Растения томата, обладающие повышенными уровнями устойчивости к botrytis

Растения томата, обладающие повышенными уровнями устойчивости к botrytis

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Настоящее изобретение относится к растениеводству и к молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу детекции локуса количественного признака (QTL), ассоциированного с устойчивостью к Botrytis cinerea в томатах, к способу получения с помощью этого устойчивого к Botrytis растения томата и к устойчивым к Botrytis растениям томата, полученным таким образом, и их частям.

Предпосылки изобретения

Botrytis cinerea представляет собой некротрофный патогенный гриб с исключительно широким диапазоном хозяев, включающим по меньшей мере 235 возможных хозяев. Вследствие его широкого диапазона хозяев и вследствие того, что он поражает экономически значимые части растения, B. cinerea является большой проблемой для многих коммерчески выращиваемых сельскохозяйственных культур. Среди овощеводов гриб обычно называют Botrytis. Культивируемый томат (Solanum lycopersicum; ранее Lycopersicon esculentum) также является восприимчивым к инфекции Botrytis, и гриб поражает, главным образом, стебель, листья и плоды растения томата. В обогреваемых теплицах встречаемость инфекций Botrytis на стеблях является особенно частой.

Botrytis активно уничтожает инфицированные клетки, вызывая мягкую гниль, увядание, пятнистость листьев, черную ножку и злокачественные опухоли стебля. Пораженные листья покрываются конидиофорами и конидиями, а затем поникают и увядают. Гриб будет прорастать из пораженных листьев в стебель и образовывать сухие светло-коричневые очаги повреждения длиной от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров. Очаги повреждения также могут образовываться на рубцах от переломов на стебле. Очаги повреждения на стебле также могут быть покрыты серой гнилью. В тяжелых случаях инфекция опоясывает стебель и уничтожает растение. Старая, увядающая ткань растения томата обычно является более восприимчивой к атаке Botrytis, чем молодая ткань.

В целях предотвращения развития Botrytis в выращиваемых в теплицах томатах температуру и относительную влажность необходимо тщательно регулировать. Кроме того, важно предоставлять воду без смачивания листьев. Для выращиваемых в поле растений следует применять хорошую дренажную систему и борьбу с сорняками. Более того, необходимо поддерживать высокий уровень питательных веществ растений. Однако эти профилактические меры не могут полностью предотвратить возникновение значительной потери урожая в случае инфекции.

Для борьбы с Botrytis в томатах, выращиваемых как в теплицах, так и в поле, доступны фунгициды. Примеры некоторых фунгицидов включают Dowicide A® и хлорталонил, которые можно наносить на плоды томата после сбора. Однако известно, что Botrytis обладает приобретенной устойчивостью против некоторых обычно используемых фунгицидов. Кроме того, применение фунгицидов является нежелательным как вследствие экономической, так и вследствие экологической перспективы. В настоящее время существует необходимость в коммерческих сортах томата, которые проявляют устойчивость к Botrytis.

Частичная устойчивость к Botrytis была выявлена в некоторых диких видах томата (Egashira et al. 2000; Nicot et al. 2002; Urbasch 1986). Однако эти растения не продуцируют коммерческие культуры томата.

В WO 02/085105 описана генетическая область на 10 хромосоме генома S. habrochaites, которая, как полагают, вовлечена в частичную устойчивость к Botrytis. Было показано, что интрогрессия этого генетического материала в культивируемые сорта томата приводит к культивируемым растениям томата, которые являются частично устойчивыми к Botrytis.

Однако до настоящего времени программы разведения, нацеленные на обеспечение устойчивости Botrytis в томате, имели ограниченный успех. Причина этих плохих результатов в настоящее время не ясна. Частично это может быть следствием недостаточного знания о генетической основе и наследовании устойчивости к Botrytis. С другой стороны это может быть следствием отсутствия надлежащих биологических анализов для оценки уровней устойчивости к Botrytis в растениях томата, полученных в программах разведения. Недостаточность знания и способов также осложняет селекцию растений как среди диких изолятов, так и среди растений-потомков, которые содержат гены, вовлеченные в устойчивость к Botrytis.

