Лечение и предупреждение нейродегенеративных заболеваний с использованием генной терапии

Лечение и предупреждение нейродегенеративных заболеваний с использованием генной терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении предложены композиции и способы лечения и/или предупреждения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. В некоторых аспектах данные композиции и способы относятся к адоптивным клеточным терапиям и к ДНК-иммунизации.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Нейровоспаление связано с патологией болезни Альцгеймера (БА) (Chen, K. et al., 281 Peptide J.Biol. Chem. 3651-59 (2006) и Frenkel, D. et al., 115 J.Clin. Inves. 2423-33 (2005)). Нейровоспаление включает накопление большого количества активированной микроглии и астроцитов, а также небольших количеств Т-клеток, прикрепляющихся в основном к посткапиллярным венулам (Agadjanyan, M.G. et al., 174 J. Immunol. 1580-86 (2005); Dickson, D. et al., 7 Glia 75-83 (1993); и Fillit, H. et al., 129 Neurosci. Lett. 318-20 (1991)). Было показано, что и микроглия, и астроциты генерируют β-амилоидный белок (Аβ), один из главных патологических признаков БА. Было показано, что сам Аβ действует как провоспалительный агент, вызывающий активацию многих воспалительных компонентов. Сопутствующие биохимические изменения включают появление или повышающую регуляцию многочисленных молекул, характерных для воспаления и свободнорадикальной атаки. Особенно важными могут быть белки комплемента, агенты острой фазы и воспалительные цитокины. Пациенты, которые принимают нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, имеют меньший риск БА, чем пациенты, которые не принимают их. Эти результаты привели к повышенному интересу к проведению противовоспалительной терапии БА (Fillit, H. 1991).

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хотя нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, классически не рассматриваются как опосредованные воспалением или иммунной системой, в некоторых случаях иммунная система играет важную роль в дегенеративных процессах. Для лечения БА ранее были разработаны иммунотерапевтические подходы, предназначенные для индукции гуморального иммунного ответа. Эти исследования привели к клиническим испытаниям на людях, которые привели как к полезным, так и вредным эффектам. В животных моделях было показано, что иммунотерапия, предназначенная для индукции клеточного иммунного ответа, может быть полезной при повреждении центральной нервной системы, хотя Т-клетки могут оказывать либо полезный, либо вредный эффект, в зависимости от типа индуцированного Т-клеточного ответа. Эти исследования дали новое направление для исследования терапии нейродегенеративных заболеваний на основе иммунной системы.

Адаптивная иммунная система может быть широко классифицирована на два типа ответов: клеточные и гуморальные (антительные) типы ответов. Среди клеточных ответов идентифицировали три главных типа или класса иммунного ответа, которые играют решающую роль в понимании механизмов регуляции воспалительного процесса, например, Th1-ответ (вовлекающий, например, IFN-γ (интерферон-гамма)) в отличие от Th2- и Th3-ответов (вовлекающих, например, IL-4 (интерлейкин-4), IL-10, IL-13 и TGF-β (трансформирующий фактор роста бета)). Разные классы Т-клеточных ответов имеют важные последствия для разработки стратегии вакцинации против болезни Альцгеймера.

В данном изобретении предложены композиции и способы лечения и/или предупреждения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. В некоторых аспектах данные композиции и способы относятся к ДНК-вакцинам и адоптивным клеточным генным терапиям для лечения или облегчения симптомов нейродегенеративного заболевания. В некоторых конкретных аспектах данные композиции и способы относятся к ДНК-вакцинам, кодирующим элемент клеточного иммунного ответа, такой как Th2 или Th3 цитокин.

В одном аспекте предложен способ лечения или облегчения симптомов нейродегенеративного заболевания, который включает введение композиции, которая индуцирует клеточный иммунный ответ. В другом аспекте предложен способ лечения или облегчения симптомов нейродегенеративного заболевания путем введения композиции, которая индуцирует клеточный иммунный ответ, путем введения композиции, которая включает элемент клеточного иммунного ответа; предпочтительно элементом клеточного иммунного ответа является белок, пептид, нуклеиновая кислота или полинуклеотид. В родственном аспекте также предложен способ лечения или облегчения симптомов нейродегенеративного заболевания, который включает введение двух или более; трех или более; четырех или более; пяти или более; или шести или более элементов клеточного иммунного ответа. В другом аспекте также предложен способ изготовления композиции для лечения или профилактики нейродегенеративного заболевания, который может включать получение полинуклеотида или его фрагмента с промотором/энхансером, транскрипционно связанным с последовательностью, кодирующей ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент. В родственном аспекте предложен способ получения композиции для экспрессии полинуклеотида элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмента у субъекта, который включает получение полинуклеотида с промотором/энхансером, транскрипционно связанным с последовательностью, кодирующей ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент; и объединение вещества, облегчающего трансфекцию, с указанным полинуклеотидом. Также предложены композиции и способы введения млекопитающему, предпочтительно человеку. В другом аспекте композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа. В некоторых аспектах предложен набор, который может включать контейнер, подходящий для хранения фармацевтического препарата для введения субъекту, предпочтительно человеку; полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа, фармацевтически приемлемый носитель и этикетку, приклеенную к контейнеру, или вкладыш в упаковку. В других аспектах предложены способы введения полипептидного гомолога полипептида элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмента.

В некоторых воплощениях предложена композиция, которая индуцирует элемент клеточного иммунного ответа. Данные способы и композиции могут включать белок, нуклеиновую кислоту или полинуклеотид; предпочтительно, полинуклеотид и/или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК; предпочтительно, полинуклеотид представляет собой кольцевую ДНК; предпочтительно, полинуклеотид представляет собой плазмиду; предпочтительно, полинуклеотид включает промотор/энхансер, транскрипционно связанный с последовательностью, кодирующей ген элемента клеточного иммунного ответа; предпочтительно, полинуклеотид включает участок начала репликации (ORI); предпочтительно, полинуклеотид включает сайт множественного клонирования (MCS); предпочтительно, промотор подходит для экспрессии в эукариотических клетках; в некоторых предпочтительных воплощениях полинуклеотид представляет собой вектор, предпочтительно вирусный вектор; в других предпочтительных воплощениях полинуклеотид представляет собой РНК; предпочтительно, полинуклеотид представляет собой двухцепочечную РНК; предпочтительно, полинуклеотид представляет собой короткую интерферирующую РНК (киРНК); или предпочтительно более чем одну композицию, которая уменьшает воспаление, можно вводить одновременно. В некоторых воплощениях один элемент клеточного иммунного ответа находится на одном полинуклеотиде или плазмиде; в других воплощениях более чем один элемент клеточного иммунного ответа может находиться на одном полинуклеотиде или плазмиде. В других воплощениях один полинуклеотид или плазмида включает один или более чем один элемент клеточного иммунного ответа и дополнительно включает один или более полипептидов или его фрагменты, которые, как известно, лечат или облегчают симптомы нейродегенеративного заболевания (например нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), фактор роста нервов (NGF), β-амилоид, β-амилоидные пептиды 1-42 (β-амилоид_1-42), аполипопротеин Е (АроЕ) или АроЕ-2.

Другие воплощения относятся к введению белков, пептидов и/или полипептидов элемента клеточного иммунного ответа. В других воплощениях предложены способы введения нуклеиновых кислот и/или полинуклеотидов, кодирующих полипептиды элементов клеточного иммунного ответа. Данные композиции можно получать и вводить таким способом, что у субъекта, которому вводят композицию, экспрессируется полипептид элемента клеточного иммунного ответа. Композиции могут включать системы экспрессии, системы доставки и кодирующие последовательности иммунорегуляторных генов, таких как противовоспалительные цитокины, агонисты цитокинов или антитела против TNF (фактор некроза опухолей). Предпочтительно, элемент клеточного иммунного ответа из данных способов и композиций увеличивает (экспрессию) гена, который снижает воспаление; предпочтительно, увеличение экспрессии гена происходит путем повышающей регуляции экспрессии;

