Лекарственный препарат для лечения геморрагического и ишемического инсульта и способ его получения

Лекарственный препарат для лечения геморрагического и ишемического инсульта и способ его получения

Реферат

Изобретение относится к области фармакологии и неврологии и может быть использовано для получения препарата для лечения геморрагического и ишемического инсульта.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является средство для лечения инсульта «Церебрал» (патент РФ №2151605 от 27 июня 2000 г.). Данное средство получают из ткани мозга свиней, которым предварительно моделируют двусторонний геморрагический инсульт.

Церебрал является аминокислотно-пептидным комплексом, особенность которого определяет его специфичность и активность. Он содержит специфические травмотрофические пептиды с молекулярным весом 400-1500 Да; из аминокислот доминирующими являются аспарагиновая, глутаминовая, аланин, гилцин и серин.

Высокая активность церебрала позволяет вводить его как капли в нос, что очень удобно и способствует достижению быстрого лечебного эффекта, поскольку препарат попадает в мозг, обходя гематоэнцефалический барьер.

Однако недостатком данного препарата является его низкая эффективность при лечении ишемического инсульта (Макаренко А.Н. и др., Патогенез, 2011. - №1).

Наиболее близким к заявленному способу является способ получения средства «Церебрал» (патент РФ №2151605 от 27 июня 2000 г.).

В способе-прототипе в качестве исходного сырья используется ткань мозга свиней, которым предварительно моделируют двусторонний геморрагический инсульт. Ткань мозга подвергают дроблению, гомогенизации, после чего полученный гомогенат подвергают дальнейшей обработке, основной стадией которой является получение экстракта, который лиофилизируют.

Известный способ позволяет получать средство для лечения инсульта, характеристика которого упомянута выше.

Однако недостатком способа является то, что в результате его реализации получается средство, которое оказывается не достаточно эффективным при лечении ишемического инсульта. Следует отметить, что по частоте встречаемости ишемический инсульт составляет 70-80% всех инсультов, а геморрагический лишь 20-30%.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание средства для лечения инсульта, которое не уступает по эффективности церебралу при лечении геморрагического инсульта, но в то же время превосходит известные аналоги при лечении и ишемического инсульта.

Этот результат достигается путем реализации существенных признаков предлагаемого изобретения, а именно тем, что заявляемый препарат получают из ткани мозга животных (свиней), которым моделируют геморрагический полушарный инсульт через некоторое время после окклюзии общей сонной артерии на этой же стороне (ишемического инсульта). Данный препарат представляет собой аминокислотно-пептидный комплекс, особенности которого определяют его специфичность и активность.

Высокая активность заявляемого средства позволяет вводить его как капли в нос, что очень удобно и способствует достижению быстрого лечебного эффекта, поскольку препарат попадает в мозг, обходя гематоэнцефалический барьер.

Для определения эффективности заявляемого препарата был проведен эксперимент на половозрелых котах и кошках, у которых предварительно моделировали двусторонний геморрагический (а.с. СССР №1767518 от 08.06.1992 г.) и ишемический инсульт.

Степень тяжести инсульта была приблизительно одинаковой и контролировалась при неврологическом обследовании (геми- и тетрапарез, плегия, анастезия, нистагм и др.). Животные были разделены на 6 групп (n=20 в каждой группе) - 2 контрольные (одна с геморрагическим, другая с ишемическим инсультом) и 4 опытные (2 с геморрагическим и 2 с ишемическим инсультом). 1 группа с геморрагическим и 1 с ишемическим инсультом получали церебрал, а другие 2 опытные группы получали заявляемый препарат.

Через три дня после инсульта животные, которые выжили, получали соответствующие препараты: животные контрольных групп - 0,85% раствор NaCl внутрибрюшинно, а опытных групп - церебрал (1 мл 2,5% раствора, внутрибрюшинно) и заявляемый препарат (1 мл 2,5% раствора, внутрибрюшинно) один раз в сутки в течение недели.