В более раннем исследовании авторы настоящего изобретения выявили, что устойчивость к Botrytis в томатах наследуется полигенно и что это частично может объяснить плохие результаты разведения устойчивых растений.

Целью настоящего изобретения является повышение успеха программ разведения, нацеленных на получение коммерческих сортов томата, которые являются устойчивыми к Botrytis. Кроме того, целью настоящего изобретения является обеспечение дополнительной и/или повышенной устойчивости к Botrytis в коммерческих сортах томата. Другой целью настоящего изобретения является предоставление дополнительного генетического материала в геноме диких изолятов томата, который вовлечен в устойчивость к Botrytis в таких растениях. Такой дополнительный генетический материал можно использовать для расширения базиса для продукции устойчивых к Botrytis сортов культивируемых томатов.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения выявили, что в геноме S. habrochaites имеется генетический материал на ряде хромосом, которые ранее не были идентифицированы как вовлеченные в устойчивость к Botrytis. В действительности, авторы настоящего изобретения успешно идентифицировали локусы количественных признаков (QTL) в геноме линии дикого родственника томата, т.е. в Solanum habrochaites LYC 4/78. Эти дополнительные QTL были открыты посредством применения интрогрессивных линий.

После этого авторы изобретения получили возможность вывести устойчивые к Botrytis растения томата скрещиванием растений этих устойчивых к Botrytis диких (донорных) линий томата с неустойчивыми реципиентными растениями томата. Эти растения проявляли более высокий уровень устойчивости, чем любое культивируемое растение томата, полученное к настоящему времени.

Усовершенствование относительно предшествующего уровня техники состоит в доступности дополнительных критериев скрининга, посредством которых можно подвергать мониторингу процесс разведения и управлять им. Растения-потомки, полученные скрещиванием между устойчивым диким Solanum habrochaites и восприимчивым культивируемым томатом, можно отбирать по наличию одной или нескольких, или даже всех из геномных областей, вовлеченных в устойчивость к Botrytis в диком изоляте. Результатом этого является разработка способа получения растения томата, при котором требуемый генетический состав можно лучше контролировать. Преимущество способа по изобретению состоит в том, с генетической точки зрения, что можно получить потомство, более сходное с изолятом дикого типа по требуемому признаку. Следовательно, признак устойчивости в культивируемом растении томата может быть более стабильно внесен в него, т.е. в настоящее время предоставлены возможности для оценки того, какие геномные области можно легко подвергать интрогрессии и которые трудно переносить в растения-потомки, какие из геномных областей являются необходимыми, какие из них являются совместно действующими и какие можно использовать для дальнейшего повышения уровней устойчивости в частично устойчивых линиях культивируемых томатов.

Посредством оценки уровня устойчивости к Botrytis в различных интрогрессивных линиях, в каждой из которых произошла конкретная геномная интрогрессия от S. habrochaites LYC 4/78, в зависимости от наличия молекулярных маркеров в донорном растении, авторы настоящего изобретения получили способность идентифицировать дополнительные QTL, связанные с устойчивостью к Botrytis, в устойчивых диких линиях томата и, таким образом, установить расположение ряда придающих устойчивость последовательностей ДНК в геноме. В приведенном ниже описании локус количественного признака (QTL), ассоциированный с устойчивостью к Botrytis в томате, будет кратко обозначен как QTL для устойчивости к Botrytis или QTL, ассоциированный с устойчивостью к Botrytis.

В дикой линии томата S. habrochaites было выявлено всего 5 новых QTL для устойчивости к Botrytis. Один QTL был расположен на 4 хромосоме, которая ранее была идентифицирована, как имеющая QTL, ассоциированный с устойчивостью к Botrytis. Кроме того, было выявлено, что область на этой хромосоме, которую ранее ассоциировали с устойчивостью, в действительности содержит два отдельных QTL. Другие QTL были идентифицированы на 6, 9, 11 и 12 хромосомах. Все новые QTL могли быть связаны с количественным параметром, который отражал способность растения снижать исходное установление инфекции, в дальнейшем в настоящем описании называемым параметром заболеваемости (DI), а также с другим количественным параметром, который отражал способность растения замедлять прогрессирование инфекции, в дальнейшем в настоящем описании называемым параметром скорости роста очага повреждения (LG). Также наличие QTL на хромосоме 10, как описано на предшествующем уровне техники, нельзя было подтвердить используемыми способами. Все QTL, протестированные к настоящему времени, можно подтвердить оценкой устойчивости к заболеванию в потомках BC₅S₁ или BC₅S₂ (возвратное скрещивание 5, однократное или двукратное самоопыление), сегрегирующих по исследуемым QTL.