предпочтительно, ген, который уменьшает воспаление, представляет собой Th2-цитокин; предпочтительно, Th2-цитокин представляет собой IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 или TGF-β; в других предпочтительных воплощениях композиция, содержащая элемент клеточного иммунного ответа, ингибирует или ослабляет ген, который увеличивает воспаление; предпочтительно, геном, который увеличивает воспаление, представляет собой Тh1-цитокин; предпочтительно, ослабление экспрессии гена осуществляется путем понижающей регуляции экспрессии; предпочтительно, Th1-цитокин представляет собой IL-2, IL-12 или TNFα, в некоторых воплощениях композиция оказывает влияние на регуляцию путем стимуляции экспрессии или продукции гена, который уменьшает воспаление, тогда как в других воплощениях композиция оказывает влияние на регуляцию путем ингибирования экспрессии гена, который усиливает стимуляцию, такого как антагонист Th1.

Неожиданно показали, как описано в Примерах 3 и 4, что введение полинуклеотида, кодирующего IFN-γ, может лечить или предупреждать эффекты болезни Альцгеймера в животных моделях. Несмотря на то, что IFN-γ представляет собой Th1-цитокин, было показано, что его введение в качестве генной вакцины минимизирует эффекты нейродегенеративного заболевания. Поэтому композиции и способы, включающие полинуклеотиды, кодирующие IFN-γ или кодирующие полипептидный гомолог IFN-γ, предложены в данном изобретении в качестве способа лечения и/или облегчения симптомов нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, у субъекта, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека.

В некоторых воплощениях элемент клеточного иммунного ответа включает ген или белок, кодирующий аутоантиген, цитокин, снижающий аутоиммунное воспаление, антагонист цитокина, повышающего аутоиммунное воспаление, или ген, который индуцирует анергию, или их фрагменты; предпочтительно, элемент клеточного иммунного ответа представляет собой или гомологичен интерлейкину (IL)-4, IL-5, IL-10, IL-13, трансформирующему фактору роста бета (TFG-β) или интерферону-гамма (IFN-γ), или их фрагментам.

В предпочтительных воплощениях дополнительно вводится элемент клеточного иммунного ответа с нуклеиновой кислотой или белком, кодирующим полипептид, который дополнительно лечит и/или уменьшает эффекты нейродегенеративного заболевания, или его фрагменты; предпочтительно, дополнительный ген или белок, кодирующий полипептид, представляет собой или гомологичен мозговому нейротрофному фактору (BDNF), фактору роста нервов (NGF), β-амилоиду, β-амилоидным пептидам 1-42 (β-амилоид_1-42), аполипопротеину Е (АроЕ) или АроЕ-2.

В других предпочтительных воплощениях композиции и способы, индуцирующие клеточный иммунный ответ, включают доставку посредством адоптивной клеточной генной терапии. Предпочтительно, тип клетки, используемой для адоптивной клеточной терапии, является аутологичным или неаутологичным; предпочтительно, типом клетки, используемой для адоптивной клеточной терапии, является Т-клетка, антигенпредставляющая клетка, фибробласт или стволовая клетка; предпочтительно, типом клетки, используемой для адоптивной клеточной генной терапии, является дендритная клетка; клетка NIH3T3, неаутологичные стволовые клетки, такие как клетки из Американской коллекции типовых культур (АТСС) или аутологичная стволовая клетка.

В некоторых воплощениях описанные в данном изобретении полинуклеотиды вводят пациенту с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых воплощениях полинуклеотид включает эукариотический промотор; предпочтительно, данный эукариотический промотор обеспечивает экспрессию у человека. В некоторых воплощениях полинуклеотид представляет собой плазмиду в комплексе с промотором/энхансером, транскрипционно связанным с последовательностью, кодирующей элемент клеточного иммунного ответа. В некоторых воплощениях полинуклеотид представляет собой вирусный вектор. В некоторых воплощениях полинуклеотид вводят с реагентом липофекции. В некоторых воплощениях способы могут включать один или более способов введения предложенных в данном изобретении композиций, выбранных из группы, состоящей из внутривенного, инраназального, подкожного, посредством инъекции, посредством ингаляции или посредством генной пушки.

В некоторых предпочтительных воплощениях предложенных в данном изобретении способов полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент, вводят млекопитающему; более предпочтительно млекопитающим является человек; предпочтительно, полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую ген элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент, вводят вместе с веществом, облегчающим трансфекцию; предпочтительно, вещество, облегчающее трансфекцию, включает липид; предпочтительно, полинуклеотид вводят в фармацевтически приемлемом носителе; в некоторых предпочтительных воплощениях полинуклеотид вводят посредством вирусной трансдукции; предпочтительно, полинуклеотид вводят посредством генной пушки; предпочтительно, полинуклеотид вводят посредством ингаляции; или, предпочтительно, полинуклеотид вводят посредством инъекции, или, предпочтительно, подкожной инъекции, или, предпочтительно, внутримышечной инъекции.

В некоторых воплощениях композиции содержат полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент; предпочтительно, композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель; предпочтительно, композиция содержит вещество, облегчающее трансфекцию; предпочтительно, вещество, облегчающее трансфекцию, включает липид; предпочтительно, композицию вводят с адъювантом; предпочтительно, композиция подходит для инъекции млекопитающему, предпочтительно млекопитающим является человек; предпочтительно, композиция подходит для ингаляции млекопитающему, предпочтительно млекопитающим является человек; предпочтительно, композиция заключена в фармацевтически приемлемом носителе, предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель имеет этикетку, указывающую его состав, и инструкцию относительно введения полинуклеотида; предпочтительно, композиция включает вкладыш в упаковку, предпочтительно вкладыш в упаковку включает выписку о составе композиции, более предпочтительно вкладыш в упаковку включает инструкции относительно дозировки.

Используемый в данном изобретении термин "антиген" относится в широком смысле к любой композиции, к которой индивидуум может вырабатывать иммунный ответ. Используемый в данном изобретении термин "антиген" относится в широком смысле к молекуле, которая содержит по меньшей мере одну антигенную детерминанту, на которую может быть направлен иммунный ответ. Иммунный ответ может быть клеточно-опосредованным или гуморальным, или и тем, и другим. Как общеизвестно в данной области, антиген может представлять собой белок по своей природе, углевод по своей природе, липид по своей природе, нуклеиновую кислоту по своей природе или комбинации этих биомолекул. Например, антиген может включать неприродные молекулы, такие как полимеры и тому подобное. Антигены включают аутоантигены и чужеродные антигены, такие как антигены, продуцируемые другим животным, или антигены из инфекционного агента. Антигены инфекционного агента могут быть бактериальными, вирусными, грибковыми, протозойными и тому подобным.

Используемый в данном изобретении термин "аутологичный" используется в связи с выделением клеток из субъекта, возможно с изменением данных этих клеток, или с сохранением клеток и повторной инфузией этих клеток обратно субъекту.

Используемый в данном изобретении термин "кодирующая область" или "кодирующая последовательность" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, ее комплементарной последовательности или ее части, которая кодирует конкретный генный продукт или его фрагмент, экспрессия которого является желательной, согласно нормальным взаимосвязям по спариванию оснований и использованию кодонов. Кодирующие последовательности включают экзоны в геномной ДНК или незрелых первичных транскриптах РНК, которые связаны вместе посредством биохимических механизмов в клетке с образованием зрелой мРНК. Антисмысловая цепь комплементарна такой нуклеиновой кислоте, и кодирующая последовательность может быть выведена из нее. Кодирующая последовательность размещена в зависимости от элементов, контролирующих транскрипцию, и кодонов инициации и терминации трансляции так, что будет продуцироваться транскрипт правильной длины, который будет приводить к трансляции в подходящей рамке считывания с образованием функционального желаемого продукта.

