Способ получения белка

Способ получения белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на связанные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/879904, поданной 11 января 2007, которая этим включена сюда в качестве ссылки в полном объеме.

Область изобретения

Изобретение относится к использованию неочищенного глицерина в качестве источника углерода для роста клеток в культуре и производства белков в таких клеточных культурах.

Предпосылки изобретения

В определенных молекулярных биотехнологических способах клетки растут в средах для культивирования и используются для производства желаемых белков. Производимые желаемые белки могут быть выделены и использованы во множестве промышленных и медицинских применений. Например, желаемый белок можно использовать в качестве терапевтического белка, такого как антитело или фермент, и использовать в промышленных применениях, таких как применение для очистки (например, прачечных детергентов), применение при производстве бумаги, применение для кормления животных, применение при выпекании хлеба, способы гидролиза крахмала и другие способы, которые требуют больших количеств специального фермента.

Производство больших количеств белка с использованием рекомбинантных клеток или нерекомбинантных клеток часто требует, чтобы клетки культивировались в среде, содержащей источник углерода, источник азота и другие питательные вещества, например аминокислоты, витамины, минералы и т.д., которые требуются для роста этих клеток. Многие клеточные культуры содержат в себе глюкозу или комбинацию из глюкозы и других субстратов в качестве источника углерода в клеточной культуре или в качестве кормового субстрата в клеточной культуре.

Настоящее изобретение относится к альтернативному источнику углерода для использования в клеточных культурах. Здесь исследователи раскрывают, что добавление неочищенного глицерина в питательные среды или в качестве единственного источника углерода или в сочетании с другими сахарами (например, глюкозой) можно использовать в качестве источника углерода для производства желаемых белков посредством роста клеток в культурах. Использование неочищенного глицерина в культурах клеток принесет огромную коммерческую выгоду.

Краткое изложение сущности изобретения

Предоставлена среда для культивирования, содержащая неочищенный глицерин. В определенных вариантах осуществления неочищенный глицерин может быть единственным источником углерода среды. В других вариантах осуществления среда для культивирования может содержать, в дополнение к неочищенному глицерину, один или несколько вторичных источников углерода, таких как 6-углеродные сахара, включая в качестве неограничивающих примеров глюкозу, галактозу, фруктозу, сорбозу и маннозу, или комбинацию 6-углеродных сахаров, таких как глюкоза и фруктоза (сахароза), целлюлоза, лактоза и т.п. В других вариантах осуществления среда для культивирования может содержать, в дополнение к неочищенному глицерину, один или несколько вторичных источников углерода, таких как источники белка (например, соя и/или зерновые).

Предоставлена клеточная культура, содержащая целевую среду для культивирования, содержащую неочищенный глицерин. В определенных вариантах осуществления клеточная культура включает: множество клеток, которые в конкретных вариантах осуществления могут содержать рекомбинантную нуклеиновую кислоту для производства желаемого белка, и среда для культивирования содержит неочищенный глицерин. В определенных вариантах осуществления клетки клеточной культуры могут представлять собой бактериальные клетки или клетки грибов. Рекомбинантная нуклеиновая кислота может содержать экспрессирующую кассету, содержащую в оперативной связи: a) промоторный участок, b) кодирующий участок, кодирующий желаемый белок; и c) терминирующий участок.

Белок, продуцируемый рекомбинантными клетками может быть нативным по отношению к клеткам или гетерологичным по отношению к клеткам, и, в определенных вариантах осуществления, белок может являться внутриклеточным или секретироваться из клеток в среду для культивирования. Например, белок может представлять собой промышленный фермент, терапевтический белок, репортерный белок, селективный маркер, пищевую добавку или продукт питания.

Также предоставлен способ производства белка. В общих терминах, этот способ включает в себя поддержание описанной выше клеточной культуры с целью обеспечения производства желаемого белка. В определенных случаях белок может быть выделен из среды для культивирования.

Описанная выше содержащая неочищенный глицерин среда для культивирования может быть изготовлена комбинированием, например смешиванием, неочищенного глицерина с другими компонентами, требующимися для роста клеток, например источником азота и других питательных веществ и воды.

