Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот

Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, содержащей мутантную аденилатциклазу.

Описание предшествующего уровня техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, включая трансформацию микроорганизмов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Другие методы увеличения продукции включают повышение активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшение чувствительности целевого фермента к ингибированию по типу обратной связи продуцируемой L-аминокислотой (см., например, международную заявку WO 95/16042 или патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).

Было показано, что мутанты Е.coli K-12, дефицитные по аденилатциклазе (Cya) и катаболитному белку-активатору (Crp) растут на минимальной глюкозной среде медленнее, чем их родительские штаммы. Скорость их роста заметно снижалась при повышенном значении рН - между 6 и 7.8. Было показано, что такая чувствительность к значению рН является прямым следствием мутации cya, поскольку мутация устойчивости к повышенному рН также восстанавливала способность к ферментации различных сахаров. Протонзависимый транспорт пролина и глутамата также снижался и был чувствителен к рН в cya-мутантах. Значение активности мембраносвязанной АТФазы было нормальным. Скорость поглощения клетками кислорода хотя и была снижена, но была не чувствительна к рН (Ahmad D, Newman ЕВ. J Bacteriol.; 170(8):3443-7(1988)).

Обнаружено, что дефицитные по аденилатциклазе (cya) мутанты Е.coli K-12 устойчивы к фосмидомицину, специфическому ингибитору не мевалонатного пути, как к фосфомицину. Мутанты Е.coli по glpT были устойчивы к фосфомицину, так же как и к фосмидомицину. Этот факт доказывает, что фосмидомицин траспортировался внутрь через глицерол-3-фосфатный транспортер, GlpT. Анализ с использованием микрочипов ДНК показал, что транскрипция glpT и других генов, имеющих отношение к утилизации глицерина, в значительной степени зависит от присутствия цАМФ (Sakamoto Y, et. al., Biosci Biotechnol Biochem.; 67(9):2030-3(2003)).

В настоящее время нет сообщений, описывающих использование бактерии, содержащей мутантную аденилатциклазу, для получения L-аминокислот.

Описание изобретения

Цели настоящего изобретения включают повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения неароматической или ароматической L-аминокислот с использованием этих штаммов.

Вышеупомянутые цели были достигнуты путем установления того факта, что мутация в аденилатциклазе может привести к повышению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Целью настоящего изобретения является предоставление мутантной аденилатциклазы, выбранной из группы, состоящей из:

(A) белка, в котором L-лизин в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO:2, замещен другим аминокислотным остатком; и

(B) варианта белка (А), обладающего аденилатциклазной активностью.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутой мутантной аденилатциклазы, отличающейся тем, что L-лизин в положении, соответствующем положению 432 в SEQ ID NO:2, замещен L-глутамином.

Также целью настоящего изобретения является предоставление ДНК, кодирующей упомянутую мутантную аденилатциклазу.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии семейства Enterobacteriaceae, содержащей упомянутую ДНК.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутой бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия способна к продукции L-аминокислот.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутой бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутой бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия - Escherichia coli.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, включающего выращивание упомянутой бактерии в питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода этанол или глицерин, и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутого способа, отличающегося тем, что указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутого способа, отличающегося тем, что указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.

Также целью настоящего изобретения является предоставление упомянутого способа, отличающегося тем, что указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-греонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

1. Мутантная аденилатциклаза и кодирующий ее фрагмент ДНК согласно настоящему изобретению.

Ген cyaA (синонимы: ECK3800, b3806) кодирует белок Cya, аденилатциклазу (синоним В3806). Ген cyaA (нуклеотиды с 3,989,176 по 3,991,722; в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi; 49175990) расположен между геном hemC, ориентированным в противоположном направлении, и геном cyaY, ориентированным в противоположном направлении, на хромосоме Е.coli штамма K-12. Нуклеотидная последовательность гена cyaA и аминокислотная последовательность белка Cya, кодируемого геном cyaA, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно.

Фраза "активность аденилатциклазы" означает активность, катализирующую синтез циклической АМФ (сАМР) путем внутримолекулярного переноса аденилильной группы АТФ на 3'-гидроксигруппу с высвобождением пирофосфата. Активность аденилатциклазы может быть определена, например, с использованием метода, описанного Yang J.K. and Epstein W. (J Biol Chem.; 258(6):3750-8(1983)).

Аденилатциклаза с заменой аминокислотного остатка, соответствующего положению 432 в SEQ ID NO:2, может быть упомянута как "мутантная аденилатциклаза", ДНК, кодирующая мутантную аденилатциклазу, может быть упомянута как "мутантный ген cyaA" или "мутантный ген аденилатциклазы", а аденилатциклаза без замены может быть упомянута как "аденилатциклаза дикого типа".

Согласно настоящему изобретению, "остаток L-аминокислоты, соответствующий положению 432" означает аминокислотный остаток, соответствующий аминокислотному остатку в положении 432 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.