На основании последующего двухнедельного исследования ЭКоГ различных зон неокортекса, восстановления поведенческих реакций и данных биопсийного исследования сенсомоторного неокортекса был сделан вывод, что противоинсультная эффективность заявляемого препарата приблизительно в 2 раза превышает таковую средства Церебрал при лечении ишемического инсульта и аналогична церебралу при лечении геморрагического инсульта. О более высокой противоинсультной активности заявляемого препарата по сравнению с церебралом при лечении ишемического инсульта свидетельствует восстановление вольтажа ЭКоГ и нормализация ее ритмов уже на 4-5 сутки после моделирования инсульта. При использовании церебрала нормализация наступала через 8-11 суток. По сравнению с контролем в 3 раза ускорялись восстановление ходьбы, пищевого и Мангус-рефлекса (и в 1,7 раза при введении церебрала).

Эти различия проявляются при исследовании выживаемости животных с ишемическим инсультом, при этом заявляемый препарат в 1,5 раза превышает церебрал по данному показателю. При геморрагическом инсульте эти показатели были идентичны. После начала лечения животных с ишемическим инсультом с 3-го дня заболевания уровень смертности животных, которым вводился заявляемый препарат, уменьшался в 1,5 раза по сравнению с животными, которые получали церебрал, и в 3 раза по сравнению с контролем.

Упомянутое лечебное средство обладает чрезвычайно низкой токсичностью, полной совместимостью с другими видами терапии, не вызывает аллергических реакций и побочных эффектов. Противопоказаний к его применению не выявлено.

Препарат проявляет выраженный ноотропный эффект и цитопротекторное действие, оказывает регулирующее влияние на биоэлектрическую активность мозга.

Технический результат данного изобретения достигается также тем, что в способе получения средства для лечения инсульта, который состоит в дроблении мозга свиней, его гомогенизации и последующей обработки гомогената, полученного согласно изобретению, дробят мозг свиней, которым моделируют геморрагический полушарный инсульт через некоторое время после окклюзии общей сонной артерии на этой же стороне (ишемического инсульта), из полученного гомогената при рН 7,3-7,6 с концентрацией раздробленных частей мозга не более 20% выделяют нерастворимые фрагменты, после чего из оставшейся жидкой смеси после добавления в нее гексана в соотношении 1:(3-5) экстрагируют липидные компоненты, выделяют экстракт и осуществляют фильтрацию полученной смеси до достижения ее осветления, после чего - стерилизующую фильтрацию, а замороженный при температуре -30°C полученный фильтрат лиофилизируют.

При осуществлении заявляемого способа в качестве исходного сырья используют мозг свиней, которым моделируют геморрагический полушарный инсульт через некоторое время после окклюзии общей сонной артерии на этой же стороне (ишемического инсульта) согласно известной методики. Из мозга свиней преимущественно брали кору, поскольку эта часть мозга обладает максимальным количеством нейротрофических и цитопротекторных факторов. Выбор мозга свиней в качестве исходного сырья обусловлен тем, что эти животные наиболее близки людям, более устойчивы к заболеваниям и, кроме того, более доступны и экономически целесообразны в промышленном выпуске препарата.

Во время моделирования одностороннего ишемического и геморрагического инсульта у животных в ткани мозга начинаются репаративные процессы и происходит выделение трофических факторов, оказывающих на клетки мозга защитное влияние. По-видимому, факторы, обладающие протективными свойствами, при ишемическом и геморрагическом инсульте различны. Вероятно именно этим и можно объяснить тот факт, что заявляемый препарат эффективен при лечении ишемического и геморрагического инсульта, тогда как церебрал эффективен лишь при лечении последнего.

Мозг свиней, перенесших моделированный ишемический и последующий геморрагический инсульт, подвергают дроблению, после чего гомогенизируют в буфере при рН 7,3-7,6. Концентрация раздробленных частей мозга должна составлять не более 20%.

Полученный гомогенат центрифугируют для удаления нерастворимых фрагментов ткани мозга, для дальнейшей работы отбирают надосадок, который затем смешивают с гексаном в соотношении 1:(3-5) для экстракции липидных компонентов. Выбор гексана в качестве экстракта для липидных компонентов обусловлен его дополнительными преимуществами: он малотоксичен, что существенно, поскольку получают лечебное средство, и действует как консервант, т.е. обладает потивомикробной активностью.