В некоторых вариантах осуществления описанная выше клеточная культура может быть изготовлена комбинированием, например смешиванием: a) неочищенного глицерина и b) культуры клеток, содержащих нуклеиновую кислоту (например, рекомбинантную нуклеиновую кислоту) для производства желаемого белка. В других вариантах осуществления описанная выше клеточная культура может быть изготовлена комбинированием (например, инокуляцией) среда для культивирования клеток, содержащей неочищенный глицерин, с клетками, которые содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту для производства белка. Способы культивирования могут представлять собой культивирование в замкнутом объеме, подпитываемое культивирование, или способы непрерывного культивирования.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 изображает рост клеточной массы клеток рекомбинантного Streptomyces lividans в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени (DCW; граммы клеток/кг), культивируемой в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу, как описано в примере 1.

Фиг.2 изображает количество целлюлазы, секретированной с помощью Streptomyces lividans, выращенными в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени, культивированной в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу (% увеличения относительно максимальной глюкозы), как описано в примере 1. Все точки на графике изображены по отношению к самому высокому уровню белка, произведенному в среде с глюкозой, который взят за 100%.

Фиг.3 изображает рост клеточной массы рекомбинантных клеток Streptomyces lividans в подпитываемой культуре клеток в зависимости от времени (DCW; граммы клеток/кг), культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу, как описано в примере 2.

Фиг.4 изображает количество целлюлазы, секретированной с помощью Streptomyces lividans, выращенных в подпитываемой культуре клеток в зависимости от времени, культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу (% увеличения относительно максимальной глюкозы), как описано в примере 2. Все точки на графике изображены по отношению к самому высокому уровню белка, произведенного в среде с глюкозой, который взят за 100%.

Фиг.5 изображает рост клеточной массы рекомбинантных клеток Bacillus subtilis, выросших в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени (оптическая плотность при 550 нм), культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу, как описано в примере 3.

Фиг.6 изображает количество протеазы, секретированной с помощью Bacillus subtilis, выросших в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени, культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу (% увеличения относительно максимальной глюкозы), как описано в примере 3. Все точки на графике изображены по отношению к самому высокому уровню белка, произведенного в среде с глюкозой, который принят за 100%.

Фиг.7 изображает рост клеточной массы рекомбинантных клеток Bacillus subtilis, выросших в подпитываемой культуре клеток, в зависимости от времени (оптическая плотность при 550 нм), культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу, как описано в примере 4.

Фиг.8 изображает количество протеазы, секретированной с помощью Bacillus subtilis, выросших в подпитываемой культуре клеток, в зависимости от времени, культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу (versadex) (% увеличения относительно максимума versadex), как описано в примере 4. Все точки на графике изображены по отношению к самому высокому уровню белка, произведенного в среде с versadex, который принят за 100%.

Фиг.9 изображает рост клеточной массы нерекомбинантных клеток Aspergillus niger, выросших в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени (DCW; граммы клеток/кг), культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или мальтозу, как описано в примере 6.

Фиг.10 изображает количество глюкоамилазы, секретированной с помощью Aspergillus niger, выращенных в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени, культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или мальтозу (% увеличения максимума мальтозы), как описано в примере 6. Все точки на графике изображены по отношению к самому высокому уровню белка, произведенного в среде с мальтозой, который принят за 100%.

Фиг.11 изображает рост клеточной массы рекомбинантных клеток Streptomyces rubigenosis, выросших в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени (DCW; граммы клеток/кг), культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу, как описано в примере 7.

Фиг.12 изображает количество внутриклеточной глюкозоизомеразы, секретированной с помощью Streptomyces rubigenosis, выросших в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени, культивированных в среде, содержащей неочищенный глицерин или глюкозу (% увеличения относительно максимальной глюкозы), как описано в примере 7. Все точки на графике изображены по отношению к самому высокому уровню белка, произведенного в среде с глюкозой, который принят за 100%.