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения устойчивого к Botrytis растения томата, при этом указанный способ включает стадии:

a) получения устойчивого к Botrytis донорного растения томата, предпочтительно устойчивого к Botrytis растения вида S. habrochaites, более предпочтительно устойчивого к Botrytis растения линии S. habrochaites LYC 4/78;

b) переноса нуклеиновой кислоты из указанного донорного растения в одно или несколько восприимчивых к Botrytis реципиентных растений томата, предпочтительно в растение вида S. lycopersicum, где указанный перенос приводит к внесению геномного материала из донорного растения в соответствующую область генома указанных одного или нескольких восприимчивых реципиентных растений;

c) селекции среди указанных реципиентных растений томата (или из дополнительно самоопыленного полученного растения, подвергнутого возвратному скрещиванию с указанным реципиентным растением томата; т.е. из рекомбинантных растений, полученных после указанного переноса) растения, которое содержит в его геноме по меньшей мере один QTL для устойчивости к Botrytis из указанного устойчивого к Botrytis донорного растения томата, где указанная селекция включает детекцию на 4, 6, 9, 11 и/или 12 хромосоме указанного реципиентного растения томата по меньшей мере одного генетического маркера, связанного с указанным по меньшей мере одним QTL для устойчивости к Botrytis;

- где на расположение указанного QTL на 4 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры CT50, C2At1g74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT1739 и P14M50-85h на 4 хромосоме S. habrochaites или на 4 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно на 4 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 4 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В предпочтительных вариантах осуществления на расположение указанного QTL на 6 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, Pl5M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e и P22M50-513h на 6 хромосоме S. habrochaites или на 6 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно на 6 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 6 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В других предпочтительных вариантах осуществления на расположение указанного QTL на 9 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TG10, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15M48-138h, P14M48-113h, Tm2a, P18M51-146h, Pl4M48-282h и P14M50-276h на 9 хромосоме S. habrochaites или на 9 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно на 9 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 9 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В других предпочтительных вариантах осуществления на расположение указанного QTL на 11 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h и P22M51-174e на 11 хромосоме S. habrochaites или на 11 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно на 11 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 11 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В других предпочтительных вариантах осуществления на расположение указанного QTL на 12 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры CT19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h, Pl4M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, P22M50-131h и P22M51-135h, предпочтительно геномная область, содержащая генетические маркеры P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296 и P22M50-131h на 12 хромосоме S. habrochaites или на 12 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно на 12 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 12 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

Перенос нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один QTL для устойчивости к Botrytis, или его придающую устойчивость к Botrytis часть, можно пригодным образом проводить скрещиванием указанного устойчивого к Botrytis донорного растения томата с восприимчивым к Botrytis реципиентным растением томата с получением растений-потомков.

Предпочтительный способ селекции, таким образом, включает селекцию на основе маркера (MAS) (см., например, Tanksley et al. 1998) указанной интрогрессивной ДНК, где в растениях-потомках проводят детекцию одного или нескольких маркеров, ассоциированных с указанным QTL. Например, MAS можно проводить выделением генетического материала из указанных растений-потомков и определением наличия в нем молекулярными технологиями одного или нескольких маркеров донорного растения. Альтернативно способы детекции молекулярных маркеров можно применять без предшествующего выделения генетического материала. Необязательно, в дополнение к детекции маркера в целях селекции пригодных растений можно проводить фенотипический тест устойчивости к Botrytis. Высокопригодным тестом, таким образом, является количественный биологический анализ, как описано в настоящем описании, при котором определяют такие параметры, как заболеваемость и/или скорость роста очагов повреждения. Подтверждение наличия по меньшей мере одного маркера из QTL для устойчивости к Botrytis в сочетании с установлением наличия устойчивого фенотипа обеспечивает доказательство успешного переноса нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один QTL, или его устойчивой к Botrytis части из донорного растения в реципиентное растение.