Используемый в данном изобретении термин "комплемент", "комплементарный" или "комплементарность" относится к полинуклеотидам (т.е. к последовательности нуклеотидов, такой как олигонуклеотид или целевая нуклеиновая кислота) согласно стандартным правилам спаривания Уотсона/Крика. Последовательность, комплементарная последовательности нуклеиновой кислоты, находится в "антипараллельной ассоциации", так что 5'-конец одной последовательности спаривается с 3'-концом другой последовательности. Например, последовательность "5'-A-G-T-3'" комлементарна последовательности "3'-Т-С-А-5'". В описанные в данном изобретении нуклеиновые кислоты могут быть включены некоторые нуклеотиды, обычно не встречающиеся в природных нуклеиновых кислотах; они включают, например, инозин, 7-деазагуанин, закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), пептид-нуклеиновые кислоты (PNA). Комплементарной последовательностью также может быть последовательность РНК, комплементарная последовательности ДНК, или ее комплементарной последовательности, и также может быть кДНК. Комплементарность не обязательно должна быть идеальной; стабильные дуплексы могут содержать неправильно спаренные пары оснований, вырожденные или неспаренные основания. Специалисты в области технологии нуклеиновых кислот могут эмпирически определить стабильность дуплекса, рассматривая целый ряд переменных, включающих, например, длину олигонуклеотида, состав оснований и последовательность олигонуклеотида, ионную силу и частоту неправильно спаренных пар оснований.

Комплементарность может быть "частичной", при которой только некоторые нуклеотидные основания двух цепей нуклеиновой кислоты соответствуют согласно правилам спаривания оснований. Комплементарность может быть "полной" или "абсолютной", когда все нуклеотидные основания двух цепей нуклеиновой кислоты спариваются согласно правилам спаривания оснований. Комплементарность может отсутствовать, когда ни одно из нуклеотидных оснований двух цепей нуклеиновой кислоты не спариваются согласно правилам спаривания оснований. Степень комплементарности между цепями нуклеиновой кислоты оказывает значительные эффекты на эффективность и силу гибридизации между цепями нуклеиновой кислоты. Это особенно важно в реакциях амплификации, а также в методах детекции, которые зависят от связывания между нуклеиновыми кислотами. Любой из терминов также может быть использован в отношении индивидуальных нуклеотидов, особенно в контексте полинуклеотидов. Например, конкретный нуклеотид в олигонуклеотиде может быть известен своей комплементарностью или ее отсутствием к нуклеотиду в другой цепи нуклеиновой кислоты в отличие или по сравнению с комплементарностью между остальной частью олигонуклеотида и данной цепью нуклеиновой кислоты.

Используемый в данном изобретении термин "по существу комплементарный" относится к двум последовательностям, которые гибридизуются в жестких условиях гидридизации. Специалисту в данной области будет понятно, что по существу комплементарные последовательности не обязательно гибридизуются по всей их длине. В частности, по существу комплементарные последовательности содержат смежные последовательности оснований, которые не гибридизуются с целевой последовательностью, расположенные 3' и 5' по отношению к смежной последовательности оснований, которые гибридизуются с целевой последовательностью в жестких условиях гидридизации.

Используемый в данном изобретении термин "дендритная клетка" (ДК) относится к антигенпредставляющей клетке (АПК), которая может происходить из гематопоэтической стволовой клетки. ДК могут быть получены из многих лимфоидных и нелимфоидных тканей, а также из периферической крови и костного мозга. У людей гематопоэтические стволовые клетки, такие как клетки CD34+, можно искусственно дифференцировать в ДК in vitro. Дендритная клетка имеет характерную морфологию с тонкими складками (ламеллоподиями), простирающимися от тела дендритной клетки в нескольких направлениях. Несколько фенотипических критериев также являются типичными, но могут варьировать в зависимости от источника дендритной клетки. Они включают высокие уровни молекул МНС (главный комплекс гистосовместимости) и костимулирующих молекул (например В7-1 и В7-2), отсутствие маркеров, специфичных для гранулоцитов, NK-клеток, В-клеток и Т-клеток. У мышей некоторые (но не все) дендритные клетки экспрессируют 33D1 (ДК из селезенки и пейеровых бляшек, но не кожи или медуллярной области тимуса), NLDC145 (ДК в коже и Т-зависимых участках некоторых лимфоидных органов) и CD11C (Cd11c также реагирует с макрофагом). Дендритные клетки способны инициировать первичные Т-клеточные ответы in vitro и in vivo. Эти ответы являются антигенспецифичными. Дендритные клетки направляют сильную реакцию смешанных лейкоцитов (MLR) по сравнению с лейкоцитами периферической крови, спленоцитами, В-клетками и моноцитами.