После отделения экстракта, содержащего липидные продукты, поводят фильтрацию оставшейся жидкости (просветляющую фильтрацию), которая предназначена для удаления больших молекул, липопротеинов, микробов, оставшихся липидов и т.д.

Затем проводят стерилизующую фильтрацию, которая необходима для удаления вирусов, микробов, агрегатов молекул.

Проведенные таким образом операции заявляемого способа позволили максимально удалить компоненты, которые снижают активность полученного средства.

Полученный фильтрат замораживают при температуре ниже -30°C, а затем подвергают лиофилизации. При этом наблюдается максимальное сохранение биологической активности получаемого аминокислотно-пептидного комплекса.

Пример

Десяти самкам свиней в возрасте 1-1,5 лет массой 100-150 кг моделировали односторонний ишемический, а затем геморрагический инсульт. Через два месяца провели забой животных, отсечение головы, извлечение мозга. С ткани мозга удаляли кровь, после чего на холоде срезали кору мозга.

Для приготовления гомогената брали 10% ткани коры и 90% 0,005 М трис-HCl-буфера (рН 7,4) с добавлением цукрозы до 0,34 М. Смесь гомогенизировали с помощью гомогенизатора в течение 4 мин при температуре -4°C.

Полученный гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 25 минут, осадок отделяли, а супернатант смешивали с гексаном в соотношении 1:3. Экстракцию выполняли дважды, экстракт отделяли.

Затем жидкость после отделения экстракта пропускали через фильтр с размером пор 0,48 мкм в течение 2 ч, в результате чего произошло осветление жидкости.

Затем проводили стерилизующую фильтрацию с использованием фильтров с размером пор 0,22 мкм. Фильтрат разливали по 2 мл в ампулы, объемом 5 мл, содержимое замораживали при температуре -30°C и выдерживали в таких условиях не менее 20 ч, проводили лиофилизацию замороженного продукта.

Осветляющую и стерилизующую фильтрацию, лиофилизацию и запайку ампул проводили в стерильных условиях.

Полученный препарат представляет собой пышный порошок светложелтого цвета, хорошо растворимый в воде и спирте.

Таким образом, заявляемый препарат имеет выраженную противоинсультную активность.

Приведенные опыты на животных позволили сделать вывод, что полученный препарат обладает выраженным противоинсультным действием и эффективен при лечении как ишемического, так и геморрагического инсульта. Природа полученного способа определяет его использование не только для лечения инсульта, но и других заболеваний, связанных с поражением головного мозга, в частности: ДЦП, рассеянный склероз, перинатальное поражение нервной системы и др.

Кроме того, благодаря реализации заявляемого способа получают препарат с такой концентрацией активных компонентов, которая определяет простой и легкодоступный для больных способ его применения.

Способ получения предлагаемого средства является простым в выполнении и пригодным для широкого внедрения.

1. Препарат для лечения ишемического и геморрагического инсульта, выделенный из мозга свиней, подвергшихся моделированию геморрагического инсульта, и представляющий собой аминокислотно-пептидный комплекс, отличающийся тем, что он выделен из мозга свиней, подвергшихся моделированию геморрагического полушарного инсульта после окклюзии общей сонной артерии на этой же стороне (ишемического инсульта).

2. Способ получения препарата для лечения ишемического и геморрагического инсульта, который включает дробление мозга свиней, подвергшихся моделированию геморрагического инсульта, после чего гомогенизируют при рН 7,3-7,6 с концентрацией раздробленных частей мозга не более 20%, полученный гомогенат центрифугируют и отделяют осадок, а супернатант смешивают с гексаном в соотношении 1:(3-5), отделяют жидкую часть и фильтруют полученную смесь до ее осветления, далее проводят стерилизующую фильтрацию, полученный фильтрат замораживают при температуре -30°С, лиофилизируют, отличающийся тем, что дробят мозг свиней, подвергшихся моделированию геморрагического полушарного инсульта после окклюзии общей сонной артерии на этой же стороне (ишемического инсульта).