Интерферониндуцирующее средство для лечения острых респираторных вирусных инфекций (орви)

Интерферониндуцирующее средство для лечения острых респираторных вирусных инфекций (орви)

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и созданию лекарственных средств, обладающих интерфероногенным действием, и может быть использовано для лечения острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ).

ОРВИ является самым распространенным инфекционным заболеванием в развитых странах. Взрослый болеет ОРВИ не реже 2-3 раз в год, в дошкольном возрасте дети болеют ОРВИ 6-12 раз в год (Г.З.Пискунов, С.З. Пискунов, Клиническая ринология, М., 2006, стр.181). В России на ОРВИ, включая грипп, ежегодно приходится до 90% от всей регистрируемой инфекционной заболеваемости. По данным Минздравсоцразвития РФ в 2004 г. экономические потери от этой группы заболеваний составили 86% от всего ущерба, наносимого инфекционными болезнями. ОРВИ вызывается большим числом возбудителей, среди которых не менее 7 различных групп вирусов. Наиболее частыми возбудителями ОРВИ является вирус гриппа, парагриппа, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус, риновирусы, реовирусы, пикорнавирусы. Против большинства возбудителей ОРВИ в настоящее время не разработаны химиопрепараты. Большое количество вирусных агентов, вызывающих ОРВИ, и достаточно высокая к ним восприимчивость способствуют возникновению смешанной инфекции. Поскольку дифференциальная диагностика вирусной инфекции хотя и возможна, но затруднена, для лечения ОРВИ рекомендуют использовать в первые часы заболевания препараты интерферона, которые эффективны в отношении всех вирусов-возбудителей ОРВИ, не зависимо от вида. Профилактическая эффективность интраназального применения интерферона достаточно убедительно доказана и подтверждена результатами мета-анализа (Jefferson Т.О., Tyrrell D., Antivirals for the common cold. The Cochrane Database of Systematic Reviews, 2005, Issue 3. Available at: http://www.cochrane.org/reviews/en/pkl67000032810144047.html). Однако применение экзогенного интерферона с лечебной целью имеет низкую эффективность действия, возможно, вследствие низкой его концентрации в растворе (Г.З.Пискунов, С.З.Пискунов, Клиническая ринология, М., 2006, стр.218). Поскольку в патогенезе ОРВИ самым важным звеном являются изменения в месте входных ворот инфекции (слизистая оболочка носа), то вполне оправдано местное интраназальное применение препарата. Недостатком интраназально вводимых препаратов человеческого лейкоцитарного интерферона является высокая частота нежелательных реакции: кровянистые выделения из носа, гриппоподобные симптомы, сонливость, аллергические реакции и другие. Перспективным направлением в терапии больных гриппом является использование препаратов, которые стимулируют продукцию собственных эндогенных интерферонов, т.е. индукторов интерферонов. Применение индукторов интерферонов не требует многократного введения, они не обладают антигенностью, у них отсутствуют побочные эффекты, свойственные препаратам интерферонов (В.П.Малый, М.Г.Романцов, Ю.В.Сологуб, Грипп, Пособие для врачей, с.61, Санкт-Петербург-Харьков, 2007 г.). Кроме того, с помощью индукторов интерферонов можно добиться стимулирования образования собственных интерферонов в организме человека в таких концентрациях, которые обладают высокой противовирусной активностью.

Авторами настоящего изобретения установлено, что соединение гидрохлорид 5-гидрокси-4-диметиламинометил-1-циклогексил-2-метил-3-этилоксикарбонилиндол (далее препарат) обладает противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А. Указанный препарат имеет следующую структуру:

Целью настоящего изобретения является расширение применимости препарата путем распространения его противовирусного действия на другие вирусы - возбудители ОРВИ. Поставленная цель достигается тем, что обнаруженная у препарата способность индуцировать интерфероны ά и β, позволяет его использовать для лечения ОРВИ не зависимо от вируса, вызвавшего данное заболевание. При этом имея в виду, что вирус гриппа является наиболее частой причиной ОРВИ, в большинстве случаев заболевания препарат будет оказывать двойное лечебное действие: как химиотерапевтический препарат и как индуктор интерферона. В тех случаях, когда причиной ОРВИ будут другие вирусы, лечебный эффект будет достигаться за счет эндогеннообразующегося интерферона.

Для доказательства интерферониндуцирующей активности препарата были проведены эксперименты по определению уровней γ-, ά- и β-интерферонов в крови мышей, которым вводили препарат в двух дозах. В качестве препарата сравнения был использован арбидол, который, как было установлено ранее, обладает противовирусной и интерферониндуцирующей активностью (патент №2033157. Опубликовано 20.04.1995. «Средство, обладающее интерферониндуцирующей и иммуномодулирующей (иммуностимулирующей) активностью»). Определение различных типов интерферонов проведено с помощью метода ИФА.