Используемый в данном изобретении термин "экспрессия" относится к биологической продукции продукта, кодируемого кодирующей последовательностью. В большинстве случаев последовательность ДНК, включая кодирующую последовательность, транскрибируется с образованием матричной РНК (мРНК). Матричная РНК транслируется с образованием полипептидного продукта, который имеет биологическую активность. Однако в некоторых случаях РНК продукт может иметь релевантную активность и, таким образом, рассматривался бы как генный продукт. Экспрессия может включать дополнительные стадии процессинга продукта транскрипции РНК, такие как сплайсинг для удаления интронов и/или посттрансляционный процессинг полипептидного продукта.

Термины, относящиеся к иммунологической толерантности, в том виде, как они используются в данном изобретении, относятся к приобретению нечувствительности к аутоантигенам. Способность различать аутоантигены и не-аутоантигены является существенной для сохранения организма. Иммунологическая толерантность дополнительно описана в Seroogy, C.M., et al., Gene Therapy, vol.7, p.9-13 (2000); Costa, G.L, et al., J. Immunol., vol.164, p.3581-90 (2000); и (Weiner, H.L, etal., NYAcad. Sci., vol.778, p.xiii-xviii (1996).

Используемый в данном изобретении термин "элемент клеточного иммунного ответа" относится к любой молекуле, которая индуцирует клеточный иммунный ответ. Предпочтительно, клеточный иммунный ответ является ответом Th2- или Th3-типа. Предпочтительно, молекула представляет собой белок, пептид, полипептид, нуклеиновую кислоту, олигонуклеотид или полинуклеотид. Некоторые элементы клеточного иммунного ответа хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются этим, молекулы, которые могут осуществлять повышающую регуляцию или продуцировать полипептиды, которые уменьшают аутоиммунное воспаление, которые включают, но не ограничиваются этим, полипептиды IL-4 (т.е. № доступа в GenBank M13982; SEQ ID NO: 12) и IL-10 (а именно № доступа в GenBank М57627; SEQ ID NO: 14) и нуклеиновые кислоты, кодирующие IL-4 и IL-10 (а именно SEQ ID NO: 1 и 3). Элементы клеточного иммунного ответа также могут осуществлять понижающую регуляцию или ингибировать полипептиды, которые увеличивают аутоиммунное воспаление, которые включают, но не ограничиваются этим, полипептид TGF-β (а именно № доступа в GenBank М60316; SEQ ID NO: 16) и нуклеиновые кислоты, кодирующие TGF-β (а именно SEQ ID NO: 5). Однако следует понимать, что другие элементы клеточного иммунного ответа включают элементы, известные в данной области, и элементы, еще не идентифицированные. Предпочтительно, полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент имеет аминокислотную последовательность, которая гомологична аминокислотной последовательности элемента клеточного иммунного ответа, как предложено в данном изобретении, т.е. SEQ ID NO: 12-22. В некоторых предпочтительных воплощениях фрагмент элемента клеточного иммунного ответа имеет по меньшей мере 25 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 50 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 150 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 200 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 250 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 300 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 400 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 500 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 600 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 700 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 800 аминокислот, которые гомологичны элементу клеточного иммунного ответа, как предложено в данном изобретении, т.е. SEQ ID NO: 12-22. Термин "гомологичный", когда он в данном изобретении относится к аминокислотной последовательности, означает, что данная аминокислотная последовательность по меньшей мере на 70%, более предпочтительно на 75%, более предпочтительно на 80%, более предпочтительно на 85%, более предпочтительно на 90%, более предпочтительно на 95%, более предпочтительно на 98% и наиболее предпочтительно на 100% идентична известной аминокислотной последовательности (например SEQ ID NO: 12-22). Используемый в данном изобретении термин "реагент липофекции" относится к веществу, используемому для включения генетического материала в клетку посредством липосом. Примеры липофекциих реагентов включают липофектин, липофектамин, катионные липиды и нейтральные солипиды.

