Средство для лечения воспалительных заболеваний глаз человека и животных, для стимуляции репаративных процессов и эпителизации

Средство для лечения воспалительных заболеваний глаз человека и животных, для стимуляции репаративных процессов и эпителизации

Реферат

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины, а именно к созданию офтальмологических средств, и может быть использовано для лечения заболеваний и повреждений роговицы.

Известен состав для лечения ожогов роговицы, содержащий фермент - фибринолизин 30000 ед., вазелин 2,5 г, ланолин - 5,0 г. (Ф.Колущинская и др. Фибринолизин в комплексном лечении ожогов глаз. - Вест. офтальмол., 1977, №3, с.42-45). Состав представляет собой мазь светло-желтого цвета, которую больным закладывали в конъюнктивальный мешок 4-6 раз в день. Почти у всех больных уменьшался отек и инфильтрация роговицы, наступала эпителизация. Однако у части больных отмечалось увеличение эрозии роговицы и неполное очищение от нежизнеспособных тканей стромы.

Известны глазные капли «Баларпан», содержащие сульфатированные гликозаминогликаны, хлорид натрия, одно- и двузамещенные соли натрия и воду, обладающие специфическим действием на репаративные процессы в роговице (патент РФ №2128975 от 1999).

Недостатком этих глазных капель является слабо выраженное антивоспалительное действие.

Известны глазные капли, включающие сульфатированные гликозаминогликаны и физиологический раствор солей натрия, и дополнительно могут содержать тобрамицин (патент РФ №2171107 от 2001).

Недостатком данных капель является узкий спектр терапевтического действия.

Наиболее близким техническим решением являются глазные капли, содержащие водорастворимую смесь гликозоаминогликанов, выделенных из роговицы глаз крупного рогатого скота, в которых гликозоаминогликаны взяты в количестве 0,1-1,0 мас.%, остальное - физиологический раствор (патент РФ №2062079 от 1996).

Недостатком данных капель является то, что они не оказывают достаточного специфического действия на репаративные процессы в роговице, поскольку в их составе раздельно отсутствуют специфические биологические стимуляторы, а также, по-видимому, потому, что они содержат смесь разных гликозаминогликанов, взятых в неэффективном количестве, а не дозированное предлагаемое сочетание натриевой соли кератансульфата, а также натриевой соли хондроитинсульфата.

Задачей настоящего изобретения является создание многофункционального средства для лечения заболеваний и повреждений роговицы.

Техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение сроков лечения при воспалительных заболеваниях глаза и при травматических повреждениях его за счет выраженного антиэкссудативного действия и более раннего наступления стимуляции репаративных и обменных процессов и снижения тем самым количества осложнений.

Поставленная задача решена созданием глазных капель для лечения воспалительных заболеваний глаз человека и животных, для стимуляции репаративных процессов и эпителизации.

Глазные капли содержат пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, полученные из печени тресковых, лубрикант, буфер, консервант, изотонирующий агент натрия хлорид и воду для инъекций при следующем соотношении ингредиентов в мас.%:

пептиды, ассоциированные с фосфолипидами,
полученные из печени тресковых	0,01-5,0
лубрикант	0,1-5,0
буфер	0,1-5,0
консервант	0,01-0,3
изотонирующий агент натрия хлорид	0,1-0,9
вода для инъекций	остальное до 100,

при условии, что пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, используют при соотношении пептидной и фосфолипидной фракции в масс.%: 40-99 пептидов и 1-60 фосфолипидов.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученных из печени тресковых, которые являются селективными ингибиторами циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) и 5-липооксигеназы (5-ЛОГ).

Комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, получают из печени тресковых рыб. Для этого печень замороженной трески измельчают электромясорубкой, на волчке и т.п. до получения гомогенного сырья. Добавляют воду и растительное масло, например подсолнечное, кукурузное, льняное, соевое, экстрагируют сырье при комнатной температуре 10-15 минут, фильтруют. Полученную эмульсию сепарируют. К водной фазе добавляют спирт этиловый для осаждения белков и выдерживают при 0-(-5°)С в течение 18-24 часов до полного осаждения пептидов, фильтруют и лиофилизируют смесь. Анализ целевого продукта проводили методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией. В продукте пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, полученные из печени тресковых, содержатся при соотношении: 40-99 мас.% и фосфолипиды 1-60 мас.%.

