LAT дикого типа. Наблюдаемое повышение термостабильности статистически значимо.

На Фиг.3 представлена остаточная активность варианта LAT S239Q по сравнению с исходной LAT дикого типа в буферах. Чертеж построен путем нанесения % остаточной амилазной активности в зависимости от времени реакции и рН реакции. Относится к Примеру 3.

На Фиг.4 представлена остаточная активность варианта LAT S239Q по сравнению с исходной LAT дикого типа в субстрате. Чертеж построен путем нанесения % остаточной амилазной активности в зависимости от времени реакции и рН реакции. Относится к Примеру 3.

На Фиг.5 представлены рН-профили варианта LAT S239Q по сравнению с исходной LAT дикого типа. Чертеж построен путем нанесения % остаточной амилазной активности в зависимости от рН реакции. Относится к Примеру 3.

На Фиг.6 представлены температурные профили варианта LAT S239Q по сравнению с LAT дикого типа. Чертеж построен путем нанесения общего количества редуцирующих сахаров (как продукта амилазной реакции) в зависимости от температуры реакции. Относится к Примеру 3.

На Фиг.7 представлено нарастание DE общего количества молотой кукурузы, обработанной вариантом LAT S239Q по сравнению с Fred при 108°С и 115°С. Чертеж построен путем нанесения наблюдаемого значения DE в зависимости от времени вторичного разжижения. Относится к Примеру 6.

На Фиг.8 представлено нарастание DE общего количества молотой кукурузы, обработанной вариантом LAT S239Q по сравнению с Fred при различных рН. Чертеж построен путем нанесения наблюдаемого значения DE в зависимости от времени вторичного разжижения. Относится к Примеру 6.

На Фиг.9 представлено нарастание DE общего количества молотой кукурузы, обработанной вариантом LAT S239Q, по сравнению с Fred при рН 5,6 и низком содержании кальция. Чертеж построен путем нанесения наблюдаемого значения DE в зависимости от времени вторичного разжижения. Относится к Примеру 6.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

1. Определения и аббревиатуры

В соответствии с настоящим подробным описанием используются следующие аббревиатуры и определения. Следует отметить, что используемая в настоящем документе форма единственного числа включает формы множественного числа, если только в контексте отчетливо не предусмотрено иное. Так, например, ссылка на «полипептид» включает множество таких полипептидов и ссылка на «композицию» включает одну или несколько композиций и эквивалентов вышеуказанного, известных специалистам в данной области техники, и так далее.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значения, общепринятые среди специалистов в данной области техники. Ниже представлены следующие термины.

1.1. Определения

«Крахмал» относится к любому веществу, состоящему из сложных полисахаридных карбогидратов растений, состоящих из амилозы и амилопектина, обозначенного формулой (C₆H₁₀O₅)_x, где «Х» может быть любым числом. В частности, термин относится к любому веществу растительного происхождения, включая, помимо прочего, зерновые культуры, травы, клубнеплоды и корнеплоды, в частности пшеницу, ячмень, кукурузу, рожь, рис, сорго, отруби, маниоку, просо и тапиоку.

«Амилаза» означает фермент, который, помимо всего прочего, способен катализировать расщепление крахмала. «Амилаза» включает любую амилазу, такую как глюкоамилазу, альфа-амилазу, β-амилазу и альфа-амилазу дикого типа вида Bacillus, в частности B. licheniformis. Амилазы являются гидролазами, которые расщепляют α-D-(1→4)О-гликозидные связи в крахмале. Как правило, альфа-амилазы (EC 3.2.1.1; α-D-(1→4)-глюкан глюканогидролаза) характеризуются как эндоферменты, расщепляющие α-D-(1→4)О-гликозидные связи в молекуле крахмала случайным образом. Напротив, амилолитические экзоферменты, такие как β-амилазы (EC 3.2.1.2; α-D-(1→4)-глюкан мальтогидролаза), и некоторые продукт-специфичные амилазы, как мальтогенная альфа-амилаза (EC 3.2.1.133), расщепляют молекулу крахмала с нередуцированного конца субстрата. β-амилазы, α-глюкозидаза (EC 3.2.1.20; α-D-гликозид глюкогидролаза), глюкоамилаза (EC 3.2.1.3; α-D-(1→4)-глюкан глюкогидролаза) и продукт-специфические амилазы могут образовывать мальтоолигосахариды определенной длины из крахмала.