В альтернативном варианте осуществления способа получения устойчивого к Botrytis растения томата указанный перенос нуклеиновой кислоты можно пригодным образом проводить трансгенными способами (например, трансформацией), слиянием протопластов, способами двойных гаплоидов или спасением зародышей.

В предпочтительном варианте осуществления способа получения устойчивого к Botrytis растения томата донорные растения представляют собой Solanum habrochaites LYC 4/78, и нуклеиновая кислота, перенесенная из этих донорных растений в реципиентные растения, предпочтительно содержит по меньшей мере один QTL для устойчивости к Botrytis, выбранный из группы, состоящей из QTL на 4, 6, 9, 11 и/или 12 хромосомах Solanum habrochaites LYC 4/78, ассоциированных с устойчивостью к Botrytis, или их придающей устойчивость к Botrytis части.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа получения устойчивого к Botrytis растения томата способ включает скрещивание указанного устойчивого к Botrytis донорного растения томата с восприимчивым к Botrytis реципиентным растением томата с получением растений-потомков первого поколения; селекцию из растений-потоков первого поколения растения, которое содержит в его геноме нуклеиновую кислоту, подвергшуюся интрогрессии из указанного донорного растения томата, где указанная подвергшаяся интрогрессии нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один QTL, предпочтительно два, более предпочтительно более двух QTL для устойчивости к Botrytis в соответствии с этим изобретением, или их придающую устойчивость к Botrytis часть; скрещивание указанного выбранного растения-потомка с пригодной коммерческой линией томата с получением растений-потомков второго поколения; селекцию из растений-потомков второго поколения растения, которое содержит в его геноме нуклеиновую кислоту, подвергшуюся интрогрессии из указанного растения томата-потомка первого поколения, где указанная подвергшаяся интрогрессии нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один QTL, предпочтительно два, более предпочтительно более двух QTL для устойчивости к Botrytis в соответствии с этим изобретением, или их придающую устойчивость к Botrytis часть, и необязательно получение последующих поколений растений-потомков. Упомянутые два, более предпочтительно более двух QTL для устойчивости к Botrytis, которые подвергаются интрогрессии в растениях-потомках, могут представлять собой QTL для заболеваемости, QTL для скорости роста очагов повреждения или сочетание этих типов.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления стадия c) включает селекцию растения, которое содержит в своем геноме по меньшей мере 4 QTL для устойчивости к Botrytis, выбранных из группы, состоящей QTL на 1, 2, 4, 6, 9, 11 и 12 хромосоме Solanum habrochaites, предпочтительно линии LYC 4/78, ассоциированных с устойчивостью к Botrytis.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к устойчивому к Botrytis растению томата, или его части, получаемому способом по настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к QTL для устойчивости к Botrytis в томате, где указанный QTL выбран из группы, состоящей из QTL на 4, 6, 9, 11 и 12 хромосомах Solanum habrochaites, предпочтительно линии LYC 4/78, ассоциированных с устойчивостью к Botrytis. Эти QTL находятся в положениях генома, которые ранее не ассоциировали с устойчивостью к Botrytis. Характеристики этих QTL более подробно описаны в настоящем описании ниже.

Аллели, находящиеся в положениях генома, определяемых этими QTL, являются аспектом настоящего изобретения.