Фосфолипиды представлены преимущественно фосфатидилхолином. Пептидная фракция представлена комплексом полипептидов различной молекулярной массы (до 25 кДа). Состав пептидов может изменяться в зависимости от конкретного вида рыб, состояния используемого сырья, не оказывая при этом значимого влияния на целевую фармакологическую активность. Заявленные свойства продукт проявляет при указанном соотношении пептидной и фосфолипидной фракций. Выделение из продукта отдельных пептидных фракций или отдельных полипептидов с последующим определением их фармакологической активности свидетельствовало об уменьшении выраженности эффектов и недостижении заявленного в настоящем изобретении суммарного противовоспалительного, противоаллергического и ранозаживляющего действия.

В качестве противовоспалительного средства пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, полученные из печени тресковых, используют для профилактики и лечения различных заболеваний, включая воспалительные и аллергические острые и хронические процессы различной этиологии.

Лубрикант выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, водорастворимых производных целлюлозы - метилцеллюлозы или натрия карбоксиметилцеллюлозы, полиакриламида, полиглюкина, пропиленгликоля, полиэтиленгликоля гидроксистеарата, полиэтиленгликоля глицерилгидроксистеарата или их смеси. Лубриканты защищают слизистую оболочку от появления микротрещин и раздражения, через которые проникают инфекции, снимают болевые ощущения и повышают комфорт.

Буфер выбран из группы, состоящей из фосфатного, нитратного, ацетатного, боратного буфера. Буфер стабилизирует глазные капли и способствует комфортному ощущению при закапывании в глаза.

Консервант выбран из группы, состоящей из нипагина, нипазола, цетримида, бензилового спирта, натрия бензоата, натрия сорбата, калия сорбата.

Глазные капли могут дополнительно содержать антиоксидант в количестве 0,01-0,5 мас.%, выбранный из группы, состоящей из натрия метабисульфита, натрия сульфита, натрия тиосульфата или трилона Б.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Глазные капли (состав в мас.%).

Пептиды, ассоциированные с фосфолипидами - 0,1

Полиэтиленгликоль 660 гидроксистеарат (Solutol) - 2,0

Натрия гидрофосфат - 1,5

Калия дигидрофосфат - 0,1

Натрия метабисульфит - 0,05

Нипагин - 0,1

Изотонирующий агент натрия хлорид - 0,2

Вода для инъекций - до 100,0

Способ получения активного начала:

50 кг замороженной печени трески (Gadus morrhua L.) измельчают электромясорубкой, добавляют в фарш 10 л воды, перемешивают и затем приливают 10 л масла растительного, экстрагируют в реакторе при комнатной температуре 15 минут. По окончании экстракции массу выдерживают 5 минут и далее фильтруют через капроновую сетку. Полученную эмульсию разделяют сепарированием. К водному раствору прибавляют спирт этиловый в соотношении 1:2,6, выдерживают при температуре 0-6°С в течение 20-24 ч до полного осаждения белков, фильтруют и лиофилизируют. Выход целевого продукта составляет 18 г на 1 кг исходного сырья.

Выделенный комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, используемый в данном изобретении, содержит 15,3% фосфолипидов в пересчете на фосфатидилхолин и 84,7% полипептидов, содержащих преимущественно основные пептидные фракции приблизительной массой 6,5 кДа и 17 кДа в приблизительно равных количествах. Получаемый продукт не содержит высокомолекулярных белковых контаминаций (отрицательная реакция на белок с раствором трифторуксусной кислоты).

Пример 2

Глазные капли (состав в мас.%).