«Варианты» относятся как к полипептидам, так и нуклеиновым кислотам. Термин «вариант» может быть использован взаимозаменяемо с термином «мутант». Варианты включают вставки, замены, трансверсии, усечение концов и/или инверсии в одном или нескольких местах в аминокислотной или нуклеотидной последовательностях относительно исходной последовательности. Нуклеиновые кислоты варианта могут включать последовательности, комплементарные последовательности, способные гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями, представленными в данном документе. Например, последовательность варианта комплементарна последовательностям, способным гибридизоваться в жестких условиях (например, 50°С и 0,2X SSC {1X SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат натрия, рН 7,0}) с нуклеотидными последовательностями, представленными в данном документе. В частности, термин вариант подразумевает последовательности, которые комплементарны последовательностям, способным гибридизоваться в условиях высокой жесткости (например, 65°С и 0,1Х SSC) с нуклеотидными последовательностями, представленными в данном документе.

«Изолированный» означает, что последовательность по меньшей мере практически свободна от хотя бы одного компонента, с которым данная последовательность связана самопроизвольным образом и является природной.

«Очищенный» означает, что вещество находится в относительно чистом состоянии, например, имеет по меньшей мере приблизительно 90% чистоты, по меньшей мере приблизительно 95% чистоты, по меньшей мере приблизительно 98% чистоты или по меньшей мере приблизительно 99% чистоты.

«Термостабильный» означает, что фермент термостабильнее фермента сравнения. В настоящей заявке вариант альфа-амилазы термостабильнее альфа-амилазы дикого типа B. licheniformis, если вариант имеет относительно высокую ферментативную активность после определенного интервала времени в тех же экспериментальных условиях, например, при той же температуре, концентрации субстрата и т.д. Альтернативно, более термостабильный фермент имеет более высокую теплоемкость, измеренную дифференциальной сканирующей калориметрией, относительно фермента сравнения.

«Температура плавления» полипептида - это температура, при которой 50% образца полипептида полностью денатурирует.

«Кальциевая зависимость» означает, что существует необходимость добавления дополнительного кальция для использования фермента в указанной заявке.

«Диапазон рН» означает значения рН, при больших или меньших величинах которых фермент проявляет активность.

Используемый в настоящем документе «рН-стабильный» означает, что фермент стабильнее фермента сравнения при определенном значении рН. В настоящей заявке вариант альфа-амилазы рН-стабильнее альфа-амилазы дикого типа B. licheniformis, если вариант имеет относительно высокую активность после определенного интервала времени в тех же экспериментальных условиях, например при том же значении рН и т.д.

«Рекомбинантный» при использовании по отношению к клетке, нуклеиновой кислоте, белку или вектору означает, что данная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или путем изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка или что данная клетка была получена из клетки, модифицированной таким образом. Так, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которых нельзя обнаружить в нативных (не рекомбинантных) клетках, или экспрессируют нативные гены, которые иным образом аномально экспрессируются, мало экспрессируются или не экспрессируются вовсе.

Используемый в данном документе «пищевой продукт» включает как приготовленный пищевой продукт, так и ингредиент пищевого продукта, такой как мука.

Используемый в данном документе «ингредиент пищевого продукта» включает композицию, которая добавляется или может быть добавлена в продукт здорового питания или кормовой продукт, и включает композиции, используемые в небольших количествах в широком наборе продуктов, требующих, например, подкисления или эмульгирования. Ингредиент пищевого продукта может быть в виде раствора или твердого вещества в зависимости от использования, и/или способа применения, и/или способа введения.

Используемый в данном документе «продукт здорового питания» означает способность пищевого продукта обеспечить не только действие питательных веществ и удовлетворение вкуса, но также и любое дополнительное благотворное действие потребителю.

Используемый в данном документе термин «аминокислотная последовательность» является синонимом термина «полипептид» и может быть использован взаимозаменяемо с термином «белок». В некоторых случаях термины «аминокислотная последовательность», «пептид» и «аминокислотная последовательность» и «фермент».