Положение аминокислотного остатка может меняться. Например, если в N-концевой области имеет место вставка аминокислотного остатка, аминокислотный остаток, изначально локализованный в положении 432, оказывается в положении 433. В таком случае аминокислотный остаток, соответствующий изначальному положению 432, обозначается как аминокислотый остаток в положении 432 согласно настоящему изобретению.

Для определения остатка L-аминокислоты, соответствующего мутации 432 аденилатциклазы, необходимо сделать выравнивание аминокислотной последовательности аденилатциклазы из Е.coli и аминокислотной последовательности аденилатциклазы из представляющей интерес бактерии и определить L-аминокислоту, соответствующую номеру 432 в аденилатциклазе из представляющей интерес бактерии.

Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие гена суаА не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID No:1, но также может включать и гомологичные ему гены. Следовательно, вариант белка, кодируемый геном суаА, может иметь гомологию не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, с полной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 при условии сохранения активности белка Cya. Термин "вариант белка", используемый в настоящем изобретении, означает белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15, более предпочтительно от 1 до 5 в SEQ ID NO:2. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для третичной структуры белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру.

Гомология между двумя аминокислотами последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.

Замена, делеция, вставка или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков должны быть консервативными мутациями, при которых сохраняется активность белка. Типичной консервативной мутацией является консервативная замена. Примеры консервативной замены включают: замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu.

Поэтому ген cyaA может быть вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например, гибриды с гомологией не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, более предпочтительно не менее 95%, еще более предпочтительно не менее 97%, и наиболее предпочтительно не менее 98%, образуются, а неспецифические гибриды, например, гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+ (Amersham) при строгих условиях - 15 минут. Предпочтительна двухтрехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно она составляет от 100 п.н. до 1 т.п.н.

Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

1. Бактерия согласно настоящему изобретению

Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, содержащая мутантную аденилатциклазу.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения в клетку бактерии фрагмента ДНК, кодирующего мутантную аденилатциклазу согласно настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению, «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда указанная бактерия выращивается в указанной питательной среде.

Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в количествах, больших по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli K-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее чем 1.0 г/л. Термин «L-аминокислота» включает в себя. Градации, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Термин «ароматическая L-аминокислота» включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. Наиболее предпочтительны L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Предпочтительна бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium,. American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Бактерия-продуцент L-аминокислоты

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, имеющей мутацию в гене cyaA, может использоваться бактерия, способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения мутации в гене cyaA в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания способности к продукции L-аминокислот бактерии, в которой уже имеется мутация в гене cyaA.

Предпочтительно, чтобы в бактерии настоящего изобретения была увеличена способность к ассимиляции глицерина или этанола.

Для увеличения способности к ассимиляции глицерина в бактерии может быть ослаблена экспрессия гена glpR (EP 1715056) или усилена экспрессия генов метаболизма глицерина (EP 1715055 А), таких как glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa и talC. Предпочтительно может быть усилена экспрессия гена, кодирующего мутантную глицеринкиназу, устойчивую к ингибированию фруктозо-1,6-бифосфатом (Pettigrew, D. W., Liu, W. Z., Holmes, С., Meadow, N. D., and Roseman, S., J. Bacteriol. 178, 10, 2846-52 (1996), Honisch, C. et. al., Genome Reseasch, 14: 2495-2502 (2004), WO 2008/081959 и WO 2008/107277). Кроме того, могут быть увеличены активность глицериндегидрогеназы и активность дигидроксиацетонкиназы (WO 2008/102861).

Для увеличения ассимилируемости этанола в бактерии модифицировали ген, кодирующий алкогольдегидрогеназу (adhE) с целью экспрессии под контролем ненативного промотора, функционирующего в аэробных условиях культивирования (WO 2008/010565).

В настоящем изобретении бактериальный штамм, используемый для получения L-аминокислоты, модифицирован таким образом, что экспрессия гена adhE контролируется ненативным промотором, например, промотором, который не контролирует экспрессию гена adhE в штамме дикого типа. Такая модификация может быть достигнута путем замещения нативного промотора гена adhE на хромосоме ненативным промотором, функционирующим в аэробных условиях культивирования, так чтобы ген adhE gene оказался функционально связанным с этим ненативным промотором. В качестве ненативного промотора, функционирующего в аэробных условиях культивирования, может быть использован любой промотор который может обеспечить экспрессию гена adhE на уровне, выше определенного, в аэробных условиях культивирования. Что касается уровня белка AdhE в настоящем изобретении, активность алкогольдегидрогеназы в экстракте свободных клеток, определенная методом Clark and Cronan (J. Bacteriol. 141 177-183 (1980)), должна быть 1.5 Ед или выше, предпочтительно 5 Ед или выше, и более предпочтительно 10. 5 Ед или выше (на мг белка). Аэробные условия культивирования могут быть такими, какие обычно используются для культивирования бактерий, когда поступление кислорода достигается такими способами как встряхивание, аэрация и перемешивание. Конкретно может использоваться любой промотор, о котором известно, что он обеспечивает экспрессию гена в аэробных условиях культивирования. Например, могут использоваться промоторы генов, вовлеченных в гликолиз, пентозофосфатный путь, цикл трикарбоновых кислот, пути биосинтеза аминокислот и т.д.. Кроме того, известны как сильные промоторы, функционирующие в аэробных условиях культивирования, следующие: P_tac промотор, lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P_L промоторы фага λ, их и предпочтительно использовать.