QTL по настоящему изобретению может находиться в форме выделенной, предпочтительно двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей указанный QTL или его придающую устойчивость часть. Является в значительной степени пригодным, чтобы размер последовательности нуклеиновой кислоты, которая, например, может быть выделена из хромосомы пригодного донорного растения, соответствовал генетическому расстоянию 1-100 сМ, предпочтительно, 10-50 сМ на указанной хромосоме. Указанная нуклеиновая кислота может содержать по меньшей мере 50, более предпочтительно по меньшей мере 500, более предпочтительно по меньшей мере 1000, более предпочтительно по меньшей мере 5000 пар оснований. Одна или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих QTL или его придающую устойчивость часть в соответствии с этим изобретением, может, в свою очередь, находиться в конструкции нуклеиновой кислоты, при этом указанная конструкция может далее содержать участки, которые фланкируют указанную одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, и эти участки могут встраиваться в пригодный вектор для переноса указанной одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот в пригодное восприимчивое к Botrytis реципиентное растение томата. Кроме того, вектор может содержать пригодные промоторные области или другие регуляторные последовательности. Также QTL могут находиться в форме, представленной в геноме растения томата. QTL по настоящему изобретению предпочтительно содержат по меньшей мере один маркер, предпочтительно, два, более предпочтительно, три, более предпочтительно, четыре, более предпочтительно, более четырех маркеров, ассоциированных с устойчивостью к Botrytis, выбранных из группы, состоящей из маркеров, представленных в таблицах 1-5, которые сцеплены с указанным QTL.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции QTL для устойчивости к Botrytis, включающему детекцию по меньшей мере одного маркера, сцепленного с QTL для устойчивости к Botrytis на 4, 6, 9, 11 и/или 12 хромосоме предполагаемого устойчивого к Botrytis растения томата, где на расположение указанного QTL на 4 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры CT50, C2At1g74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT1739 и P14M50-85h на 4 хромосоме S. habrochaites или на 4 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно, на 4 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 4 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В предпочтительном варианте осуществления способа детекции QTL по настоящему изобретению на расположение указанного QTL на 6 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры P22M50-188h, P14M48-521e, P15M48-386h, P18M51-199h, P18M51-103h, P22M50-103e, P18M51-388e, P15M48-395e, P22M50-124e, P14M48-160e и P22M50-513h на 6 хромосоме S. habrochaites или на 6 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно на 6 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 6 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа детекции QTL по настоящему изобретению на расположение указанного QTL на 9 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры P18M50-141, P14M49-240, TG254, TG223, TG10, P18M50-134h, P14M49-243h, P18M50-599, P14M60-222h, P22M51-417h, P14M50-174h, P14M60-157h, P14M60-107h, P15M48-138h, P14M48-113h, Tm2a, P18M51-146h, P14M48-282h и P14M50-276h на 9 хромосоме S. habrochaites или на 9 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно, на 9 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 9 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа детекции QTL по настоящему изобретению на расположение указанного QTL на 11 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры P14M60-215e, P14M61-173h, P14M50-307h, TG47, P14M50-29xCD, P18M51-358h, P18M50-27xCD, P18M51-136h, P22M50-488h, TG393, P14M61-396h, P22M51-235h и P22M51-174e на 11 хромосоме S. habrochaites или на 11 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно, на 11 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 11 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа детекции QTL по настоящему изобретению на расположение указанного QTL на 12 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры CT19, TG68, P14M48-411e, P18M50-244h, P18M50-273h, P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296, P22M50-131h и P22M51-135h, предпочтительно, геномная область, содержащая генетические маркеры P14M61-420h, P14M61-406h, P14M61-223h, P14M60-193h, P22M51-314h, TG565, P14M48-172h, P22M50-321e, P14M60-219e, P14M48-153h, P22M50-97h, TG296 и P22M50-131h на 12 хромосоме S. habrochaites или на 12 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно, на 12 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 12 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к устойчивому к Botrytis растению вида S. lycopersicum, или его части, содержащему в своем геноме по меньшей мере один QTL, или его придающую устойчивость к Botrytis часть, где указанный QTL выбран из группы, состоящей из QTL на 4, 6, 9, 11 и 12 хромосоме Solanum habrochaites, предпочтительно, линии LYC 4/78, ассоциированных с устойчивостью к Botrytis, где на расположение указанного QTL на 4 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры CT50, C2At1g74970, P14M49-283e, P14M48-74e, P14M50-67e, CT1739 и P14M50-85h на 4 хромосоме S. habrochaites или на 4 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно, на 4 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 4 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker, где указанный QTL или его придающая устойчивость к Botrytis часть находятся не в их природном генетическом окружении и где указанное растение дополнительно необязательно содержит один или несколько дополнительных QTL, или их придающую устойчивость к Botrytis часть, ассоциированных с устойчивостью к Botrytis, выбранных из QTL на 1, 2 и/или 4 хромосоме Solanum habrochaites, предпочтительно, Solanum habrochaites линии LYC 4/78, где на расположение указанного дополнительного QTL на 4 хромосоме указанного растения указывает геномная область, содержащая генетические маркеры P18M51-169.5e, P18M51-305.4h, P14M60-262.9e, P14M61-292.7h, TG609, P14M48-345e, P14M48-177e и P18M50-147e на 4 хромосоме S. habrochaites или на 4 хромосоме S. lycopersicum, более предпочтительно, на 4 хромосоме S. habrochaites LYC 4/78 или на 4 хромосоме S. lycopersicum cv. Moneymaker.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения устойчивого к Botrytis инбредного растения томата. Способ включает стадии получения устойчивого к Botrytis растения томата в соответствии со способом по этому изобретению, как описано выше, самоопыление указанного растения, выращивание полученного из указанного самоопыленного растения новых растений; идентификацию растений, которые проявляют устойчивость к Botrytis и обладают коммерчески желательными характеристиками в указанных новых растениях, и повторение стадий самоопыления и селекции с получением инбредного растения томата, которое проявляет устойчивость к Botrytis и обладает коммерчески желательными характеристиками.

