Комбинированная терапия рака поджелудочной железы с использованием антигенного пептида и химиотерапевтического средства

Комбинированная терапия рака поджелудочной железы с использованием антигенного пептида и химиотерапевтического средства

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Приоритет

Для настоящей заявки испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой США, регистрационный № 60/957923, поданной 24 августа 2007, полное содержание которой таким образом включено в данное описание в виде ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к новой комбинированной терапии рака поджелудочной железы, в которой используются антигенный пептид и химиотерапевтическое средство.

Предшествующий уровень техники

Рак поджелудочной железы имеет одну из наивысших степеней смертности среди всех злокачественных новообразований, и 5-летняя выживаемость пациентов составляет 4%. Каждый год приблизительно у 28000 пациентов диагностируют рак поджелудочной железы, и почти все пациенты умирают от этого заболевания (Greenlee R.T. et al., (2001) CA Cancer J Clin 51: 15-36). Плохой прогноз этого злокачественного заболевания является результатом трудности ранней диагностики и плохого ответа на существующие методы лечения (Greenlee R.T. et al., (2001) CA Cancer J Clin 51: 15-36, Klinkenbijl J.H. (1999) Ann Surg, 230: 776-82; обсуждение 782-4). В частности, в настоящее время не идентифицировано опухолевых маркеров, которые позволяют получить надежный скрининг на ранних, потенциально излечимых стадиях заболевания.

Исследования, направленные на определение канцерогенных механизмов, выявили ряд целевых молекул-кандидатов для разработки противоопухолевых средств. Например, было показано, что ингибитор фарнезилтрансферазы (FTI) является эффективным в лечении Ras-зависимых опухолей в моделях на животных (Sun J. Et al., (1998) Oncogene, 16:1467-73). Такое фармацевтическое средство было впоследствии разработано для ингибирования путей передачи сигнала роста, связанных с Ras, которые зависят от посттранскрипционного фарнезилирования. В клинических исследованиях у людей, в которых противоопухолевые средства применяли в комбинации с антиHER2 моноклональным антителом, трастузумабом, с целью антагонизирования протоонкогена HER2/neu было достигнуто улучшение клинического ответа и улучшение общего коэффициента выживаемости у пациенток с раком молочной железы. Ингибитор тирозинкиназы STI-571 представляет собой ингибитор, который селективно деактивирует сшитый белок bcr-ab1. Такое фармацевтическое средство было впоследствии разработано для лечения хронического миелоидного лейкоза, где постоянная активация тирозинкиназы bcr-ab1 играет существенную роль в трансформации лейкоцитов. Такие фармацевтические средства созданы для ингибирования канцерогенной активности специфических генетических продуктов (Molina MA et al., (2000) Cancer Res., 16:4744-9). Следовательно, в раковых клетках генетические продукты со стимулированной экспрессией обычно служат потенциальными мишенями для разработки новых противоопухолевых средств. Альтернативно, ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот также могут использоваться в качестве противоопухолевых средств. Например, гемцитабин (Gemzar®) является препаратом первого ряда выбора для лечения рака поджелудочной железы. Комбинированная терапия гемцитабином и паклитакселом также применялась для лечения рака поджелудочной железы.

Между тем, опухолевый ангиогенез существенно вовлечен в прогрессирование опухолей. Ранее было продемонстрировано, что эффективная вакцина против ангиогенеза опухоли может быть разработана в соответствии с подходом, направленным на эндотелиальные клетки, нацеленным на рецепторы эндотелиального фактора роста (VEGFR) 1 и 2, так как молекулы HLA I класса на эндотелиальных клетках не подавляются (Wada S. Et al., Cancer Res 2005 Jun 1, 65(11):4939-46; Ishizaki H. Et al., Clin Cancer Res 2006 Oct 1, 12(19):5841-9). Также ранее были описаны пептиды, которые индуцируют цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), специфичные для клеток, экспрессирующих VEGFR, и таким образом подавляют опухолевый ангиогенез со специфическим и эффективным CTL ответом (см. WO/2004/024766, включенную в виде ссылки в настоящее описание).

Настоящее изобретение направлено на существующую необходимость в данной области техники в улучшении терапии рака поджелудочной железы, обеспечивая новую комбинированную терапию рака поджелудочной железы, в которой используется антигенный пептид, особенно антигенные пептиды и вакцины от рака, которые нацелены на VEGFR, и химиотерапевтическое средство, такое как гемцитабин.