Алкогольдегидрогеназа дикого типа может быть подвержена катализируемому металлами окислению. Хотя такая алкогольдегидрогеназа дикого типа и может использоваться, в настоящем изобретении предпочтительно использовать мутантную алкогольдегидрогеназу, устойчивую к аэробной инактивации. Фраза "мутантная алкогольдегидрогеназа, устойчивая к аэробной инактивации" означает, что мутантная алкогольдегидрогеназа в аэробных условиях сохраняет свою активность или активность снижается в меньшей степени по сравнению с алкогольдегидрогеназой дикого типа. В качестве примера мутантной алкогольдегидрогеназы, устойчивой к аэробной инактивации, можно использовать следующие:

a) белок, в котором глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 568 в ADH из Е.coli, замещена другим аминокислотным остатком, таким как лизин (WO2008/010565).

b) белок, в котором глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 560 в ADH из Е.coli, замещена другим аминокислотным остатком, таким как лизин.

c) белок, в котором фенилаланин в положении, соответствующем положению 566 в ADH из Е.coli, замещен другим аминокислотным остатком, таким как валин.

d) белок, в котором остаток глутаминовой кислоты, остаток метионина, остаток тирозина, остаток изолейцина и остаток аланина в положениях, соответствующих положениям 22, 236, 461, 554 и 786, соответственно, в ADH из Е.coli, замещены другими аминокислотными остатками, например, остатком глицина, остатком валина, остатком цистеина, остатком серина и остатком валина, соответственно;

e) их комбинация.

Бактерия-продуцент L-треонина

Примеры родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM ВР-3519 и FERM ВР-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г. с инвентарным номером В-3996.

В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению также может быть использован штамм Е.coli ВКПМ В-5318 (Европейская заявка 0593792 В). Штамм В-5318 является прототрофным относительно изолейцина, и чувствительный к температуре С1 репрессор фага λ и P_R-промотор замещает регуляторную область в треониновом опероне на плазмиде pVIC40. Штамм ВКПМ В-5318 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 3 мая 1990 г. с инвентарным номером В-5318.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, и

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).

Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления экспрессии треонинового оперона желательно удалить из оперона область аттенюатора, который влияет на транскрипцию (заявка РСТ WO2005/049808, заявка РСТ WO2003/097839).

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же как и гены thrB и thrC, может быть получен в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.

Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli около оперона glnHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi:440181), расположен между генами рехВ и ompX. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA23 представляет собой замену А-на-G в положении -1 по отношению к старт кодону ATG (тезисы 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, тезисы 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457; Европейская заявка ЕР 1013765 A).

Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi: 16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

Также нуклеотидная последовательность гена aspC из Е.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.

Бактерия-продуцент L-лизина

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-5252 (патент США 5827698).

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США. 6,040,160), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (cyo) (европейская заявка ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5,830,716), гена ybjE (заявка РСТ WO2005/073390), или комбинации этих генов.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5,827,698) и малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO2005/010175).

Бактерия-продуцент L-цистеина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM 15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибирбтванию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP11155571A2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307 А1) и подобные им.

Бактерия-продуцент L-лейцина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающих, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP8-70879A), и подобные им.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD, и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (европейская заявка ЕР 1239041 А2).

Бактерия-продуцент L-гистидина

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli Н-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (PERM ВР- 6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (PERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобными им.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин, согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры таких генов включают гены, кодирующие АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (hisI), фосфорибозил-АТФ- фосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и т.д.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ. 2003677 и 2119536).

Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е.coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы E.coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка ЕР 1016710 А), штамм Е.coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ В-7270, патент РФ. 2119536), и т.д.

Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислоты

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC⁺ (ВКПМ В-8961), который обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают глутаматдегидрогеназу (gdh), глутаминсинтетазу (glnA), глутаматсинтетазу (gltAB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), пируватдегидрогеназу (aceEF, lpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируватсинтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA, pgmI), фосфоглицераткиназу (pgk), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapA), триозофосфатизомеразу (tpiA), фруктозобифосфатальдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pfkA, pfkB) и глюкозофосфатизомеразу (pgi).

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР1078989А, ЕР955368А и ЕР952221А.

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что ослаблена экспрессия гена цитратсинтетазы и/или гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или недостаточна активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР1078989А, ЕР955368А и ЕР952221А.

Примеры родительских штаммов для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, согласно настоящему исследованию, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутам