Применение варианта сплайсинга грелина для лечения кахексии, и/или анорексии, и/или анорексии-кахексии, и/или нарушения питания, и/или липодистрофии, и/или мышечного истощения, и/или стимуляции аппетита

Применение варианта сплайсинга грелина для лечения кахексии, и/или анорексии, и/или анорексии-кахексии, и/или нарушения питания, и/или липодистрофии, и/или мышечного истощения, и/или стимуляции аппетита

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Эта заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США № 60/781860, поданной 13 марта 2006, которая полностью включена сюда посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к соединениям для лечения или предупреждения кахексии, и/или липодистрофии, и/или мышечного истощения и связанных с ними состояний.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Грелин является биоактивным пептидом, который стимулирует потребление пищи, увеличение веса тела и ожирение у грызунов (Tschop M. et al., Nature 407: 903-13 (2000); Wren A.M. et al., Diabetes 50: 2540-47 (2001)). Экстренное введение грелина стимулирует потребление пищи у здоровых мужчин и женщин (Wren A.M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86: 5992-95 (2001); Druce M.R. et al., Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 29: 1130-36 (2005)), а также у раковых больных с анорексией (Neary N.M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 2832-36 (2004)). Многократное введение грелина увеличивает тощую массу тела, вес тела и потребление пищи у страдающих кахексией больных с хроническим обструктивным заболеванием легких (COPD) (Nagaya N. et al., Chest 128: 1187-93 (2005)) и уменьшает мышечное истощение у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (Nagaya N. et al., Circulation 110: 3674-79 (2004)). Схожий эффект был также продемонстрирован в модели на мышах (Hanada T. et al., Biochem. Biophys. Res. Common. 301: 275-79 (2003)).

Опухолевый рост связан с кардинальными метаболическими и нейрохимическими изменениями, которые приводят к возникновению синдрома анорексии-кахексии. Анорексия определяется как утрата желания есть, в то время как кахексия является результатом прогрессирующего истощения массы скелетных мышц и в меньшей степени жировой ткани, происходящего как раз до того, как становится очевидной потеря веса. Синдром раковой анорексии-кахексии в высокой степени распространен среди больных раком, оказывает большое влияние на заболеваемость и смертность и ударяет по качеству жизни больного. Однако его клиническую значимость часто пропускают, и обычно приступают к лечениям только во время запущенных стадий заболевания (Laviano A. et al., Nat. Clin. Pract. Oncol. 3: 158-65 (2005)).

Грелин секретируется в предшествующей приему пищи ситуации, начинающейся за 1-2 часа до приема пищи, приводя к резкому, кратковременному скачку в уровнях грелина в плазме до приема пищи, и продолжающейся короткое время после начала приема пищи. Поскольку грелин является единственным известным продуцируемым периферически, вызывающим аппетит (возбуждающим аппетит) веществом, полагают, что увеличение уровней грелина в плазме является критическим для начала приема пищи.

Играя роль ключевого стимулятора аппетита, грелин, высвобождаемый из клеток эндокринной системы в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, может действовать как локально в качестве паракринного вещества, так и центрально в качестве гормона, как описано ниже в разделе, относящемся к раковой кахексии.

Ген GHRL (грелина) кодирует множество продуктов, являющихся результатом альтернативно сплайсированных транскриптов, различных типов расщепления препропептидов и различных посттрансляционных модификаций (Kojima M. & Kangawa M., Physiol. Rev. 85: 495-522 (2005); Zhang J.V. et al., Science 310: 996-99 (2005)). Кроме того, различными тканями продуцируются различные продукты деградации (De Vriese C. et al., Endocrinology 145: 4997-5005 (2004)). Некоторые из этих продуктов GHRL описываются здесь.