Фиг.13 изображает рост клеточной массы рекомбинантных клеток Hansenula polymorpha, выросших в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени (оптическая плотность при 550 нм), культивированных в среде, содержащей дистиллированный или неочищенный глицерин, как описано в примере 8.

Фиг.14 изображает количество липазы, секретированной с помощью Hansenula polymorpha, выросших в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме, в зависимости от времени, культивированных в среде, содержащей дистиллированный или неочищенный глицерин (% увеличения относительно максимального глицерина), как описано в примере 8. Все точки на графике изображены по отношению к самому высокому уровню белка, произведенного в среде с дистиллированным глицерином, который принят за 100%.

Подробное описание

Определения

Пока здесь не определено обратное, все технические и научные термины, использованные здесь, обладают теми же значениями, что и в обычном понимании специалиста в данной области, к которой принадлежит это изобретение. Singleton, et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), и Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) предоставляют с помощью общих словарей значения для многих терминов, использованных в этом изобретении. Также дается ссылка на Atkinson et al., Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd Ed, Stockton Press (1991) в качестве основной ссылки. Несмотря на то, что можно использовать любые способы и материалы, схожие или равнозначные таковым, описываемым в настоящем документе, в осуществлении или тестировании по настоящему изобретению, предпочтительные способы и материалы описаны.

Все патенты и публикации, включая все последовательности, раскрытые в этих патентах и публикациях, упомянутые здесь, в прямой форме включены по ссылке.

Числовые диапазоны включают числа, ограничивающие диапазон. Если не указано иначе, нуклеиновые кислоты написаны слева направо в направлении от 5' к 3'; аминокислотные последовательности написаны слева направо в направлении от амино к карбокси соответственно.

Предоставленные здесь заголовки не являются ограничениями для множества аспектов или вариантов осуществления изобретения, которые могут быть включены по ссылке в описание в качестве целого. Таким образом, термины, определенные непосредственно ниже, являются в описании наиболее полно определенными по ссылке в качестве целого.

«Глицерин» относится к (C₃H₈O₃) 1,2,3-пропану, также известному как 1,2,3-тригидроксипропан. Также термин взаимозаменяемо используется с «глицерином» и «глицерином».

Термин «неочищенный глицерин» определен здесь как водный раствор, обладающий % чистоты менее чем 99% (об./об.), например, по меньшей мере 25% и менее чем 95% глицерин (об./об.), от 95% до 98% глицерин (об./об.), от 95% до 99% глицерин (об./об.), или от 98% до 99% глицерин (об./об.).

Термин «очищенный глицерин», как применяют в настоящем документе, обозначает «неочищенный глицерин», содержащий менее чем 1% соли (мас./об.).

Термин «дистиллированный глицерин» определен здесь как водный раствор глицерина, обладающий % чистоты, равным 95% или более (об./об.) (больше чем приблизительно 95% и до 100% глицерина (об./об.)).

Термин «среда для культивирования» определен здесь как искусственная смесь, жидкая или твердая, которая содержит источник углерода, источник азота другие питательные вещества, например, аминокислоты, витамины, минералы и т.д., необходимые для культивирования клеток. Среда для культивирования не содержит клетки. Среда для культивирования может инокулироваться с клетками для производства клеточной культуры, которая содержит клетки и среду для культивирования.

Термины «клеточная культура» и «культура клеток» используют взаимозаменяемо для описания жидкой смеси, содержащей живые клетки, обычно одного типа, и среду для культивирования. Клеточные культуры могут быть созданы инокуляцией среды для культивирования с клетками. Клетки клеточной культуры метаболически активны, однако они способны или не способны активно делиться или расти. Клеточная культура существует in vitro.