Способ получения устойчивого к Botrytis инбредного растения томата, кроме того, может включать дополнительную стадию селекции гомозиготных инбредных растений томата, которые проявляют устойчивость к Botrytis и обладают коммерчески желательными характеристиками.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к устойчивому к Botrytis инбредному растению томата, или к его частям, получаемым способом по этому изобретению.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к гибридному растению томата, или к его частям, которое проявляет устойчивость к Botrytis, где указанное растение томата получают скрещиванием устойчивого к Botrytis инбредного растения томата, получаемого способом по этому изобретению, с инбредным растением томата, которое проявляет коммерчески желательные характеристики.

Кроме того, это изобретение относится к тканевой культуре регенерируемых клеток растений томата по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления такой тканевой культуры клетки или протопласты указанных клеток выделены из ткани, выбранной из группы, состоящей из листьев, пыльцы, зародышей, корней, кончиков корней, пыльников, цветков, плодов и стеблей и семян.

Кроме того, это изобретение относится к применению маркера, выбранного из группы, состоящей из маркеров, приведенных в таблицах 1-5, для детекции QTL для устойчивости к Botrytis в соответствии с этим изобретением и/или для детекции устойчивых к Botrytis растений томата.

Устойчивое к Botrytis донорное растение томата, используемое в способах по настоящему изобретению, предпочтительно выбрано из группы, состоящей из Lycopersicon cerasiforme, Lycopersicon cheesmanii, Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii, Lycopersicon Lycopersicum, Lycopersicon habrochaites, Lycopersicon parviflorum, Lycopersicon pennellii, Lycopersicon peruvianum, Lycopersicon pimpinellifolium и Solanum lycopersicoides, более предпочтительно, в качестве донорного растения используют изолят дикого томата. Высокопредпочтительными донорными растениями являются Solanum habrochaites, в частности Solanum habrochaites LYC 4/78.