Пептиды, ассоциированные с фосфолипидами - 0,1

Натрия карбоксиметилцеллюлоза - 2,0

Боратный буфер- 0,1

Цетримид - 0,01

Изотонирующий агент натрия хлорид - 0,6

Вода для инъекций - до 100,0

Способ получения активного начала:

10 кг замороженной печени путассу (Micromesistius G.) измельчают на волчке, добавляют в фарш 4,5 л воды и 6 л масла кукурузного и экстрагируют в реакторе при комнатной температуре 20 минут. По окончании экстракции массу выдерживают 10 минут и далее фильтруют через капроновую сетку и фильтрокартон. Полученную эмульсию разделяют. К водному раствору прибавляют спирт этиловый в соотношении 1:4,6, выдерживают при температуре 5-10°С в течение 20-24 ч до полного осаждения белков, фильтруют и высушивают. Выход целевого продукта составляет 21 г на 1 кг исходного сырья.

Выделенный комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, используемый в данном изобретении, содержит 60,0% фосфолипидов в пересчете на фосфатидилхолин и 40,0% полипептидов, содержащих преимущественно основные пептидные фракции приблизительной массой 11,5 кДа и 24,9 кДа. Получаемый продукт не содержит высокомолекулярных белковых контаминаций (отрицательная реакция на белок с раствором трифторуксусной кислоты).

Экспериментальные исследования показали:

Пример 3. Оценка раздражающего действия in ovo.

Раздражающее действие оценивали с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона (ХЕТ-КАМ тест) в соответствии с Методическими указаниями по оценке раздражающего действия фармакологических веществ (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва. 2000. - С.87-89).

Для исследования использовали развивающиеся эмбрионы яиц домашних кур породы "Хайсекс браун" в возрасте 10 дней. Яйца выдерживали в инкубаторе при температуре 37,8°С и относительной влажности 62,5%. Перед опытом инкубированные яйца выдерживали в течение 24 часов в стационарном положении тупым концом вверх, за сутки до опыта их переносили из инкубатора в термостат (37,8°С). На подготовленную хориоаллантоисную оболочку наносили по 0,3 мл исследуемого раствора. Наблюдение за состоянием оболочки под каплей осуществляли в течение 100 секунд через бинокулярный стереоскопический микроскоп (Лабостеми-4 зум). Регистрация производилась каждые 10 секунд фотографированием оболочки под каплей с помощью специализированной цветной телевизионной камеры (Зенит ТВК-МИ-01С), соединенной с бинокулярным микроскопом.

В качестве критерия раздражающего действия использовали показатель воздействия на хориоаллантоисную оболочку в течение 100 секунд.

Классификация веществ по степени вызванного раздражения приведена в таблице 1.

Таблица 1
Класс	Наблюдаемая картина
5-й класс, очень сильная	Коагуляция и лизис сосудов мелких и средних, множественные кровоизлияния и тромбоз с остановкой кровотока.
4-й класс, сильная	Тромбоз в мелких сосудах с остановкой кровотока и мелкие точечные кровоизлияния по всей обработанной поверхности. Гиперемия.
3-й класс, умеренная	Покраснение оболочки, замедление тока крови и тромбоз в отдельных капиллярах.
2-й класс, слабая	Сужение сосудов без остановки или с временной остановкой кровообращения в отдельных капиллярах.
1-й класс, отсутствие воздействия	Не нарушенная прозрачная тонкая оболочка с нормально функционирующей сетью кровеносных сосудов и капилляров.

Результаты исследования по определению степени раздражения хориоаллантоисной оболочки (М±m) приведены в таблице 2.

Таблица 2
Образец	Среднее значение наблюдаемой степени раздражения по 10 временным точкам М±m, n=15
Глазные капли по примеру 2	1,24±0,03
Глазные капли по примеру 1	1,20±0,05

Исходя из данных, полученных в ходе эксперимента на хориоаллантоисной оболочке, можно сделать вывод о том, что глазные капли, содержащие комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученный из печени тресковых, не оказали выраженного влияния на целостность сосудов разного диаметра и их тонус. Согласно классификации веществ по степени раздражения исследуемый образец относится к классу 1, что позволяет сделать вывод о том, что глазные капли, содержащие комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученный из печени тресковых, не относятся к раздражающим веществам.

Пример 4. Изучение влияния глазных капель на эпителизацию.

Оценивали влияние глазных капель, приготовленных по примеру 1 и примеру 2, на эпителизацию раны глаза кролика.