Термин «замкнутый объем» описывает клеточную культуру, выращиваемую в замкнутом объеме, к которой перед началом запуска цикла ферментации добавляют субстрат в твердой или в концентрированной жидкой форме. Культура клеток, выращиваемая в замкнутом объеме, запускается посредством инокуляции клеток в среду для культивирования без последующего внесения питательных веществ. Концентрации питательных веществ и метаболитов в среде для культивирования зависят от начальной концентрации в замкнутом объеме и последующего изменения смеси питательного корма в результате влияния клеточной ферментации. Термин «подпитываемая» описывает выращиваемую в замкнутом объеме клеточную культуру, к которой в ходе цикла ферментации периодически или непрерывно добавляют субстрат в твердой или концентрированной жидкой форме. Подпитываемая культура клеток инициируется посредством инокуляции клеток в среду, но в ней имеет место последующее внесение питательных веществ, например, внесение концентрированного питательного корма. Однако отсутствует систематическое удаление культуральной жидкости или клеток.

Термин «непрерывная клеточная культура» или «непрерывная культура» обозначает культуру, отличающуюся как непрерывным внесением жидкого питательного корма, так и непрерывным оттоком жидкости.

Термин «сосуд» обозначает любую пригодную емкость для культивирования клеток, включая, в качестве неограничивающих примеров, баки, бутылки, колбы, пакеты, биореакторы и любые другие пригодные резервуары для проведения способов по настоящему изобретению.

Термин «промоторы» определен здесь как нуклеиновая кислота, которая направляет в клетке транскрипцию нижележащего полинуклеотида. В определенных случаях полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность и промоторы могут направлять транскрипцию кодирующей последовательности в транслируемую РНК.

Термин «изолированный» как определено в настоящем документе обозначает соединение, белок, клетку, последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислот, которые удалены из, по меньшей мере, одного компонента, с которым они ассоциированы в естественных условиях.

Термин «кодирующая последовательность» определен здесь как нуклеиновая кислота, которая когда размещена под управлением соответствующей управляющей последовательности, включая промоторы, транскрибируется в мРНК, которая может транслироваться в полипептид. Кодирующая последовательность может содержать одну открытую рамку считывания или несколько открытых рамок считывания, например, разделенных интронами. Кодирующая последовательность может представлять собой, например, кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК или рекомбинантную ДНК. Как правило, кодирующая последовательность начинается у инициирующего кодона (например, ATG) и заканчивается у терминирующего кодона (например, UAA, UAG и UGA).

Термин «рекомбинант» относится к полинуклеотиду или полипептиду, который не встречается в клетке-хозяине в естественных условиях. Рекомбинантная молекула может содержать две или более встречающихся в природе последовательности, которые соединены вместе в порядке, не встречающемся в естественных условиях.

Термин «гетерологичные» относится к элементам, которые соединены друг с другом неестественным образом. Например, если рекомбинантная клетка-хозяин синтезирует гетерологичный белок, этот белок не производится в немутантной клетке-хозяине того же типа, гетерологичные промоторы представляют собой промоторы, которые не присутствуют в нуклеиновой кислоте, которая является эндогенной для дикого типа клетки-хозяина, и промоторы, функционально связанные с гетерологичной кодирующей последовательностью, представляют собой промоторы, которые функционально связаны с кодирующей последовательностью, с которой они обычно функционально не связаны в немутантной клетке-хозяине.

Термин «функционально связан» относится к расположению элементов, которое позволяет им находиться в функциональной связи. Например, промоторы функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они управляют транскрипцией последовательности, и сигнальная последовательность функционально связана с белком, если сигнальная последовательность направляет белок через систему секреции клетки-хозяина.

Термин «нуклеиновая кислота» включает в себя ДНК, РНК, одинарные или двойные цепочки и их модификации. Здесь термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» можно использовать взаимозаменяемо.

Термин «ДНК-конструкция», как применяют в настоящем документе, обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, которая включает по меньшей мере два полинуклеотидных фрагмента ДНК.

Как применяют в настоящем документе, термин «репортер» относится к белку, который легко обнаруживается и измеряется. В определенных случаях, репортер может быть определен оптически, например, с помощью флуоресценции, люминесценции или колориметрически.

Как применяют в настоящем документе, термин «селективный маркер» относится к биополимеру, полипептиду или полинуклеотиду, который позволяет выбирать клетки-хозяев, которые содержат биополимер, из других клеток, которые не содержат биополимер. Селективные маркеры обеспечивают устойчивость к токсичным соединениям, таким как антибиотики, гербициды и т.п.

Термин «сигнальная последовательность» или «сигнальный пептид» относится к последовательности аминокислот в положении на N-конце белка, которая облегчает секрецию зрелой формы белка из клетки. У зрелой формы внеклеточного белка отсутствует сигнальная последовательность, которая отщепляется в ходе процесса секреции.

Термин «вектор» определен здесь как полинуклеотид, созданный для переноса последовательности нуклеиновой кислоты, подлежащей введению в один или несколько типов клеток. Векторы включают клонирующие векторы, экспрессирующие векторы, челночные векторы, плазмиды, фаги или вирусные частицы, ДНК-конструкции, кассеты и т.п. Экспрессирующие векторы могут содержать регуляторные последовательности, такие как промоторы, сигнальные последовательности, кодирующие последовательности и терминаторы транскрипции.

«Экспрессирующий вектор», как применяют в настоящем документе, обозначает ДНК-конструкцию, содержащую кодирующую последовательность, которая функционально связана подходящими управляющими последовательностями, способными осуществлять экспрессию белка в подходящем хозяине. Такие управляющие последовательности могут включать в себя промоторы для осуществления транскрипции, дополнительные операторные последовательности для управления транскрипцией, последовательность, кодирующую соответствующий сайт связывания с рибосомой, энхансеры и последовательности, которые управляют терминацией транскрипции и трансляции.

Как применяют в настоящем документе, термины «полипептид» и «белок» используется взаимозаменяемо и включает в себя указание на полимер из любого числа аминокислотных остатков. Термины применяются к полимерам аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются искусственными химическими аналогами соответствующих встречающихся в природе аминокислот, а также к встречающимся в природе полимерам аминокислот. Термины также применяются к полимерам, содержащим консервативные аминокислотные замены, такие чтобы полипептид оставался функциональным. «Пептиды» представляют собой полипептиды, имеющие менее чем 50 аминокислотных остатков.

«Клетка-хозяин» относится к соответствующему хозяину для экспрессирующего вектора, содержащего ДНК-конструкцию, кодирующую желаемый белок. Клетка-хозяин может относиться к любому типу клеток.

Термин «мицелиальные грибы» относится ко всем мицелиальным формам подразделения Eumycotina (см., Alexopoulos, C. J. (1962), INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New York). Эти грибы характеризуются вегетативным мицелием с клеточной стенкой, состоящей из хитина, глюканов и других сложных полисахаридов. Мицелиальные грибы по настоящему изобретению морфологически, физиологически и генетически отличаются от дрожжей. Вегетативный рост мицелиальных грибов осуществляется посредством удлинения гифов и катаболизм углерода является облигатно аэробным.

«Непатогенный» штамм представляет собой штамм, который является непатогенным для человека.

Среды для культивирования

Как указано выше, предоставлена среда для культивирования, содержащая неочищенный глицерин. Среда для культивирования может содержать источник азота, неочищенный глицерин и другие питательные вещества, например аминокислоты, витамины, минералы и т.д., необходимые для культуры клеток. Неочищенный глицерин можно использовать в качестве источника углерода для клеток, выращиваемых в среде для культивирования.

В определенных вариантах осуществления среда для культивирования может содержать дополнительный источник углерода, например сахар, для роста клеток. Таким образом, в определенных вариантах осуществления неочищенный глицерин может являться единственным источником углерода для клеток. В других вариантах осуществления неочищенный глицерин может присутствовать вместе с одним или несколькими другими вторичными источниками углерода для клеток.

В образцовых вариантах осуществления неочищенный глицерин в среде для культивирования может обладать процентом чистоты глицерина, равным от 25% до 85% (об./об.); также от 25% до 50% (об./об.); также от 50% до 75% (об./об.); также от 75% до 85% (об./об.); также от 85% до 90% (об./об.), или также от 90% до менее чем 95% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления неочищенный глицерин может обладать чистотой глицерина, равной от 95% до 98% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления неочищенный глицерин может обладать чистотой глицерина, равной менее чем 99% (об./об.).

В определенных вариантах осуществления неочищенный глицерин может содержать соль (например, KCl или NaCl; натрия или калия сульфат, фосфат, или нитрат) в концентрации до 12% (мас./об.), например, в диапазоне от 1% до 10% (мас./об.); от 1% до 5% (мас./об.); от 5% до 8% (мас./об.) или от 8% до 12% (мас./об.). Очищенный глицерин содержит менее чем 1% соли (мас./об.), например, соль в концентрации в диапазоне от 0,01% до 0,1% (мас./об.), от 0,1% до 0,5% (мас./об.) или от 0,5% до менее чем 1% (мас./об.). В одном из вариантов осуществления неочищенный глицерин практически не содержит соли (от 0 до 0,01% или от 0 до 0,001% соли).

Несмотря на то, что в предпочтительных вариантах осуществления в средах для культивирования и клеточной культуре используется неочищенный глицерин, дистиллированный глицерин можно использовать в определенных вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления дистиллированный глицерин, который определен как обладающий чистотой, равной 95% или более, может обладать чистотой, равной, по меньшей мере, 95% и менее чем 99,5% (об./об.), например, больше чем 95% до 97% глицерина (об./об.), от 97% до 99% глицерина (об./об.) или от 99% до менее чем 99,5% глицерина (об./об.). В некоторых вариантах осуществления дистиллированный глицерин, который используется в способах, включенных в изобретение, будет обладать чистотой, равной по меньшей мере 99,5%, например, по меньшей мере 99,6%, по меньшей мере 99,7% или по меньшей мере 99,9% глицерина (об./об.). Глицерин, обладающий % чистоты в пределах определенных выше диапазонов может обозначаться как технический сорт глицерина (например, от более чем 95% до менее чем 99,5%) и фармацевтический сорт глицерина (например, от по меньшей мере 99,5% глицерина до по меньшей мере 99,9% глицерина (об./об.).

Количество неочищенного глицерина, присутствующего в среде для культивирования, может значительно меняться в зависимости от используемых способов выращивания, например, выращены ли клетки в культуре клеток, выращиваемой в замкнутом объеме (например, в колбе с шейкером), непрерывной культуре или подпитываемой культуре клеток. В определенных вариантах осуществления среда для культивирования может содержать от 0,1% до 75% неочищенного глицерина (об./об.), например от 0,5% до 2% неочищенного глицерина (в особенности, если клеточная культура выращена непрерывным или подпитываемым способом, в которых источник углерода быстро используется клетками, культивируемыми в среде, от 2% до 5% неочищенного глицерина, от 5% до 10% неочищенного глицерина, от 10% до 30% неочищенного глицерина, от 30% до 50% неочищенного глицерина или от 50% до 75% неочищенного глицерина. В некоторых вариантах осуществления концентрация неочищенного глицерина является любой примерно от 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, или 25% (об./об.) примерно до 50, 55, 60, 65, 70, 75, или 80% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления клетки выращены в процессе с периодической ферментацией, и среда для культивирования содержит примерно от 1% приблизительно до 5% неочищенного глицерина (об./об.). В некоторых вариантах осуществления, клетки выращены в подпитываемом процессе с периодической ферментацией и среда для культивирования содержит примерно от 20% приблизительно до 50% неочищенного глицерина (об./об.).

Если вторичный источник углерода присутствует в среде для культивирования, вторичный источник углерода может представлять собой сахар, например глюкозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, ксилозу, арабинозу, декстрозу или сахарозу и т.д. Если вторичный источник углерода присутствует в среде для культивирования, вторичный источник углерода и неочищенный глицерин могут присутствовать в относительных молярных концентрациях в диапазоне от 1:99 (например, 1 молекула вторичного источника углерода на 99 молекул глицерина) до 99:1 (например, 99 молекул вторичного источника углерода на 1 молекулу глицерина). Например, вторичный источник углерода и неочищенный глицерин могут присутствовать в относительных молярных концентрациях в диапазоне от 1:99 до 1:10, от 1:10 до 1:2, от 1:2 до 2:1, от 10:1 до 2: 1 или от 10:1 до 99:1, например. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вторичный источник углерода будет глюкозой и, в особенности, когда клеточная культура содержит клетки грибов, некоторое количество глюкозы будет предоставлено в качестве источника углерода. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления отношение неочищенного глицерина к глюкозе будет в пределах от 1:4 до 4:1 и также от 2:1 до 1:2.

Идентичность и подходящие концентрации других компонентов, которые могут быть использованы в обсуждаемой клеточной среде для культивирования, например, источник азота и другие питательные вещества, и т.д., как правило, зависят от типа клеток, которые будут выращиваться в среде для культивирования. Как правило, такие компоненты хорошо известны в данной области (см., например, Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989 Cold Spring Harbor, N. Y.; Talbot, Molecular and Cellular Biology of Filamentous Fungi: A Practical Approach, Oxford University Press, 2001; Kinghorn and Turner, Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Cambridge University Press, 1992; и Bacillus (Biotechnology Handbooks) by Colin R. Harwood, Plenum Press, 1989; Bacillus subtilis: From Genes to Cells, Sonenshein, A.L., Hoch, J.A. and Losick, R ASM (2001), а также, например, Ilmen et al., Appl. Environ. Microbiol. 1997 63:1298-1306; O'Herrin et al. Hum. Immunol. 1996 51:63-72; Westers et al., J. Biotechnol. 2006 123:211-24 и Yang et al., Biochim. Biophys. Acta 2004 1703:43-51). Условия культивирования для заданного типа клеток также можно найти в научной литературе и/или в источнике грибов, таком как American Type Culture Collection (ATCC) и Fungal Genetics Stock Center.

Образцовые компоненты, которые могут быть использованы в средах для культивирования, включают в качестве неограничивающих примеров: экстракт из микробных, животных или растительных клеток, например, соевая мука, соевый белок, соевый концентрат, кукурузный экстракт, кукурузная мука, кукурузный глютен, дрожжевой экстракт, соевая мука, хлопковая мука, арахисовая мука, картофельный белок, сыворотка, рыбная мука, бактотриптон, бактопентон и т.д., соли, например KH₂PO₄, MgSO₄, CaCl₂, NaCl, FeCl₃, MgCl₂, MnCl₂, другие соединения, например тиамина хлорид, биотин, витамин B₁₂, NaH₂PO₄ H₃BO₃, ZnSO₄, Na₂MoO₄ и CuSO₄, и, необязательно, один или несколько вторичных источников углерода, как указано выше. В определенных случаях, источник углерода известной среды для культивирования может быть замещен глицерином (например, неочищенным глицерином). Среды для культивирования, содержащие неочищенный глицерин, приведены ниже.

Как будет описано во всех подробностях ниже, среда для культивирования может быть использована для культивирования клеток, которые cодержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту для экспрессии белка. Так как в определенных вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота может содержать селективный маркер для того, чтобы отбирать клетки, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, среда для культивирования также может содержать селективный агент, например, антибиотик, такой как ампициллин, тетрациклин, канамицин, гигромицин, блеомицин, хлорамфеникол, стрептомицин или флеомицин или гербицид, устойчивость к которому обеспечивает селективный маркер клетки. В определенных случаях, среда для культивирования также может содержать белок, секретируемый клетками. Как будет описано во всех подробностях ниже, белок может быть эндогенным по отношению к клеткам, или неэндогенным по отношению к клеткам.

В конкретных вариантах осуществления среда для культивирования может быть специально составлена для культивирования конкретных клеток (например, клеток-хозяев, которые содержат рекомбинантную нуклеиновую кислоту для синтеза белка). Как будет описано во всех подробностях ниже, такие клетки-хозяева включают, в качестве неограничивающих примеров, определенные клетки-хозяева бактерий и грибов.

Глицерин (например, неочищенный глицерин), присутствующий в обсуждаемой среде для культивирования, может быть из любого источника. В конкретных вариантах осуществления глицерин (например, неочищенный глицерин), присутствующий в обсуждаемой среде для культивирования, может быть побочным продуктом способов производства биотоплива или мыла, т.е. в качестве побочного продукта синтеза горючих алкилэфиров с помощью трансэтерификации растительных и/или животных триглицеридов, или в качестве побочного продукта получения солей жирных кислот с помощью сапонификации растительных и/или животных триглицеридов. Коммерческие источники глицерина доступны, например, в Novance (France), Reidel-de Haen (Germany), Sigma-Aldrich и ADM.

Обсуждаемая среда для культивирования может быть изготовлена с использованием любого подходящего способа. В одном из вариантов осуществления все компоненты среды для культивирования, включая неочищенный глицерин и воду, могут быть объединены и стерилизованы, например, автоклавированы или профильтрованы перед использованием. В другом варианте осуществления неочищенный глицерин может быть добавлен в другие компоненты среды для выращивания перед использованием. Среда может содержать агар или другое застывающее средство, если среда представляет собой твердую среду.

Клеточные культуры

Клеточная культура содержит: a) множество клеток-хозяев и b) предоставленные описанные выше среда для культивирования. В определенных вариантах осуществления клетки могут содержать рекомбинантную нуклеиновую кислоту для синтеза белка.

В конкретных вариантах осуществления обсуждаемая клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку, включая грамположительные и грамотрицательные бактериальные клетки следующих видов: Bacillus sp., включая в качестве неограничивающих примеров, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, and B. thuringiensis; Streptomyces sp., включая в качестве неограничивающих примеров: S. lividans, S. carbophilus, S. rubigenosus, and S. helvaticus; Pantoea sp., включая P. citrea; Gluconobacter sp.; Erwinia sp.; и E. coli.

В других вариантах осуществления обсуждаемая клетка-хозяин может быть клеткой грибов следующих видов: Trichoderma sp., (например, Trichoderma reesei (ранее классифицированная как T. longibrachiatum и также известная в настоящее время как Hypocrea jecorina), Trichoderma viride, Trichoderma koningii, and Trichoderma harzianum)); Penicillium sp., Humicola sp. (например, Humicola insolens and Humicola grisea); Chrysosporium sp. (например, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (например, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus kawachi, Aspergillus aculeatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus sojae, and Aspergillus awamori), Fusarium sp., Mucor sp., Neurospora sp., Hypocrea sp., или Emericella sp., среди других.

Известны способы для культивирования таких клеток, включая подходящие компоненты сред для культивирования, которые можно использовать для культивирования этих клеток.

Как указано выше, клетки клеточной культуры могут содержать рекомбинантную нуклеиновую кислоту для экспрессирования белка. В определенных вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота может содержать экспрессирующую кассету для экспрессирования белка, т.е. промоторы, кодирующую последовательность (т.е. полинуклеотид, кодирующий белок) и терминатор, где промоторы, кодирующая последовательность и терминатор функционально связаны так, чтобы кодирующая последовательность транскрибировалась для синтеза РНК, и эта РНК транслировалась для синтеза белка. Каждый из промоторов, кодирующей последовательности и терминатора независимо могут быть эндогенными (т.е. нативными) или неэндогенными по отношению к клетке-хозяину. Также белок может быть эндогенным (т.е. нативным) или неэндогенным по отношению к клетке-хозяину. В определенных вариантах осуществления кодирующая последовательность может быть с оптимизированными кодонами для экспрессии белка в особой клетке-хозяине. Так как таблицы использования кодонов перечисляют использование каждого кодона во многих клетках известны в данной области (см., например, Nakamura et al., Nucl. Acids Res. 2000 28: 292) или их легко получить, такие нуклеиновые кислоты могут быть быстро созданы, давая аминокислотную последовательность белка, подлежащего экспрессии.

Кодируемый белок может быть ферментом, терапевтическим белком, репортерным белком, селективным маркером, пищевой добавкой или продуктом питания или т.п.

В одном из вариантов осуществления белок может представлять собо