Восприимчивое к Botrytis реципиентное растение томата, используемое в способах по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой растение вида Solanum lycopersicum, более предпочтительно культивар S. lycopersicum, который обладает коммерчески желательными характеристиками, или другую коммерческую линию томата.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлено положение локусов количественных признаков (QTL) для устойчивости к B. cinerea, источником которых является S. habrochaites LYC 4/78, с картами сцепления, соответствующими 4 хромосоме (предполагаемое положение QTL представлено в качестве темных сегментов). Положения на карте приведены в cM. Эти данные дают возможность предположительной идентификации двух отдельных QTL, один из которых сосредоточен в области маркера TG62 (см. пример 1) и идентифицирован в IL 4-1 в примере 4, и другой, отдельный от них, не включающий маркер TG62, но сосредоточенный в области маркера P14M49-283e и идентифицированный в IL 4-3 в примере 4. QTL, выявленные на 4 хромосоме, снижают как скорость роста очага повреждения, так и заболеваемость. Коды для маркеров AFLP более подробно описаны в таблице 1. Все маркеры, указанные в качестве ассоциированных с QTL на фигурах, иллюстрирующих настоящее изобретение, можно как по отдельности, так и в сочетании использовать в качестве маркеров в его аспектах.

На фиг.2 представлено положение локуса количественного признака (QTL) для устойчивости к B. cinerea, источником которых является S. habrochaites LYC 4/78, с картами сцепления, соответствующими 6 хромосоме (предполагаемое положение QTL представлено в качестве темного сегмента). QTL на 6 хромосоме снижает как скорость роста очага повреждения, так и заболеваемость.

На фиг.3 представлено положение локуса количественного признака (QTL) для устойчивости к B. cinerea, источником которого является S. habrochaites LYC 4/78, с картами сцепления, соответствующими 9 хромосоме (предполагаемое положение QTL представлено в качестве темного сегмента). QTL на 9 хромосоме снижает как скорость роста очага повреждения, так и заболеваемость. Кроме того, на фигуре представлена интрогрессия на 9 хромосоме линий IL 11-2 и 12-3.

На фиг.4 представлено положение локуса количественного признака (QTL) для устойчивости к B. cinerea, источником которого является S. habrochaites LYC 4/78, с картами сцепления, соответствующими 11 хромосоме (предполагаемое положение QTL представлено в качестве темного сегмента). QTL на 11 хромосоме снижает как скорость роста очага повреждения, так и заболеваемость. Карта сцепления соответствует линии IL 11-2 примера 4.

На фиг.5 представлено положение локусов количественных признаков (QTL) для устойчивости к B. cinerea, источником которых является S. habrochaites LYC 4/78, с картами сцепления, соответствующими 12 хромосоме (предполагаемое положение QTL представлено в качестве темного сегмента). QTL на 12 хромосоме снижают как скорость роста очага повреждения, так и заболеваемость.

На фиг.6 представлена стратегия возвратного скрещивания и селекции, используемая для получения популяции IL S. habrochaites LYC 4/78, подвергнутой интрогрессии в генетическом фоне S. lycopersicum cv. Moneymaker, описанная в примере 4.

На фиг.7 графически представлен генотип популяции интрогрессивной линии S. lycopersicum cv. Moneymaker x S. habrochaites LYC 4/78, используемой в примере 4. Все хромосомы изображены в масштабе сегментов размером 20 сМ в соответствии с генетической картой сцепления F₂. К концам 3, 4, 5 и 9 хромосом были добавлены некоторые участки (маркеры CAPS). Гомозиготные интрогрессии из S. habrochaites показаны черным цветом, в то время как гетерозиготные интрогрессии обозначены с использованием диагонального паттерна (серый).

На фиг.8 представлено положение локусов количественных признаков (QTL) для устойчивости к B. cinerea, источником которых является S. habrochaites LYC 4/78, с картами сцепления, соответствующими 1, 2 и 4 хромосомам, и указаны QTL, представленные в этой заявке как QTL-1h, QTL-2h и QTL-4hA.

Подробное описание изобретения

Определения

В рамках изобретения термин "Botrytis" означает Botrytiscinerea, также известный как серая гниль или серая пятнистость, заболевание, часто встречающееся в стебле, листьях и плодах томатов. Главным образом считается, что патогенный гриб растения Sclerotinia sclerotiorum обладает механизмом инфицирования, сходным с механизмом B. cinerea (Prins et al., 2000). Несмотря на то что инфекция S. sclerotiorum в томатах экономически значительно менее значима, чем инфекция B. cinerea, оба гриба секретируют спектр протеаз, ферменты деградации клеточной стенки, токсины, а также щавелевую кислоту. Известно, что некоторые из этих факторов участвуют в стратегии инфицирования обоих грибов. В результате считается, что механизмы и гены, которые придают устойчивость к Botrytis, являются равно эффективными в отношении обеспечения устойчивости к инфекции S. sclerotiorum. Таким образом, когда в настоящем описании упоминается "устойчивость к Botrytis", следует понимать, что такая устойчивость включает устойчивость к любому грибу семейства Sclerotiniaceae, предпочтительно устойчивость к S. sclerotiorum и B. cinerea, более предпочтительно устойчивость к B. cinerea.