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения

В свете состояния области лечения рака, задачей настоящего изобретения является обнаружение средств для усиления терапевтического эффекта химиотерапии. VEGFR2 сильно экспрессируется в эндотелиальных клетках опухолевой ткани, и считают, что он вовлечен в пролиферацию эндотелиальных клеток по сигналу VEGF. Соответственно, настоящее изобретение сфокусировано на возможных вакцинах для лечения рака, которые нацелены на VEGFR2 (KDR/flk-1; называемый ниже как KDR). Впоследствии было обнаружено, что терапевтический эффект химиотерапевтических средств, таких как гемцитабин, потенцируется пептидами VEGFR2 (KDR/flk-1; называемый ниже как KDR), которые индуцируют цитотоксические Т-клетки против клеток, экспрессирующих VEGFR2. Следовательно, задачей настоящего изобретения является предоставить:

[1]. Способ лечения рака у пациента, который включает стадию введения пациенту (i) и (ii);

(i) одного или более пептидов, выбираемых из группы, состоящей из:

(а) одного или более пептидов, имеющих последовательность аминокислот, выбираемую из группы, состоящей из RFVPDGNRI (SEQ ID NO:1), VYSSEEAEL (SEQ ID NO:2), GYRIYDVVL (SEQ ID NO:3), SYMISYAGM (SEQ ID NO:4), KKWEFPRDRL (SEQ ID NO:5), DFLTLEHLI (SEQ ID NO:6);

(b) пептида (a), где 1, 2 или несколько аминокислот замещены, удалены или добавлены, и где указанный пептид обладает способностью к индуцированию цитотоксических Т-клеток;

(с) пептида по (b) где второй аминокислотой с N-конца является фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан;

(d) пептида по (b) или (с) где С-концевой аминокислотой является фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин;

(е) одного или более пептидов, имеющих последовательность аминокислот, выбираемую из группы, состоящей из AMFFWLLLV (SEQ ID NO:7), VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8), AVIAMFFWL (SEQ ID NO:9), KLIEIGVQT (SEQ ID NO:10), YMISYAGMV (SEQ ID NO:11), IQSDVWSFGV (SEQ ID NO:12), и VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13).

(f) пептида по (е) где 1, 2 или несколько аминокислот замещены, удалены или добавлены, и где указанный пептид обладает способностью к индуцированию цитотоксических Т-клеток;

(g) пептида по (f), где второй аминокислотой с N-конца является лейцин или метионин; и

(h) пептида по (f) или (g), где С-концевой аминокислотой является валин или лейцин.

(ii) одного или более химиотерапевтических средств, выбираемых из группы, состоящей из гемцитабина, его фармацевтически приемлемой соли и его пролекарства.

[2]. Способ по [1], где пациент является HLA-A24-положительным или HLA-A02-положительным.

[3]. Способ по [1], где рак представляет собой рак поджелудочной железы.

[4]. Набор для лечения рака у пациента, содержащий фармацевтические композиции, которые включают в качестве активного ингредиента соответственно (i) и (ii), и фармацевтически приемлемый носитель;

(i) один или более пептидов, выбираемых из группы, состоящей из (а)-(h) [1]-(i); и

(ii) одно или более химиотерапевтических средств, выбираемых из группы, состоящей из гемцитабина, его фармацевтически приемлемой соли и его пролекарства.

[5]. Набор по [4], где пациент является HLA-A24-положительным или HLA-A02-положительным.

[6]. Набор по [4], где раком является рак поджелудочной железы.

[7]. Противораковое средство для лечения рака у пациента, которое включает (i) в комбинации с (ii);

(i) один или более пептидов, выбираемых из группы, состоящей из (а)-(h) [1]-(i); и

(ii) одно или более химиотерапевтических средств, выбираемых из группы, состоящей из гемцитабина, его фармацевтически приемлемой соли и его пролекарства.

[8]. Противораковое средство по [7], где пациент является HLA-A24-положительным или HLA-A02-положительным.

[9]. Противораковое средство по [7], где раком является рак поджелудочной железы.

[10]. Применение комбинации (i) и (ii) в лечении рака у пациента;

(i) один или более пептидов, выбираемых из группы, состоящей из (а)-(h) [1]-(i); и

(ii) одно или более химиотерапевтических средств, выбираемых из группы, состоящей из гемцитабина, его фармацевтически приемлемой соли и его пролекарства.

[11]. Применение [10], где пациент является HLA-A24-положительным или HLA-A02-положительным.

[12]. Применение [10], где раком является рак поджелудочной железы.

[13]. Применение одного или более пептидов, выбираемых из группы, состоящей из (а)-(h) [1]-(i) для получения фармацевтической композиции, которая усиливает терапевтический эффект гемцитабина.

[14]. Применение [13], где усиливаемый терапевтический эффект представляет собой терапевтический эффект гемцитабина в лечении рака у пациента, где пациент является HLA-A24-положительным или HLA-A02-положительным.

[15]. Применение [14], где раком является рак поджелудочной железы.

Специалисту в области техники понятно, что один или более аспектов настоящего изобретения могут соответствовать определенным задачам, тогда как один или более других аспектов могут соответствовать другим определенным задачам. Каждая задача может применяться не равнозначно во всех ее отношениях к каждому аспекту настоящего изобретения. По существу, предшествующие задачи могут быть рассмотрены альтернативно в отношении любого другого аспекта настоящего изобретения. Эти и другие задачи и характеристики изобретения будут более очевидны после прочтения следующего подробного описания в сочетании с сопутствующими чертежами и примерами. Однако необходимо понимать, что и вышеуказанная сущность изобретения и следующее подробное описание являются предпочтительным вариантом осуществления изобретения и не ограничивают изобретение или другие альтернативные варианты осуществления изобретения.

Краткое описание чертежей

Различные аспекты и применения настоящего изобретения будут очевидны специалисту в области техники при рассмотрении краткого описания чертежей и подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, которые следуют:

Фиг.1 представляет собой протокол введения антигенного пептида и химиотерапевтического средства, используемый в настоящих примерах.

Фиг.2 представляет собой результаты проточного цитометрического анализа необученных Т-клеток, клеток памяти и эффекторных Т-клеток среди CD8-положительных Т-клеток, где функциональные фракции лимфоцитов определяли путем окрашивания перфорином.

Фиг.3 представляет собой количественные изменения регуляторных Т-клеток (например, CD25-высокие и Foxp3-положительные клетки, среди CD4-положительных Т-клеток) до и после введения вакцины, измеряемые проточной цитометрией после четырехцветного окрашивания.

Фиг.4 представляет собой результаты ПЭТ сканирования в Случае 3, особенно лимфаденопатии около места введения после вакцинации.

Фиг.5 представляет собой изменения концентрации опухолевых маркеров с течением времени в Случае 3.

Фиг.6 представляет собой уровень специфической CTL реакции, возникшей в Случае 3 до и после вакцинации.

Фиг.7 представляет собой серию КТ сканирований в случае 4, изображающих уменьшающий эффект лечения на первичный фокус рака поджелудочной железы.

Фиг.8 представляет собой серию КТ сканирований в случае 4, изображающих эффект уменьшения опухоли в отношении метастатического фокуса 1 рака поджелудочной железы в печени.

Фиг.9 представляет собой серию КТ сканирований в случае 4, изображающих эффект уменьшения опухоли в отношении метастатического фокуса 2 рака поджелудочной железы в печени.

Фиг.10 представляет собой изменения опухолевых маркеров, СЕА и СА19-9, возникшие в Случае 4 в течение курса лечения.

Фиг.11 представляет собой специфическую реакцию CTL, возникшую в Случае 4 до и после вакцинации.

Фиг.12 представляет собой серию КТ сканирований в Случае 6, отображающих эффект уменьшения опухоли в отношении первичного фокуса рака поджелудочной железы.

Фиг.13 представляет собой серию ПЭТ сканирований в Случае 6, отображающих эффект уменьшения опухоли в отношении первичного фокуса рака поджелудочной железы.

Фиг.14 представляет собой специфическую CTL реакцию, возникшую в Случае 6 до и после вакцинации.

Фиг.15 представляет собой серию КТ сканирований в случае 7, отображающих изменения первичного фокуса рака поджелудочной железы.