Используемый в данном изобретении термин "плазмида" относится к конструкции, сделанной из генетического материала (т.е. из нуклеиновых кислот). Она включает генетические элементы, расположенные таким образом, что встроенная кодирующая последовательность может транскрибироваться в эукариотических клетках. Хотя плазмида может включать последовательность из вирусной нуклеиновой кислоты, такая вирусная последовательность не вызывает включения плазмиды в вирусную частицу и поэтому плазмида представляет собой невирусный вектор. Предпочтительно, плазмида представляет собой замкнутую кольцевую нуклеиновую кислоту. Предпочтительно, нуклеиновая кислота представляет собой ДНК или РНК. Предпочтительно, плазмиды можно вводить в клетки посредством трансформации и можно автономно реплицировать в клетке.

Используемый в данном изобретении термин "фармацевтически приемлемый" относится к композиции, подходящей для введения человеку. Специалисты в данной области понимают, что для того, чтобы композиция была подходящей для введения человеку, она должна удовлетворять определенным критериям, например, данная композиция предпочтительно соответствует качественной лабораторной практике (Good Laboratory Practices) (GLP); предпочтительно, данная композиция соответствует надлежащей практике организации производства (Good Manufacturing Practices) (GMP); более предпочтительно данная композиция соответствует нормативным актам, таким как нормативные акты, разработанные Управлением США по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств; предпочтительно, данная композиция соответствует 21 U.S.С. (Свод законов США) §301-392.

Используемые в данном изобретении термины "начало репликации" или "участок начала репликации" относятся к нуклеотидной последовательности, в которой начинается синтез ДНК с целью репликации последовательности нуклеиновой кислоты. Его обычно называют сайт ORI. Кольцевая (ДНК) бактерий обычно имеет один сайт ORI, тогда как на каждой эукариотической хромосоме может быть много сайтов ORI. Этот термин включает репликоны, которые, при использовании в данном изобретении, относятся к генетическому элементу, который во время репликации ДНК ведет себя как автономная единица. У бактерий хромосома функционирует как один репликон, тогда как эукариотические хромосомы содержат сотни репликонов, расположенных последовательно.

Термин "транскрипционная единица" или "экспрессионная кассета" относится к нуклеотидной последовательности, которая содержит по меньшей мере одну кодирующую последовательность вместе с элементами последовательности, которые управляют инициацией и терминацией транскрипции. Однако транскрипционная единица может включать дополнительные последовательности, которые могут включать последовательности, участвующие в посттранскрипционных или посттрансляционных процессах.

Используемый в данном изобретении термин "последовательность, регулирующая транскрипцию" относится к последовательности, которая регулирует скорость транскрипции транскрипционно связанной кодирующей области. Данный термин может включать такие элементы, как промоторы, операторы и энхансеры. Предпочтительно, последовательности, регулирующие транскрипцию, будут включать по меньшей мере одну промоторную последовательность.

Используемый в данном изобретении термин "транскрипционно связанный" относится к системе, подходящей для транскрипции, причем транскрипция будет инициироваться под управлением регуляторной последовательности и продолжаться вплоть до последовательностей, которые транскрипционно связаны с этой регуляторной последовательностью. Предпочтительно, в образующемся транскрипте не создается мутации, которая изменила бы образующийся продукт трансляции. Например, "транскрипционно связанный" обычно означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторной лидерной последовательности, являются смежными и в фазе считывания. Однако энхансеры не должны быть смежными. Связывание осуществляется путем лигирования по удобным сайтам рестрикции. Если такие сайты не существуют, то можно использовать синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры согласно традиционной практике.