Грелин является пептидом из 28 аминокислот, имеющим н-октаноильную боковую цепь у третьего серина, являющимся результатом отщепления сигнального пептида и пропептида от препрогрелина из 117 аминокислот и ацилирования. Ацилированный N-конец грелина необходим для эндокринных функций (Kojima M. et al., Nature 402: 656-60 (1999); Bednarek M.A. et al., J. Med. Chem. 43: 4370-76 (2000)). Показано, что грелин без ацила, у которого отсутствуют эндокринные функции, оказывает антагонистическое действие на влияние грелина на продукцию глюкозы in vitro (Gauna C. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 5035-42 (2004)). Альтернативно сплайсированная мРНК грелина кодирует препропептид из 116 аминокислот, который далее процессируется в дез-Gln14-грелин и процессированный пептид из 27 аминокислот (Hosoda H. et al., J. Biol. Chem. 275: 21995-22000 (2000)). Другой пептид, обестатин, отщепляется от препрогрелина и не имеет перекрывания последовательности с процессированным пептидом грелина. Показано, что этот пептид оказывает некоторое антагонистическое действие на ацилированный грелин, ингибируя потребление пищи и увеличение веса тела (Zhang J.V. et al., Science 310: 996-99 (2005)). Также может быть функционирующим еще один пептид, С-конец препрогрелина из 66 аминокислот (Pemberton C. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 310: 567-73 (2003)). Множество изоформ, в том числе изоформ, кодируемых различными вариантами сплайсинга, известны для других белков, например, для фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), причем различные изоформы имеют общую роль в виде развития кровеносных сосудов, при этом они отличаются по некоторым другим свойствам, таким как аффинность связывания (Neufeld G. et al., FASEB J. 13: 9-22 (1999)). Таким образом множество продуктов гена GHRL может отражать подобным образом сложный контроль эндокринного и паракринного действия изоформ грелина.

Ранее было показано, что введение грелина с помощью непрерывных инфузий доз 5 пмоль/кг/мин в течение 270 минут увеличивает потребление пищи здоровыми людьми (Wren A.M. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 86: 5992-95 (2001)). Также было показано, что инфузия грелина в течение 90 минут может увеличить на 30% потребление пищи больными с раковой кахексией (Abstract P09, Digestive Hormones, Appetite and Energy Balance, Baylis and Starling meeting, London, June 2003). Недавно было показано, что подкожная инъекция 3,6 нмоль/кг ацилированного грелина до приема пищи, обеспечивая, таким образом, имитацию, близкую к встречающейся в природе ситуации, предшествующей приему пищи, увеличивало поступление энергии на 27%. Также, по-видимому, грелин увеличивал воспринимаемую аппетитность предлагаемого пищевого продукта (Druce M.R. et al., Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 29: 1130-36 (2005)).

Эти исследования демонстрируют, что парентеральное введение грелина может увеличить аппетит как у нормальных субъектов, так и у пациентов с утратой аппетита. Кроме того, заявитель обнаружил, что можно получить значительный эффект увеличения веса тела и значительное увеличение потребления пищи с помощью нового варианта сплайсинга грелина (смотри находящуюся в совладении и в процессе одновременного рассмотрения опубликованную заявку на патент США № 2005/0059015, включенную сюда посредством ссылки) при введении субъекту, в частности, при введении подкожно до приема пищи, обеспечивая, таким образом, имитацию, близкую к встречающейся в природе ситуации, предшествующей приему пищи. Эффект нового варианта сплайсинга грелина заявителя на увеличение веса направлен, главным образом, на тощую массу, в то время как эффект грелина на увеличение веса направлен, главным образом, на жировую массу.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одним аспектом является подобное варианту сплайсинга грелина соединение, имеющее формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1.

Другим аспектом является фармацевтическая композиция, содержащая подобное варианту сплайсинга грелина соединение, имеющее формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1.

Дальнейшим аспектом является способ лечения кахексии, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему фармацевтически приемлемого количества (а) варианта сплайсинга грелина; (b) подобного варианту сплайсинга грелина соединения, имеющего формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1; или (с) их смеси.

Дополнительным аспектом является способ предупреждения кахексии, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему фармацевтически приемлемого количества (а) варианта сплайсинга грелина; (b) подобного варианту сплайсинга грелина соединения, имеющего формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1; или (с) их смеси.

Дальнейшим аспектом является способ стимуляции аппетита, потребления пищи и/или увеличения веса, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему фармацевтически приемлемого количества (а) варианта сплайсинга грелина; (b) подобного варианту сплайсинга грелина соединения, имеющего формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1; или (с) их смеси.

Другим аспектом является способ лечения липодистрофии, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему фармацевтически приемлемого количества (а) варианта сплайсинга грелина; (b) подобного варианту сплайсинга грелина соединения, имеющего формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1; или (с) их смеси.

Дальнейшим аспектом является способ предупреждения липодистрофии, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему фармацевтически приемлемого количества (а) варианта сплайсинга грелина; (b) подобного варианту сплайсинга грелина соединения, имеющего формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1; или (с) их смеси.

Другим аспектом является способ лечения мышечного истощения, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему фармацевтически приемлемого количества (а) варианта сплайсинга грелина; (b) подобного варианту сплайсинга грелина соединения, имеющего формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1; или (с) их смеси.

Дальнейшим аспектом является способ предупреждения мышечного истощения, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему фармацевтически приемлемого количества (а) варианта сплайсинга грелина; (b) подобного варианту сплайсинга грелина соединения, имеющего формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1; или (с) их смеси.

Дополнительным аспектом является способ лечения кахексии, и/или анорексии, и/или анорексии-кахексии, и/или нарушения питания, и/или липодистрофии и/или стимуляции аппетита, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему фармацевтически приемлемого количества усиливающего секрецию средства, включающего (а) вариант сплайсинга грелина; (b) подобное варианту сплайсинга грелина соединение, имеющее формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1; или (с) их смеси; причем лечение выбирают из группы, состоящей из профилактики или лечения кахексии, профилактики или лечения липодистрофии, стимуляции аппетита, стимуляции потребления пищи, стимуляции увеличения веса, увеличения жировой массы тела, увеличения тощей массы тела или их комбинации.

Дальнейшим аспектом является набор для введения варианта сплайсинга грелина или подобного варианту сплайсинга грелина соединения, включающий (а) лекарственную форму, содержащую фармацевтически приемлемое количество (1) варианта сплайсинга грелина; (2) подобного варианту сплайсинга грелина соединения, имеющего формулу Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% SEQ ID NO: 1; или (3) их смеси; и (b) необязательно инструкции в отношении введения (а).

Другой аспект предназначен для способа продуцирования подобного варианту сплайсинга грелина соединения, включающий (а) обеспечение кДНК, включающей полинуклеотидную последовательность, кодирующую подобное варианту сплайсинга грелина соединение, описанное выше; (b) встраивание указанной кДНК в экспрессирующий вектор так, чтобы кДНК была функционально связана с промотором; (с) введение указанного экспрессирующего вектора в клетку-хозяина, посредством чего указанная клетка-хозяин продуцирует указанное подобное варианту сплайсинга грелина соединение; и (d) необязательно выделения подобного варианту сплайсинга грелина соединения, продуцированного на стадии (с).

Другие объекты и преимущества станут очевидны квалифицированным в данной области техники специалистам после ссылки на подробное описание, которое следует ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 представляет собой вариант сплайсинга препрогрелина человека после сигнальной последовательности.

SEQ ID NO: 2 представляет собой вариант сплайсинга грелина человека из 22 аминокислот.

SEQ ID NO: 3 представляет собой вариант сплайсинга грелина человека из 24 аминокислот.

SEQ ID NO: 4 представляет собой модифицированный вариант сплайсинга грелина человека из 24 аминокислот.

SEQ ID NO: 5 представляет собой вариант сплайсинга грелина человека из 29 аминокислот.

SEQ ID NO: 6 представляет собой фрагмент полноразмерного варианта сплайсинга грелина человека.

SEQ ID NO: 7 представляет собой вариант сплайсинга препрогрелина мыши после сигнальной последовательности.

SEQ ID NO: 8 представляет собой вариант сплайсинга препрогрелина крысы после сигнальной последовательности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1А представляет собой линейный график, демонстрирующий кумулятивное увеличение веса тела у мышей 129Sv, подвергнутых лечению ацилированным вариантом сплайсинга грелина (SEQ ID NO: 2 и 5), по сравнению с контролями, обработанными носителем. Ацилированный вариант сплайсинга грелина вызывает увеличение веса тела у самцов мышей дикого типа (n=10 на группу, Р = 0,0001). Для мышей, подвергнутых лечению один раз в день на протяжении двух недель ацилированным вариантом сплайсинга грелина (0,8 мг/кг, подкожно), кумулятивное увеличение веса у животных группы SEQ ID NO: 2 было в 3,4 раза больше, чем у контрольных животных, которым инъецировали носитель. Кумулятивное увеличение веса у животных группы ацилированной SEQ ID NO: 5 было в 2 раза больше, чем у контрольных животных, которым инъецировали носитель. Фиг. 1В представляет собой линейный график, демонстрирующий кумулятивное потребление пищи мышами 129Sv, подвергнутыми лечению ацилированным вариантом сплайсинга грелина (SEQ ID NO: 2 и 5), по сравнению с контролями, обработанными носителем. Лечение ацилированным вариантом сплайсинга грелина увеличивало потребление пищи мышами дикого типа. Мыши, подвергнутые лечению один раз в день на протяжении двух недель ацилированным вариантом сплайсинга грелина (0,8 мг/кг, подкожно), ели на 13% больше контрольных животных, которым вводили носитель (n=10 на группу, Р = 0,0004).