Пример 1. Определение γ-интерферона

Все эксперименты в данном исследовании выполнены на мышах-самцах F₁(CBAxC57BL)6 массой 22-24 г. Животные были разделены на 13 групп (12 опытных и 1 контрольную). В качестве контроля использованы интактные мыши. Препаратом сравнения служил арбидол. Препарат изучали в двух дозах (90 и 180 мг/кг). На каждую точку наблюдения использовано по 10 мышей. Препараты, приготовленные на 1%-ном крахмальном геле, вводили однократно по 0,2 мл, внутрижелудочно. Уровень γ-интерферона в сыворотке крови изучали в сроки через 16, 24 и 48 ч после введения препаратов. Кровь забирали под нембуталовым наркозом (60 мг/кг) из сердца, полученные образцы крови оставляли на 2 ч при комнатной температуре для свертывания. Сыворотку крови отделяли центрифугированием, замораживали и хранили при -20°С вплоть до проведения иммуноферментной реакции. Для определения концентрации интерферона использован коммерческий набор реагентов производства фирмы «R&D» Иммуноферментную реакцию проводили в пулированной сыворотке (две мыши/пул). Разведенный стандарт и испытуемые образцы вносили на планшеты в дубликатах. Оценка содержания γ-интерферона проводилась в соответствии с инструкцией фирмы-производителя набора. Использованный набор ИФА имел предел чувствительности 2 пг/мл.

Показатели концентрации интерферона в сыворотке крови анализировали статистически: рассчитывали М±m. Различия между сравниваемыми группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Как показало проведенное исследование, препарат не обладает γ-интерферониндуцирующей активностью. Незначительные концентрации γ-интерферона, близкие к уровню минимально выявляемой концентрации, в данной тест-системе зафиксированы во все сроки исследования в тестируемых образцах сывороток от животных, получавших препарат в двух дозах (Табл. 1, 2). Статистически значимых различий по концентрации γ-интерферона в этих группах не выявлено. Во всех остальных обследованных образцах сывороток (с введением препарата сравнения арбидола и группы биоконтроля) уровень γ-интерферона был ниже возможности их выявления. Концентрация γ-интерферона оставалась ниже предала чувствительности используемого набора ИФА (Табл. 3, 4).

Табл.1
Концентрация γ-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 90 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
1,46±0,198	1,24±0,211	1,07±0,179

Табл.2
Концентрация γ-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 180 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
1,94±0,261	1,66±0,146	1,84±0,336

Табл.3
Концентрация γ-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 90 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
0,352	1,346	0

Табл.4
Концентрация γ-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 180 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
0	0	0

В сыворотках интактных мышей γ-интерферон не определяется.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что препарат обладает крайне низкой γ-интерферониндуцирующей способностью. Препарат сравнения арбидол также не является индуктором γ-интерферона.

Пример 2. Определение ά-интерферона. Условия эксперимента описаны в примере 1.

Результаты исследования ά-интерферона в сыворотке мышей, получавших препарат

Результаты определения ά-интерферона в сыворотках мышей после введения им препарата и Арбидола в различные сроки после введения препарата приведены в Таблицах 5-8.

Как показало проведенное исследование, препарат индуцирует образование ά-интерферона в количествах, сопоставимых с продукцией ά-интерферона препаратом сравнения Арбидолом.

Табл.5
Концентрация ά-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 90 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
35,13±3,01	41,52±2,89	17,86±1,45

Табл.6
Концентрация ά-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 180 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
36,39±2,79	41,88±2,74	24,45±2,03

Табл.7
Концентрация ά-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 90 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, M±m
38,41±2,87	45,54±3,25	26,13±2,44

Табл.8
Концентрация ά-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 180 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
39,21±3,20	47,14±3,71	21,13±2,11

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что препарат, введенный per os, индуцирует образование ά-интерферона в организме мышей. Эффект характеризуется некоторой дозной зависимостью.

Пример 3. Определение β-интерферона. Условия эксперимента описаны в примере 1.

Результаты исследования β-интерферона в сыворотках мышей, получавших препарат

Как свидетельствуют результаты, представленные в Табл.9-12, препарат является эффективным индуктором β-интерферона, который по своей интерферониндуцирующей активности сопоставим с активностью препарата сравнения Арбидолом.

Табл.9
Концентрация β-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 90 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
28,25±2,54	40,60±2,52	16,89±0,98

Табл.10
Концентрация β-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата в дозе 180 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
20,91±2,77	33,05±3,59	5,65±1,23

Taбл.11
Концентрация β-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 90 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m	Кол-во, пг/мл, М±m
27,75±2,70	44,82±3,02	18,31±2,12

Табл.12
Концентрация β-интерферона в сыворотке крови мышей в различные сроки после введения противовирусного препарата арбидола в дозе 180 мг/кг
ЧЕРЕЗ
16 час	24 час	48 час
Кол-во	Кол-во	Кол-во
пг/мл	пг/мл	пг/мл
М±m	М±m	М±m
0	0	0

Табл.13
Противовирусная активность арбидола и заявляемого препарата в культуре клеток Нер-2 в отношении респираторно-синцитиального вируса штамма Long
Концентрация, мкг/мл	Процент защиты (%) клеток от вирусной инфекции
арбидол	заявляемый препарат
5	66	0,48
7,5	100	0,94
10	100	100
20	Токсическое действие на клетки	100

Таким образом, результаты представленных экспериментов свидетельствуют о том, что препарат не индуцирует образование γ-интерферона, но является эффективным индуктором ά- и β-интерферонов. По интерферониндуцирующей способности препарат не уступает препарату сравнения Арбидолу.

Средство, индуцирующее альфа и бета интерферон, для лечения острых респираторных вирусных инфекций, представляющее собой гидрохлорид 5-гидрокси-4-диметиламинометил-1-циклогексил-2-метил-3-этилоксикарбонилиндол следующей структурной формулы: