Плтитио- 1л 1« ttxutimlckaa ' библиотека

Плтитио- 1л 1« ttxutimlckaa ' библиотека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ 247 3>

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советоииз

Социалистическиз

Республии

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента ¹

Кл. 30h, 6

Заявлено 19.Х.1967 (№ 1193502/30-15) МПК А 61k

Приоритет

Опубликовано 20Х1.1969. Бюллетень № 21

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 619.576.858.5:

: 616.981.45: 616. .988.75-085.372 (088.8) Дата опубликования описания 13.XI.1969

Авторы изобретения

1,, 1,,1 И

ПЛТИ1т110- 3 и

О Tjx,"É "" ЛЯ ИЬЛИОТЕ1И

Иностранцы

Чарльз Гейл и Эрл Ос (Соединенные Штаты Америки) Иностранная фирма

«Эли Лилли энд Компани» (Соединенные Штаты Америки) Заявитель

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ТРАНСПОРТНОЙ

ЛИХОРАДКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Известен способ изготовления вакцины против транспортной лихорадки крупного рогатого скота из культур возбудителей Pasteurella

hemolitica и Р, multocida è культуры миксовируса параинфлюэнцы-3 путем смешения их с дополнителем, инактивации, концентрирования и консервирования полученной композиции.

Для получения вакцины, создающей более надежный иммунитет против транспортной лихорадки, предлагается новый способ. Культуры возбудителей Pasteurella hemolitica u

P. multocida после их выращивания на питательных средах смешивают раздельно с культурой миксовируса параинфлюэнцы-3, выращенного в культуре клеток почечной ткани, а затем объединяют полученные вирусно-бактериальные смеси между собой и вводят дополнитель, содержащий ионы алюминия, с последующей или предварительной инактивацией соответствующим инактивирующим агентом, преимущественно формальдегидом, и нейтрализацией его избытка соответствующим абсорбентом, например бисульфитом щелочного металла, и консервируют путем добавления парэнтерально приемлемого антисептика, например симерозола. При смешивании культур бактерий с культурой вируса плотность отдельных вирусно-бактериальных смесей выравнивают до 5 — 10 ед. по методу Мс Farland (а), а после смешения между собой этих отдельных смесей устанавливают р Н полученной смеси до б,4 — б,8. Полученную смесь культур возбудителей смешивают с дополнителем, содержащим ионы алюминия, например, в гидроокисном геле, концентрация которых эквивалентна концентрации ионов алюминия в

10 — 50 мл водного раствора, содержащего

1,3% Аl»Оз. После выращивания миксовируса

10 до момента проявления цитопатического эффекта у 50 — 70% клеток, жидкую тканевую культуру, содержащую вирус, перед смешиванием с бактериальными культурами охлаждают.

15 Предлагаемый способ позволяет получать удовлетворительно инактпвированные вирусно-бакгериальные композиции, способные создавать антигены, противодействующие развитию заболевания в организме животных.

20 Миксовирус параинфлюэнцы-3 выращиваюг известным методом на культуре монослоя ткани клеток почки эмбриональной или взрослой особи быка, кролика или обезьяны до момента проявления ЦПЭ у 50 — 70% клеток. Бак25 терии выращивают раздельно на агарс или жидкости средней оболочки стенки кровеносного сосуда. При желании вирулентность бактерий можно увеличить путем пассажпрования их на аллантожной ткани куриного эмбри30 она .или на тканевых культурах. Затем смеши247139 вают отдельные бактериальные культуры, отделенные от среды выращивания, с жидкой тканевой вируссодержащей культурой для Iloлучения отдельных оактериально-вирусных смесей. Эти смеси доводят затем до плотности

5 — 10 ед., предпочтительно 7 — 9 ед. по методу

Мс Farland (а), и, соединяя их между собой, получают комбинированную бактериально-вирусную смесь, рН этой смеси устанавливают

6,4 — 6,8, а затем смешивают с дополнителем, содержащим ионы алюминия в гидроокисном геле, дисперсии окиси алюминия или фосфате алюминия, причем концентрация ионов алюминия в этом дополнителе эквивалентна концентрации ионов алюминия в 10 — 50 мл водного раствора 1,3О/о-ного А1 Оз.

Полученную таким образом композицию инактивируют формальдегидом, р-пропилактоном, гидроксиламином, фенолом или хлороформом, предпочтительно, формальдегидом, излишек которого нейтрализуют подходящим раствором сульфитной соли. Пробы инактивированной композиции отбирают для проведения вирусно-антигенных исследований, а всю массу продукта консервируют парэнтерально приемлемым антисептиком в бактериостатических и фунгистатических количествах. Полученную смесь можно сконцентрировать путем сливания верхних слоев жидкости или использовать без концентрации.

Культуры миксовируса параинфлюэнцы-3 и пастерелл могут быть инактивированы до их смешивания. Смешивать их между собой можно до,или после смешивания с дополнителем.

Предпочтительно вначале смешивать вирусосодержащую культуру с дополнителем, а затем — с инактивированными культурами бактерий, что позволяет исследовать отдельные вирусно-бактерыальные смеси с целью определения оптимального соотношения культуры вируса и бактерий.

Культуры вируса, используемого для изготовления вакцин, должны вызывать ЦПЭ в почечных тканевых культурах через 2 — 5 дней, нейтрализоваться антисывороткой параинфлюэнцы-3, вызывать агглютинацию эритроцитов морской свинки и гемадсорбцию их на зараженных культурах. Титр агглютинации эритроцитов должен быть не ниже 1/40, а зараженность клеток тканевых культур порядка

10 и выше в 1 мл. Вирус выращивают на лакальбуминово-гидролизованной среде Эрла с добавлением или без добавления бычьей сыворотки. Кроме того, в среду можно добавить антибиотики (пенициллин или стрептомицин).

Расплодочные культуры, лиофилизированные дистиллированной водой и подходящим стабилизатором, стерильно высевают .на среду выращивания в количестве 4 — 6 /о ее объема и выращивают до титра 10>, предпочтительно

106 в 1 мл, при температуре 35 — 38 С 2 — 7 дней. Насыщенные вирусом жидкости тканевых культур замораживают для сохранения вируса или сразу (без замораживания) смешивают с бактериосодержащими средами.

1О

15 го

3О

4

Бактерии выращивают на пригодных для этого средах известными методами. Среды для накопления засевают расплодками в количестве 1 — 5 /о от объема среды выращивания и культивируют при 35 — 38 С до бактериального титра 107, предпочтительно 10 жизнеспособных клеток на 1 мл.

Отдельные культуры бактерий можно смешивать с жидкостью, содержащей пликсовирус, и затем — с инактивирующим агентом (фо рмальдегидом), или все три культуры могут быть раздельно инактивированы добавлением к ним,необходимого количества раствора формальдегида. Большое значение имеет соотношение смешиваемых жидкостей, т. к. получаемая смесь должна обладать выше, упомянутой плотностью по Мс Farland (у).

Для регулирования плотности можно также использовать формальдегид. По объему культуры бактерий не должны превышать 25 от полученной смеси.

После приведения отдельных смесей бактерий и вируса к желаемой плотности н получения смеси отдельных .вирусно-бактериальных смесей рН комбинированной смеси регулируют добавлением кислоты, пап|ример 0,1 н.

НС1, или щелочи, например NaOH, до 6,4 — 6,8.

Затем к ней добавляют компонент, содержащий трехвалентные ионы алюминия, например водный раствор подходящей алюминиевой соли или адсорбирующие твердые или водные гели, содержащие ионы алюминия. Например, можно использовать водную гидроокись алюминия, гель окиси алюминия или их водную дисперсию, а также соли алюминия и смешанные соли алюминия и различных кислот. Наиоолее приемлемы водный гель гидроокиси алюминия, .водная суспензия алюминия и гидрат фосфата алюминия которые для большей активности следует брать с избытком (с осадком в жидкой фазе). Эти вещества можно получить реакцией обмена солей в водных растворах или суспензиях с последующим фильтрованием и промывкой и предварительной стерилизацией исходных реактивов.

Компонент, содержащий ионы алюминия, смешивают с вирусно-бактериальной смесью или инактивированной культурой вируса в виде водных растворов или абсорбированных твердых дисперсий, имеющих концентрацию алюминиевой смеси от 0,5 до 5 вес. о/о (предпочтительнее 1 — 2 вес. /О). Причем, добавляемое количество должно быть эквивалентно

10 — 50 мл (предпочтительнее 10 — 30 мл) водного 1 /о-ного раствора окиси алюминия (A1 Оз) на 100 мл культуры, вирусно-бактериальной смеси или инактивированной культуры вируса.

Смесь взбалтывают или перемешивают для получения однородной массы 15 мик. Для инактивации вируса и бактерий добавляют формальдегид в количестве, обеспечивающем инактивацию, 0,075 — 0,125 вес. /О, но не влияющем на ослабление антигенности получаемой вакцины. Формальдегид можно исполь247139

65 зовать в любой форме, обеспечивающей активность альдегида при контакте с вирусом или бактериями, например, триоксиметилен, твердый полиформальдегид или продукты конденсации формальдегида, которые выделяют формальдегид в водной среде. Формальдегидная композиция не должна содержать вещества, которые могли бы повлиять на состав вакцины.

Инактивация вируса и бактерий должна проходить .в течение 6 час. Однако желательно выдерживать обработанные форм альдегидом культуры около 24 час, но не более четырех суток пр и комнатной тем пер атур е. После этого смесь концентрируют, если это необходимо, отделяя часть жидкости. Избыток формальдегида нейтрализуют подходящим абсорбентом, например 10 — 35 /о -ным стериальным раствором бисульфита натрия. Если все три культуры инактивируют отдельно, избыток формальдегида можно нейтрализовать бисульфитом натрия до смешивания вирусный композиции с компонентом, содержащим ионы алюминия.

Образцы окончательного продукта. отбирают для исследований по соответствующим стандартам, (определение оактериологической стерильности и безопасности). После проверки смесь консервируют подходящим парэнтерально приемлемым антисептиком, например хлороформом, фенолом или симерозолом, предпочтительно последним, в концентрации около 0,4 — 0,6 мл 10 -ного раствора на 1 л основного продукта. Готовую вакцину сразу расфасовывают или хранят в холодильнике для накопления.

Проверяют инактивацию вируса путем прививки шести пробирок с монослоями культуры бычьей почечной ткани 0,2 мл вакцины разбавленной 1: 30, взятой из общего объема до консервации антисептиком, с последующим

7 — 9-дневным наблюдением. При отсутствии цитопатического эффекта за этот срок вирус должен рассматриваться инактивированным.

Активность вакцины определяют несколькими методами. По одному из них (метод -емагглютинационного замедления активности) отбирают шесть телят трех — шестимесячного возраста, которые имеют титры замедления активности кровяной сыворотки ниже 1:?О.

Трем из них прививают вакцину путем внутримышечной инъекции, дозы 10 смз с,интервалами между инъекциями в 2 — 3 недели.

Шесть телят содержат вместе. Через 2 — 3 недели после второй инъекции проводят сравнение титров замедления активности, которое должно показать повышение титра сыворотки до 1: 80 и выше у вакцинированных телят при отсутствии значительного повышения в контроле.

Защитные свойства вакцины можно определить также путем сравнения реакции организмов вакцинированных и невакцинированных телят на воздействие комбинации миксовируса параинфлюэнцы-3 и культур бактерий при введении их аэрозольным путем или внутрь

45 дыхательного тракта, или другим подходящим способом. При этом у вакцинированных телят не исключается проявление симптомов транспортной лихорадки, таких как повышение температуры, кашель, раздражение слизистых носовой полости. Такие симптомы наблюдаются и у контрольной группы.

Антигенные свойства вакцины могут быть установлены путем двухкратного введения ее белым мышам весом 15 — 20 г в дозах по 0,2 мл подкожно с интервалом в 10 — 14 дней и последующим введением десятикратно разбавленного вирулентного бульона P. multocida в течение 7 — 14 дней после второй инъекции. Антигенность вакцины считается удовлетворительной, если смертность у вакцин ированных мышей по крайней мере в два раза ниже, чем у контрольных, при расчете LD„no методу

Reed (а) и mucnich (a) .

Вакцину, полученную согласно описанному способу, рекомендуется применять в дозах

2 — 15 смз при внутримышечном или подкожном введении. Рекомендуется вводить также две дозы по 10 смз с интервалом между введениями в 1 — 4 недели.

Вакцину можно объединить с антигенами, вызывающими иммунизацию крупного рогатого скота против других различных заболеваний,,например, вызываемых возбудителями

Вгцсе1lа sp., Clostridium sp., вирус бычьей диарси (BVDV), бычьей инфекционной rinotracheitis (IBR) и им подобных.

Пример. Изготовление вакцины.

Грипсинизированные клетки культуры ткани эмбриональной бычьей почки (ВКТС), извлеченные из корковых участков почки, выращивают в пригодной для роста ВКТС жидкости и при температуре 35 — 37 С до слияния

ВКТС. Затем отделяют верхний слой питательной жидкости и заражают клеточную культуру вирусом параинфлюэнцы-3 (штамм

SF-4) путем внесения 1 мл вируссодержащей жидкости на 99 мл культуры. Вирус культивируют на ВКТС при температуре 35 — 37 С до проявления ЦПЭ у 65 — 100 /о клеток, который наступает обычно через 48 — 96 час. Вируссодержащую жидкость из нескольких сосудов объединяют и после взятия проб для определения НА титра, вирусного титрования и определения плотности массу живой ВКТС, содержащую вирус, инактивируют раствором формальдегида (формалином) (1 ч. формальдегида на 1000 ч. вирусной суспензии), который предварительно разбавляют до 10 /о-ной концентрации средой, содержащей ВКТС.

Инактивацию вируса сопровождают энергичным перемешиванием в течение 15 мин.

Питательная среда для ВКТС представляет собой смесь 24 г соли фенолсульфанилфталеина натрия, 8,160 кг хлористого натрия, 480 г хлористого калия, 246 г сульфата магния, 172,8 г одноосновного фосфата натрия, 1,2 кг глюкозы, 318 г хлорида кальция, 6 кг гидролизата лактальбумина, 672 г бикарбоната натрия, 8,3 г кристаллов пенициллина G, 120 г

247139

25 сульфата стрептомицина и воды, добавленной до 1200 л. Смесь перемешивают 10 мин и стерилизуют при 121 С (250 F) в течение 4 час, охлаждают до комнатной температуры и добавляют 24 л бычьей сыворотки.

Питательная среда для выращивания вируса на ВКТС содержит те же компоненты за исключением фенолсульфонилфталеина натрия и бычьей сыворотки. Кроме того, она содержит 2,бб4 кг бикарбоната натрия вместо б72 г.

Расплодочную культуру P. hemolitica, выращенную на трипсинозно-теаминированном агаре, выдерживают 18 — Зб час при температуре

37 С и впоследствии используют для засева трипсинозно-тиаминированного бульона. Возбудитель культивируют о — 18 час при 35 C в барабанах или бутылях, встряхиваемых в период выращивания, а затем сливают жидкие культуры в стерильные контейнеры. Среду для выращивания засевают 3 об. /о расплодочной культуры.

Плотность полученных культур при фотометрическом определении равна 7 — 8 ед по шкале Мс Farland (а).

Инактивацию культуры P. hemolitica проводят путем обработки раствором формальдегида в течение 48 — 72 час при температуре

35 С. Инактивированная культура сохраняется при 5 С до момента использования.

P. hemolitica выращивают на среде, состоящей из 3,5 кг порошкообразного протеина марки «Nf-case» и витаминизированной композиции, полученной путем вываривания казеина, 1,8 кг дрожжевого экстракта, 1,2 кг триптона, 120 г сульфата магния, 324 г одноосновного фосфата калия, 912 г двухосновного фосфата натрия, 9б0 г глюкозы на 90 л воды, подогретой до температуры 45 С, к которой добавляют дрожжевой автолизат. рН среды устанавливают до 7,2 — 7,3 добавлением l,н.,раствора гидроокиси натрия, а затем общий объем доводят до 120 л дистиллированной водой.

Культуры P. multocida получают так же, как и культуры P. hemolitica, однако среда для выращивания содержит 480 г сахарозы вместо глюкозы. Перед инактивацией формальдегидом проверяют плотность культур.

Перед смешиванием бактериальных и вирус,ных культур для определения их необходимых количеств также проверяют их плотность.

Вирусную культуру перед смешиванием с бактерийными разбавляют, добавляя 360 лл

1,30 /о-ной стерилизованной суспензии окиси алюминия на каждый литр культуры с последующим перемешиванием в течение 15 мин.

Затем ее оставляют при 30 С на 24 час, после чего верхний слой жидкости сливают, чтобы отделить объем, эквивалентный общему обьeiwv разбавленных бактериальны культур плюс 10 — 30 /, от общего объема вируснои культуры и суспензии окиси алюминия. Избыток формальдегида, используемого для инак5

1О

15 го зо

8 тивации смеси культур, нейтрализуют 35О/оным раствором бисульфита натрия.

Консервируют смесь путем добавления симерозола (Merthiolate trade mark) в количестве 0,5 мл,на 1 л вакцины при помешива|нии.

После отбора проб для определения стерильности, антигенных свойств и степени инактивации вируса вакцина хранится при температуре 5 С.

Суспензию окиси алюминия готовят путем разбавления продажного геля окиси алюминия дистиллированной водой, свободной от пирогенов, а полученную суспензию пропускают через мельницу (Eppenbach (а) для получения геля, который затем стерилизуют. Концентрацию геля окиси рассчитывают таким образом, чтобы содержание окиси алюминия составляло 1,3 вес. /о.

Полученную таким образом вакцину испытывают на телятах и морских свинках. Проверка подтверждает безвредность и эффективность вакцины.

Предмет изобрете|ния

1. Способ изготовления вакцины против транспортной лихорадки крупного рогатого скота из культур возбудителей P asteurell a

hemolitica u P. пшИосЫа и культуры миксовируса параинфлюэнцы-3 путем смешения их с дополнителем, инактивации, концентрирования и консервирования полученной композиции, отличающийся тем, что, с целью обеспечения свойств вакцины, создающих надежный иммунитет против транспортной лихорадки, культуры возбудителей Pasteurella hemolitica и P. multocida после их выращивания на питательных средах смешивают раздельно с культурой м иксовируса параинфлюэнцы-3, выращенного в культуре клеток почечной ткани, а затем объединяют полученные вирусно-бактериальные смеси между собой и вводят дополнитель, содержащий ионы алюминия, с последующей или предварительной инактивацией соответствующим инактивирующим агентом, преимущественно формальдегидом, и нейтрализацией его избытка соответствующим абсорбентом, например бисульфитом щелочного металла, и консервируют путем дооавления парэнтерально приемлемого антисептика, например симерозола.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при смешивании культур бактерий с культурой вируса плотность отдельных вирусно-бактериальных смесей выравнивают до 5 — 10 ед. по методу Мс Farland (а), а после смешения между собой этих отдельных смесей устанавливают рН полученной смеси до б,4 — б,8.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что полученную смесь культур возбудителей смешивают с дополнителем, содержащим ионы алюминия, например, в гидроокисном геле, концентрация которых эквивалентна концентрации ионов алюминия в 10 — 50 мл водного раствора, содержащего 1,3% AlgOg.

247139

Составитель А. Леонов

Техред Л. В. Куклина Корректор Г. И. Тарасова

Редактор С. Лазарева

Заказ 2887/17 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Раушская, д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после выращивания миксовируса до момента проявления цитопатического эффекта у

50 — 70о о клеток жидкую тканввую культуру, содержащую вирус, охлаждают перед смешиванием ее с бактериальными культурами.