В рамках изобретения термин "аллель(и)" означает любую одну или несколько альтернативных форм гена, при этом все из аллелей связаны по меньшей мере с одним признаком или характеристикой. В диплоидной клетке или организме два аллеля данного гена занимают соответствующие локусы на паре гомологичных хромосом. Поскольку настоящее изобретение относится к QTL, т.е. к геномным областям, которые могут содержать один или несколько генов, а также регуляторные последовательности, их в некоторых случаях более точно относить к "гаплотипу" (т.е. аллелю сегмента хромосомы) вместо "аллеля", однако следует понимать, что в этих случаях термин "аллель" включает термин "гаплотип".

"Ген" определяют в настоящем описании как единицу наследования, состоящую из последовательности ДНК, которая занимает конкретное положение на хромосоме и которая содержит генетическую инструкцию для конкретных характеристик или признака в организме.

"Локус" определяют в настоящем описании как положение, которое занимает данный ген на хромосоме данного вида.

В рамках изобретения термин "гетерозиготный" означает генетическое состояние, существующее, когда на соответствующих локусах гомологичных хромосом расположены различные аллели.

В рамках изобретения термин "гомозиготный" означает генетическое состояние, существующее, когда в соответствующих локусах на гомологичных хромосомах расположены идентичные аллели.

В рамках изобретения термин "гибрид" означает потомка скрещивания между двумя генетически отличающимися индивидами, включая, но не ограничиваясь ими, скрещивание между двумя инбредными линиями.

В рамках изобретения термин "инбредный" означает по существу гомозиготный индивид или линию.

В этой заявке "процесс рекомбинации" понимают как мейотический кроссинговер.

В рамках изобретения термины "интрогрессия", "подвергшийся интрогрессии" и "подвергающийся интрогрессии" относятся к как природному, так и к искусственному процессу, при котором гены одного вида, сорта или культивара перемещаются в геном другого вида, сорта или культивара посредством скрещивания этих видов. Процесс необязательно может быть осуществлен посредством возвратного скрещивания с рекуррентной родительской формой.

Термины "генетическая инженерия", "трансформация" и "генетическая модификация" используют в настоящем описании в качестве синонимов для переноса выделенных и клонированных генов в ДНК, как правило, в хромосомную ДНК или геном другого организма.

В рамках изобретения термин "молекулярный маркер" относится к индикатору, который используют в способах визуализации различий характеристик последовательностей нуклеиновых кислот. Примерами таких индикаторов являются маркеры полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP), маркеры полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP), однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), микросателлитные маркеры (например, SSR), маркеры амплифицированного участка с охарактеризованной последовательностью (SCAR), маркеры расщепленной амплифицированной полиморфной последовательности (CAPS) или маркеры изозимов, или сочетания маркеров, описанных в настоящем описании, которые определяют конкретное генетическое и хромосомное положение.

Термины "устойчивый" и "устойчивость" охватывают как частичную, так и полную устойчивость к инфекции. Восприимчивое к Botrytis растение томата либо может быть неустойчивым, либо оно может иметь низкие уровни устойчивости к инфекции Botrytis.

В рамках изобретения термин "часть растения" указывает на часть растения томата, включая отдельные клетки и ткани из клеток, такие как клетки растений, которые являются интактными в растениях, клеточные массы и культуры тканей, из которых можно регенерировать растения томата. Примеры частей растений включают, но не ограничиваются ими, отдельные клетки и ткани из пыльцы, семяпочки, листьев, зародышей, корней, концов корней, пыльников, цветков, плодов, побегов стеблей и се