Используемая в данном документе «нуклеотидная последовательность» или «последовательность нуклеиновой кислоты» относится к олигонуклеотидной последовательности или полинуклеотидной последовательности и вариантам, гомологам, фрагментам и их производным. Нуклеотидная последовательность может быть геномного, синтетического или рекомбинантного происхождения и может быть двухцепочечной или одноцепочечной, будь то смысловая или антисмысловая цепь. Используемый в данном документе термин «нуклеотидная последовательность» включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК.

«Вектор» относится к полинуклеотидной последовательности, сконструированной для введения нуклеиновых кислот в один или несколько типов клеток. Векторы включают векторы для клонирования, экспрессионные векторы, бифункциональные векторы, плазмиды, фаговые частицы, кассеты и тому подобное.

Используемый в данном документе «экспрессионный вектор» означает конструкцию ДНК, содержащую последовательность ДНК, которая функционально связана с подходящей регуляторной последовательностью, обеспечивающей эффективную экспрессию ДНК в подходящем хозяине. Такие регуляторные последовательности могут включать промотор для воздействия на транскрипцию, дополнительную последовательность оператора для регулирования транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания рибосом на мРНК, энхансеры и последовательности, регулирующие терминацию транскрипции и трансляции.

«Сигнальная последовательность» означает последовательность аминокислот, связанную с N-концевой частью белка, которая облегчает секрецию зрелой формы белка из клетки. Определение сигнальной последовательности является функциональным. У зрелой формы внеклеточного белка отсутствует сигнальная последовательность, которая отщепляется во время процесса секреции.

«Ген» относится к сегменту ДНК, который участвует в синтезе полипептида и содержит области, предшествующие кодирующим областям и следующие за ними, а также встроенные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

«Промотор» является регуляторной последовательностью, участвующей в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции гена. Промотор может быть индуцибельным промотором или конститутивным промотором. Типичным, используемым в настоящем документе промотором является Trichoderma reesei cbh1, который является индуцибельным промотором.

«Находящийся под транскрипционным контролем» является термином, хорошо понятным в данной области техники, который означает, что транскрипция полинуклеотидной последовательности, как правило последовательности ДНК, зависит от ее функциональной связи с элементом, который способствует инициации или активации транскрипции.

«Находящийся под трансляционным контролем» является термином, хорошо понятным в данной области техники, который означает регуляторный процесс, происходящий после образования мРНК.

При описании белков и кодирующих их генов используемое в настоящем документе обозначение гена выделяется курсивом (например, ген, кодирующий amyL (B. licheniformis AA) может быть обозначен как amyL). Обозначение белка, как правило, не выделяется курсивом и первая буква обычно пишется заглавной (например, белок, кодируемый геном amyL, может быть обозначен как AmyL или amyL).

Термин «происходящий» распространяется на термины «происходящий из», «полученный» или «получаемый из» или «выделенный из».

«Функционально связанный» относится к соединению, в котором элементы расположены в определенном порядке, что позволяет им быть функционально связанными. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он регулирует транскрипцию данной последовательности.

«Селективный маркер» относится к гену, способному экспрессироваться в хозяине, что позволяет без труда отобрать этих хозяев, содержащих введенную нуклеиновую кислоту или вектор. Примерами селективных маркеров являются, помимо прочего, антибактериальные препараты (например, гигромицин, блеомицин или хлорамфеникол) и/или гены, наделяющие метаболическим преимуществом клетку-хозяина, как, например, преимуществом, обусловленным питанием.

«Введенный» в контексте введения нуклеиновой кислоты в клетку означает «трансфекцию», или «трансформацию», или «трансдукцию» и включает ссылку на внедрение последовательности нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, в которой последовательность нуклеиновой кислоты может быть встроена в геном данной клетки (например, хромосому, плазмиду, пластиду или митохондриальную ДНК), превращена в автономный репликон или временно экспрессироваться (например, трансфицированная мРНК).

Используемая в настоящем документе «трансформированная клетка» включает клетки, трансформированные с использованием технологий рекомбинантной ДНК. Трансформация обычно происходит путем введения одной или нескольких нуклеотидных последовательностей в клетку. Введенная нуклеотидная последовательность может быть гетерологичной нуклеотидной последовательностью, т.е. последовательностью, не естественной для данной клетки, подлежащей трансформации, как, например химерный белок.