Используемый в данном изобретении термин "5'-нетранслируемая область" или "5'-UTR" относится к последовательности, расположенной 3' относительно промоторной области и 5' относительно нижерасположенной кодирующей области. Таким образом, такая последовательность при транскрипции находится выше (т.е. 5') кодона, инициирующего трансляцию, и, следовательно, обычно не транслируется в участок полипептидного продукта.

Используемый в данном изобретении термин "3'-нетранслируемая область/поли(А)-сигнал" или "3'-UTR поли(А)-сигнал" представляет собой последовательность, расположенную ниже (т.е. 3') области, кодирующей полипептид. Как и в случае с 5'-UTR, эта область обычно транскрибируется, но не транслируется. Для экспрессии в эукариотических клетках обычно предпочтительно включать последовательность, которая сигнализирует добавление поли-А хвоста. Как и в случае с другими синтетическими генетическими элементами, синтетический 3'-UTR/поли(А)-сигнал имеет последовательность, которая отличается от встречающихся в природе UTR-элементов.

Используемый в данном изобретении термин "цитомегаловирусные промоторные/энхансерные последовательности" относится к последовательностям из цитомегаловируса, которые являются функциональными в эукариотических клетках в качестве транскрипционного промотора и расположенной выше энхансерной последовательности. Энхансерная последовательность позволяет транскрипции протекать с более высокой частотой с ассоциированного промотора.

Описанные в данном изобретении плазмиды могут включать одно или более чем одно из следующего: промотор, 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), 3'-UTR/поли(А)-сигнал, и интроны могут представлять собой синтетическую последовательность. В этом контексте термин "синтетическая" относится к последовательности, которая не представлена непосредственно последовательностью встречающегося в природе генетического элемента этого типа, но скорее представляет собой искусственно созданную последовательность (т.е. созданную индивидуумом молекулярно-биологическими способами). Несмотря на то, что один или более участков такой синтетической последовательности могут быть идентичными участкам встречающихся в природе последовательностей, полная последовательность в пределах заданного генетического элемента отличается от встречающегося в природе генетического элемента этого типа. Применение таких синтетических генетических элементов позволяет соответствующим образом конструировать функциональные характеристики этого элемента для желательной функции.

Используемый в данном изобретении "полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент" относится к полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует пептид или белок, способный индуцировать клеточный иммунный ответ, как определено в данном изобретении. Подразумевается, что существует много разных нуклеотидных последовательностей, которые могли бы кодировать одну полипептидную последовательность на основе нормальных взаимосязей при спаривании оснований и использовании кодонов. Как таковой, данный термин относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент. В некоторых предпочтительных воплощениях полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент, включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, гомологичный IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 или TGF-P, или его фрагменты. Предпочтительно, полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмент, включает непрерывный отрезок из по меньшей мере 50 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 100 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 300 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 600 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 1000 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 1500 нуклеотидов; более предпочтительно по меньшей мере 2000 нуклеотидов, которые гомологичны последовательности, кодирующей полипептиды IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β или IFN-γ (как показано в SEQ ID NO: 1-6). Термин "гомологичный", когда он относится в данном изобретении к нуклеотидной последовательности, означает, что данная нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 70%, более предпочтительно на 75%, более предпочтительно на 80%, более предпочтительно на 85%, более предпочтительно на 90%, более предпочтительно на 95%, более предпочтительно на 98% или наболее предпочтительно на 100% идентична известной нуклеотидной последовательности (например последовательностям, кодирующим IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, TGF-β или IFN-γ, как они представлены в SEQ ID NO: 1-6). Подразумевается, что полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую полипептид элемента клеточного иммунного ответа, может содержать допо