Фиг. 2А представляет собой линейный график, демонстрирующий кумулятивное увеличение веса тела у мышей 129Sv, подвергнутых лечению ацилированным вариантом сплайсинга грелина (SEQ ID NO: 2 и 4) и неацилированной SEQ ID NO: 5, по сравнению с контролями, обработанными носителем. Ацилированный вариант сплайсинга грелина вызывает увеличение веса тела у самцов мышей дикого типа (n=8 на группу, Р = 0,0001). Для мышей, подвергнутых лечению один раз в день на протяжении семи дней ацилированным или неацилированным вариантом сплайсинга грелина (7,2 мг/кг, подкожно), кумулятивное увеличение веса у животных группы SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4 было в 2,2 раза больше, чем у контрольных животных, которым инъецировали носитель. Кумулятивное увеличение веса у животных группы неацилированной SEQ ID NO: 5 было на 25% меньше, чем у контрольных животных, которым инъецировали носитель. Фиг. 2В представляет собой линейный график, демонстрирующий кумулятивное потребление пищи мышами 129Sv, подвергнутыми лечению ацилированным вариантом сплайсинга грелина (SEQ ID NO: 2 и 4) и неацилированной SEQ ID NO: 5, по сравнению с контролями, обработанными носителем. Лечение ацилированным вариантом сплайсинга грелина увеличивало потребление пищи мышами дикого типа. Мыши, подвергнутые лечению один раз в день на протяжении семи дней ацилированным вариантами сплайсинга грелина (7,2 мг/кг, подкожно), ели на 18% больше контрольных мышей, которым вводили носитель (n=8 на группу). Мыши, подвергнутые лечению один раз в день на протяжении семи дней SEQ ID NO: 5 (7,2 мг/кг, подкожно), ели на 2% меньше контрольных животных, которым вводили носитель (n=8 на группу).

Фиг. 3 представляет собой гистограмму, демонстрирующую концентрацию гормона роста в сыворотке после подкожного введения ацилированного варианта сплайсинга грелина (SEQ ID NO: 2, 4, 5) и неацилированной SEQ ID NO: 5 по сравнению с контролями, которым вводили носитель. Демонстрируется эффект солевого раствора или ацилированного варианта сплайсинга грелина (0,8 мг/кг, подкожно) на гормон роста в плазме через 10 минут и 20 минут после инъекции мышам дикого типа (n=5 на группу).

Фиг. 4 представляет собой гистограмму, демонстрирующую изменение состава тела у мышей 129Sv, подвергнутых лечению ацилированным вариантом сплайсинга грелина (SEQ ID NO: 2 и 4), и мышей, подвергнутых лечению неацилированной SEQ ID NO: 5, по сравнению с контролями, обработанными носителем и подвергнутых лечению грелином. Демонстрируется эффект ежедневного подкожного лечения на протяжении семи дней солевым раствором, грелином или ацилированным вариантом сплайсинга грелина (7,2 мг/кг, подкожно) на жировую и тощую массу тела, измеряемую с помощью ЯМР.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявители специально включают полное содержание всех упоминаемых в этом описании ссылок. Кроме того, когда количество, концентрация или другая величина или параметр приводится или в виде диапазона, предпочтительного диапазона, или в виде перечисления верхних предпочтительных величин и нижних предпочтительных величин, это следует понимать как раскрытие, в частности, всех диапазонов, образованных любой парой из любой верхней границы диапазона или предпочтительной величины и любой нижней границы диапазона или предпочтительной величины, независимо от того, раскрыты ли диапазоны отдельно. При упоминании здесь диапазона численных величин, если только не указано иное, диапазон, как предполагается, включает его конечные значения, и все целые числа и части в пределах диапазона. Не предполагается, что объем изобретения ограничен конкретными величинами, упоминаемыми при определении диапазона.