«Хозяйский штамм» или «клетка-хозяин» означает подходящего хозяина для экспрессионного вектора или конструкции ДНК, содержащих полинуклеотид, кодирующий фермент варианта альфа-амилазы в соответствии с описанием изобретения. В частности, хозяйские штаммы могут быть бактериальными клетками. В варианте осуществления изобретения «клетка-хозяин» означает как клетки, так и протопласты, происходящие из клеток микробного штамма, в частности вида Bacillus.

Полинуклеотид или полипептид, имеющий определенный процент (например, по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%) идентичности с другой последовательностью, означает, что при выравнивании процент оснований или аминокислотных остатков одинаков при сравнении двух последовательностей. Это выравнивание или процент гомологии или идентичность могут быть определены с использованием любой подходящей компьютерной программы, известной в данной области техники, например, тех, что описаны в СОВРЕМЕННЫХ ПРОТОКОЛАХ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18). Такие программы могут включать программу GCG Pileup, FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:2444-2448) и BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Nat'l Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., and Altschul et al., (1997) NAR 25:3389-3402). Другой программой для выравнивания является ALIGN Plus (Научное и Образовательное программное обеспечение, РА) с использованием стандартных параметров. Другой находящей применение компьютерной программой, работающей с последовательностями, является Программа Поиска Данных TFASTA (TFASTA Data Searching Program), доступная в Пакете Программ (Sequence Software Package Version 6.0) (Компьютерная Группа Генетики, Университет Висконсин, Мэдисон, WI).

Специалист в данной области техники считает, что рассматриваемые в данном описании изобретения последовательности могут быть охарактеризованы по способности гибридизоваться в жестких условиях гибридизации с типичной последовательностью amyL (например, SEQ ID NO:7 WO 06/002643). Нуклеиновая кислота способна гибридизоваться с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, когда одноцепочечная форма нуклеиновой кислоты может осуществить отжиг с другой нуклеиновой кислотой при подходящих температурных условиях и ионной силе раствора. Условия гибридизации и отмывки хорошо известны в данной области техники (смотри, например, Sambrook (1989) supra, в частности, главы 9 и 11). В некоторых вариантах осуществления изобретения жесткие условия соответствуют T_m, равной 65°С, и 0,1xSSC, 0,1% SDS.

«Культивирование» относится к выравниванию популяции микробных клеток при подходящих условиях в жидкой или твердой среде. В одном из вариантов осуществления изобретения культивирование относится к ферментативной биоконверсии крахмального субстрата, содержащего гранулированный крахмал, в конечный продукт (обычно в резервуаре или реакторе).

«Брожение» представляет собой ферментативный и анаэробный распад органических веществ микроорганизмами с образованием более простых органических соединений. Хотя брожение происходит при анаэробных условиях, не предполагается, что термин ограничивается лишь строгими анаэробными условиями, так как брожение также происходит в присутствии кислорода.

«Контактирование» имеет отношение к расположению соответствующего фермента(ов) в достаточной близости от соответствующего субстрата, чтобы дать возможность ферменту(ам) превратить субстрат в конечный продукт. Специалисты в данной области техники считают, что перемешивание растворов фермента с соответствующими субстратами может воздействовать на контактирование.

«Ферментативная конверсия» обычно имеет отношение к модификации субстрата под действием фермента. Данный термин в настоящем документе также относится к модификациям крахмального субстрата под действием фермента.

Используемый в настоящем документе термин «осахаривание» относится к ферментативной конверсии крахмала в глюкозу.

«Клейстеризация» означает солюбилизацию молекулы крахмала путем тепловой обработки для образования вязкой суспензии.

«Разжижение» имеет отношение к стадии превращения крахмала, в которой клейстеризованный крахмал гидролизуется с образованием низкомолекулярных растворимых декстринов.

«Степень полимеризации (DP)» имеет отношение к числу (n) ангидроглюкопиранозных единиц в данном сахариде. Примерами DP1 являются моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза. Примерами DP2 являются дисахариды, такие как мальтоза и сукроза. DP>3 означает полимеры со степенью полимеризации, превышающей 3.