Кроликам (5 животных) произведены непроникающие ранения роговицы правых и левых глаз. Через 1 сутки наблюдалась умеренная смешанная инъекция сосудов, отек роговицы, частичная эпителизация раневой поверхности, края раны разомкнуты, незначительный фибринозный экссудат в передней камере в области зрачка. Радужная оболочка гиперимирована. Спустя 1 сутки после вмешательства в конъюнктивальную полость правых глаз животных 5 раз в день проводились инстилляции приготовленных в соответствии с примерами 1 или 2 глазных капель. В левый глаз кроликов проводились инстилляции раствора сравнения, содержащего вспомогательные вещества в указанных в примере 1 (или 2) соотношениях и не содержащего активного вещества (комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученный из печени тресковых).

Через 2 суток после вмешательства: правый глаз спокойный, отек роговицы не определяется, большая часть зоны ранения покрыта эпителием, края формирующегося рубчика сомкнуты, роговица в этой зоне непрозрачна. Экссудат в передней камере отсутствует, радужная оболочка без особенностей. Через 3 суток зона ранения полностью покрыта эпителием. Через 9 дней прозрачность роговицы восстановилась полностью. Спустя три недели при гистологическом и электронно-микроскопическом исследовании изменений в структуре роговицы не обнаружено. Эпителизация раны левых глаз испытуемых животных происходила медленнее: инъекция сосудов и экссудат в передней камере сохранялись до 4 дня после вмешательства. Полное покрытие эпителием отмечено на 5 сутки после вмешательства, прозрачность роговицы практически полностью восстановилась через 14 дней.

Были проведены клинические испытания.

Пример 5. Применение средства на основе пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, для лечения воспалительных офтальмологических заболеваний у человека.

Пациент-доброволец, студент, возраст 26 лет. Более 1 месяца жалобы на зуд в глазах при и после ношения контактных линз, быструю утомляемость глаз при чтении и работе с компьютером. Объективно: глаз раздражен, покраснение, инъекция сосудов, роговица отечная, скудное отделяемое. Диагноз - конъюнктивит. Для лечения были назначены глазные капли, приготовленные по примеру 1, в конъюнктивальную полость по 1-2 капли 4 раза в день в течение 7 суток в оба глаза. После лечения: жалоб не предъявляет, глаза спокойные, конъюнктива розовая, роговица прозрачная.

Таким образом, глазные капли, содержащие комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученный из печени тресковых, ускоряли репаративные процессы поврежденных тканей глаза, способствуя эпителизации и восстановлению функций, оказывали противовоспалительное действие.

1. Средство, проявляющее противовоспалительное, стимулирующее репаративные процессы и эпителизацию действие, для лечения заболеваний и повреждений роговицы, характеризующееся тем, что оно выполнено в виде глазных капель и содержит пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, полученные из печени тресковых, лубрикант, буфер, консервант, изотонирующий агент натрия хлорид и воду для инъекций при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

пептиды, ассоциированные с фосфолипидами,
полученные из печени тресковых	0,01-5,0
лубрикант	0,1-5,0
буфер	0,1-5,0
консервант	0,01-0,3
изотонирующий агент натрия хлорид	0,1-0,9
вода для инъекций	остальное до 100,

при условии, что пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, используют при соотношении пептидной и фосфолипидной фракции, мас.%: 40-99 пептидов и 1-60 фосфолипидов.

2. Средство по п.1, где лубрикант выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, водорастворимых производных целлюлозы - метилцеллюлозы или натрия карбоксиметилцеллюлозы, полиакриламида, полиглюкина, пропиленгликоля, полиэтиленгликоля гидроксистеарата, полиэтиленгликоля глицерилгидроксистеарата или их смеси.

3. Средство по п.1, где буфер выбран из группы, состоящей из фосфатного, цитратного, ацетатного, боратного буфера.

4. Средство по п.1, где консервант выбран из группы, состоящей из нипагина, нипазола, цетримида, бензилового спирта, натрия бензоата, натрия сорбата, калия сорбата.

5. Средство по п.1 дополнительно содержит антиоксидант в количестве 0,01-0,5 мас.%.

6. Средство по п.5, где антиоксидант выбран из группы, состоящей из натрия метабисульфита, натрия сульфита, натрия тиосульфата или трилона Б.