В контексте этого описания будет использоваться ряд терминов.

Используемый здесь термин «аффинность» означает прочность связи между рецепторами и их лигандами, например, между антителом и его антигеном.

Используемый здесь термин «аминокислотный остаток» означает аминокислоту, образуемую при химическом расщеплении (гидролизе) полипептида по его пептидным связям. Описываемый здесь аминокислотный остаток предпочтительно находится в «L» изомерной форме. Однако аминокислота охватывает всякую аминокислоту, такую как L-аминокислота, D-аминокислота, альфа-аминокислота, бета-аминокислота, гамма-аминокислота, природная аминокислота и синтетическая аминокислота и т.п., пока полипептидом сохраняется желаемое функциональное свойство. NH₂ относится к свободной аминогруппе, присутствующей на аминоконце полипептида. СООН относится к свободной карбоксильной группе, присутствующей на карбоксильном конце полипептида. Стандартные сокращения для аминокислотных остатков полипептида продемонстрированы в таблице 1.

Таблица 1
Однобуквенный код	Трехбуквенный код	Аминокислота
A	Ala	Аланин
B	Asx, Asn и/или Asp	Аспарагиновая кислотаи/или аспарагин
C	Cys	Цистеин
D	Asp	Аспарагиновая кислота
E	Glu	Глютаминовая кислота
F	Phe	Фенилаланин
G	Gly	Глицин
H	His	Гистидин
I	Ile	Изолейцин
K	Lys	Лизин
L	Leu	Лейцин
M	Met	Метионин
N	Asn	Аспарагин
P	Pro	Пролин
Q	Gln	Глютамин
R	Arg	Аргинин
S	Ser	Серин
T	Thr	Треонин
V	Val	Валин
W	Trp	Триптофан
X	Xaa	Неизвестная или другая
Y	Tyr	Тирозин
Z	Glx, Gln и/или Glu	Глютаминовая кислотаи/или глютамин
-	Dpr	2,3-диаминопропионоваякислота

Следует отметить, что все представленные здесь формулой последовательности аминокислотных остатков ориентированы слева направо в общепринятом направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Кроме того, при широком определении фраза «аминокислотный остаток» включает аминокислоты, перечисленные в таблице 1, и модифицированные и не встречающиеся в природе аминокислотные остатки. Кроме того, следует отметить, что тире в начале или конце последовательности аминокислотных остатков указывает пептидную связь с дополнительной последовательностью из одного или нескольких аминокислотных остатков или ковалентную связь с группой на аминоконце, такой как, NH₂ или ацетил, или с группой на карбоксильном конце, такой как СООН.

Используемый здесь термин «антинеопластическое лечение» означает лечение, нацеленное на остановку или уменьшение абнормального роста ткани (такого как неоплазма) у индивидуума. Примеры такого лечения включают противораковые терапии, такие как радиотерапия или химиотерапия.

«Аппетит» в отношении индивидуума определяют с помощью измерения количества потребляемой пищи и с помощью оценки желания индивидуума есть. Здесь аппетит (т.е. голод) обычно определяют с помощью короткой анкеты, даваемой индивидуумам на случайной основе несколько раз в неделю. Как правило, субъекты оценивают свой голод, поглощенность мыслями о еде или желание съесть большие количества и различные типы пищевых продуктов, отвечая на вопросы с использованием аналоговой шкалы от 1 (нет совсем) до 5 (предельно).

«Показатель массы тела» или «BMI» является величиной отношения роста к весу индивидуума. BMI определяют расчетом веса в килограммах, поделенного на квадрат роста в метрах. «Нормальный» диапазон BMI составляет 18,5-25.

«Жировую массу тела» можно определить, например, с помощью метода жировой складки. В методе жировой складки используется циркуль типа пинцета для определения подкожного жира с помощью измерения толщины складки кожи в репрезентативных местах на теле. Эти измерения складок кожи затем используют для расчета жира тела или с помощью сложения показателей различных измерений, или использования этой величины в качестве индикации относительной степени ожирения среди индивидуумов, или с помощью использования измерений в математических уравнениях, которые были разработаны для предсказания процента жира тела (Fogelholm M. & van Marken Lichtenbelt W., Eur. J. Clin. Nutr. 51: 495-503 (1997)).

Используемый здесь термин «эквивалент концентрации» означает эквивалентную дозу подобного варианту сплайсинга грелина соединения, имеющей in vitro и/или in vivo ответ, одинаковый с ответом, рассчитанным по кривой доза-ответ варианта сплайсинга грелина.

«Константа диссоциации» или «Kd» является величиной, характеризующей прочность связи (или аффинность, или авидность) между рецепторами и их лигандами, например, антителом и его антигеном. Чем меньше Kd, тем сильнее связывание.

«Слитый полипептид» представляет собой полипептид, включающий по крайней мере два полипептида и связывающую последовательность для функционального связывания двух полипептидов в один непрерывный полипептид. Два полипептида, связанные в слитый полипептид, обычно происходят из двух независимых источников, и, следовательно, слитый полипептид включает два связанных полипептида, не обнаруживаемых, как правило, связанными в природе.

Как здесь используется, «грелин человека» представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, заявленную в № доступа в GenBank® - NP_057446 или Swiss-Prot-идентификаторе GHRL_HUMAN. Препротеин грелина человека имеет 117 аминокислот. Этот препротеин подвергается следующему посттрасляционному процессингу. Сигнальный пептид (аминокислоты 1-23) удаляется, и остающиеся 94 аминокислоты расщепляются протеазой с обеспечением зрелого грелина из 28 аминокислот (аминокислоты 24-51) или зрелого грелина из 27 аминокислот (аминокислоты 24-50) и зрелого обестатина из 23 аминокислот (аминокислоты 76-98). Зрелые пептиды грелина из 27 или 28 аминокислот могут далее быть модифицированы в положении 26 серина в препротеине с помощью или О-октаноильной группы, или О-деканоильной группы. Зрелый пептид обестатина может далее быть модифицирован в положении 98 лизина в препротеине с помощью амидной группы. Известен дополнительный препротеин грелина, в котором отсутствует глютамин в положении 37 препротеина.

«Вариант сплайсинга грелина» представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или любой пептид из 15 аминокислот или больше из SEQ ID NO: 1 с посттрансляционной модификацией или без нее, или любой гомолог SEQ ID NO: 1, представленный в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, и/или любой пептид из 15 аминокислот или больше из SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8 с посттрансляционной модификацией или без нее.

«Подобное варианту сплайсинга грелина соединение», как здесь используется, относится к любому соединению, которое воспроизводит функцию варианта сплайсинга грелина, в частности, варианта сплайсинга грелина человека, приводя, в частности, относительно функций варианта сплайсинга грелина, к желательным терапевтическим эффектам, описанным здесь, таким как стимуляция аппетита и/или лечение и/или профилактики кахексии, и определяется формулой I: Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2, где Z1 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; каждую из Х1 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты; Х2 выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, при этом указанная аминокислота модифицирована большой гидрофобной группой; каждую из Х3 независимо выбирают из встречающейся в природе аминокислоты и синтетической аминокислоты, причем одна или более из Х1 и Х3 могут быть необязательно модифицированы большой гидрофобной группой; Z2 представляет собой необязательно присутствующую защитную группу; m представляет собой целое число в диапазоне 1-10; n представляет собой целое число в диапазоне 4-92; при условии, что длина соединения в соответствии с формулой Z1-(X1)m-(X2)-(X3)n-Z2 составляет 15-94 аминокислот, и это соединение гомологично на по крайней мере 80% (или в альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения на 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100%) SEQ ID NO: 1. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения длина подобного варианту сплайсинга грелина соединения составляет 22-29 аминокислот.

«Иммунологически отличный» относится к способности устанавливать различие между двумя полипептидами по способности антитела специфически связываться с одним из полипептидов и не связываться специфически с другим полипептидом.

«Индивидуумом» является животное или человек, восприимчивые к состоянию, в частности кахектическому состоянию, определенному здесь. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения индивидуумом является млекопитающее, в том числе человек, и не являющиеся человеком млекопитающие, такие как собаки, кошки, свиньи, коровы, овцы, козы, лошади, крысы и мыши. В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения индивидуумом является человек.

«Выделенный» используется для описания различных подобных варианту сплайсинга грелина соединений, т.е. полипептидов и нуклеотидов, раскрытых здесь, которые были идентифицированы и отделены и/или очищены от компонента их природного окружения. Компоненты-примеси природного окружения являются материалами, которые обычно мешали бы диагностическ