«Конечный продукт» или «ожидаемый конечный продукт» имеют отношение к любому молекулярному продукту, полученному из источника углерода, который ферментативно конвертируется из крахмального субстрата.

Используемый в настоящем документе термин «содержание сухого твердого вещества (ds)» имеет отношение к суммарному твердому веществу в суспензии в % на сухую массу. Термин «суспензия» относится к водной смеси, содержащей нерастворимые твердые вещества.

Термин «остаточный крахмал» относится к сохранившемуся крахмалу (растворимому или нерастворимому), оставшемуся в композиции после брожения крахмалосодержащего субстрата.

«Этап утилизации» имеет отношение к утилизации компонентов сусла, которые могут включать остаточный крахмал, ферменты и/или микроорганизмы для сбраживания субстратов, содержащих крахмал.

Термин «сусло» относится к смеси сбраживаемого источника углерода (карбогидрата) в воде, используемой для образования сброженного продукта, такого как спирт. В некоторых вариантах осуществления изобретения термины «бражка» и «сусло» используются взаимозаменяемо.

«Барда» означает смесь не подвергшегося брожению твердого вещества и воды, которая остается после удаления спирта из подвергшегося брожению сусла.

Термины «высушенное зерно брагоректификационной установки» (DDG) и «высушенное зерно с растворимыми веществами брагоректификационной установки» (DDGS) относятся к используемым побочным продуктам сбраживания зерна.

Используемый в настоящем документе термин «этанологенный микроорганизм» относится к микроорганизму, способному превращать сахар или олигосахариды в этанол. Этанологенный микроорганизм является этанологенным в силу его способности экспрессировать один или несколько ферментов, которые по отдельности или совместно превращают сахар в этанол.

Используемый в настоящем документе «продуцент этанола» или «продуцирующий этанол микроорганизм» относится к любому организму или клетке, способному продуцировать этанол из гексозы или пентозы. Как правило, этанол-продуцирующие клетки содержат алькогольдегидрогеназу и пируватдекарбоксилазу. Примеры этанол-продуцирующих микроорганизмов включают грибковые микроорганизмы, такие как дрожжи.

«Гетерологичный» со ссылкой на полинуклеотид или белок относится к полинуклеотиду или белку, которые не являются естественными для клетки-хозяина.

Используемые в настоящем документе термины «трансформированный», «стабильно трансформированный» и «трансгенный» со ссылкой на клетку означают, что клетка имеет не нативную (например, гетерологичную) последовательность нуклеиновой кислоты, интегрированную в ее геном или в качестве эписомальной плазмиды, сохраняемой на протяжении нескольких поколений.

Используемый в настоящем документе термин «экспрессия» относится к процессу, с помощью которого полипептид синтезируется, исходя из последовательности нуклеиновой кислоты гена. Данный процесс включает как транскрипцию, так и трансляцию.

Используемый в настоящем документе термин «специфическая активность» означает единицу фермента, определенную как число молей субстрата, конвертированного в продукт препаратом фермента в единицу времени при определенных условиях. Специфическая активность выражается в единицах (ед)/мг белка.

«Выход» относится к количеству конечного продукта или ожидаемого конечного продукта, образованного с использованием способов по настоящему описанию изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения выход продукта больше, чем таковой, получаемый с использованием способов, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления изобретения термин относится к объему конечного продукта, а в других вариантах осуществления изобретения термин имеет отношение к концентрации конечного продукта.

Используемый в настоящем документе термин «биологически активный» имеет отношение к последовательности, имеющей структурные, регуляторные или биохимические функции, сходные с таковыми у природной последовательности, хотя не обязательно в той же степени.

«ATCC» относится к Американской Коллекции Типовых Культур, находящейся в Манассасе, Va. 20108 (ATCC).

«NRRL» относится к Службе Сельскохозяйственных Исследований Типовых Культур Национального Центра Сельскохозяйственных Исследований Применения (ранее известного как Северная Региональная Научно-исследовательская Лаборатория USDA), Пеория, III.

1.2. Аббревиатуры

Используются следующие аббревиатуры, если не указано иное:

АЕ	этоксилат спирта
АЕО	этоксилат спирта