Фиг.16 представляет собой изменения опухолевого маркера СА125, возникшие в Случае 7 в течение курса лечения.

Фиг.17 представляет собой специфическую CTL реакцию, возникшую в Случае 7 до и после вакцинации.

Фиг.18 представляет собой серию КТ сканирований в Случае 10, отображающих изменения первичного фокуса рака поджелудочной железы.

Фиг.19 представляет собой изменения опухолевого маркера СА125, возникшие в Случае 10 в течение курса лечения.

Подробное описание изобретения

Хотя методы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем описании, могут быть использованы в осуществлении или исследовании вариантов осуществления настоящего изобретения, далее описаны предпочтительные методы и материалы. Однако необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается определенными молекулами, композициями, методиками или протоколами, описанными в настоящем описании, так как они могут варьироваться в соответствии с обычными экспериментами и оптимизацией. Также необходимо понимать, что терминология, используемая в описании, предназначена только для целей описания определенных версий или вариантов осуществления изобретения и не предназначена для ограничения рамок настоящего изобретения, которые ограничиваются только приложенной формулой изобретения.

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, как в общем понимает обычный специалист в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Однако, в случае конфликта, настоящая спецификация, включая определения, будет определяющей. Соответственно, в условиях настоящего изобретения применяются следующие определения:

Определения:

Понятия в единственном числе, как используются в настоящем описании, означают "по меньшей мере, один", если специально не указано иначе.

В рамках настоящего изобретения термин "несколько", когда применяется к добавлению, удалению и/или замене аминокислот, означает 3-7, предпочтительно 3-5, более предпочтительно 3-4, еще более предпочтительно 3 остатка аминокислот.

Как используется в настоящем описании, термин "организм" относится к любому живому существу, состоящему из, по меньшей мере, одной клетки. Живой организм может быть таким простым как, например, единичная эукариотическая клетка или таким комплексным, как млекопитающее, включая человека.

Как используется в настоящем описании, термин "биологический образец" относится к целому организму или подгруппе его тканей, клеток или составляющих частей (например, ткани организма, включая, но не ограничиваясь перечисленным, кровь, слизь, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, спинномозговую жидкость, слюну, амниотическую жидкость, амниотическую пуповинную кровь, мочу, влагалищную жидкость и сперму). Термин "биологический образец" дополнительно относится к гомогенату, лизату, экстракту, культуре клеток или культуре тканей, полученных из целого организма или подгруппы его клеток, тканей или составляющих частей, или их фракции или части. Наконец, "биологический образец" относится к среде, такой как питательная среда или гель, в которой организм размножается, которая содержит клеточные компоненты, такие как белки или полинуклеотиды.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в настоящем описании взаимозаменяемо и относятся к полимеру остатков аминокислот. Термины применяются к полимерам аминокислот, в которых один или более остатков аминокислот представляют собой модифицированный остаток или неестественный остаток, такой как искусственный химический миметик соответствующей естественной аминокислоты, а также полимерам естественных аминокислот.

Термины "полинуклеотиды", "олигонуклеотиды", "нуклеотиды", "нуклеиновые кислоты" и "молекулы нуклеиновых кислот" используются взаимозаменяемо в настоящем описании в отношении полимеров остатков нуклеиновых кислот и, если специально не указано иначе, соответствуют аминокислотам, называемым их общепринятыми однобуквенными кодами. Подобно аминокислотам, они охватывают полимеры и естественных и неестественных нуклеиновых кислот.

Термин "химиотерапевтическое средство", как используется в настоящем описании, относится к химическому соединению, применимому в лечении рака. Примеры химиотерапевтических соединений включают, но не ограничиваются перечисленным, следующие и их фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные: алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включающие альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, ифосфамид, меклорэтамин, мекролэтамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новембиехин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацил иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, отрамицин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромонинцины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идамбицин, марцелломицин, митомицины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родоубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, триамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-FU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналы, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; средства, восполняющие недостаток фолиевой кислоты, такие как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK&коммат; разоксан; сизафрран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид; ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOLO, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) и доксетаксел (TAXOTEW, Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбицил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; и капецитабин. Также в настоящее определение включают антигормональные агенты, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены, включая, например, тамоксифен, ралоксифен, 4(5)-имидазолы, ингибирующие ароматазу, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, онапристон и торемифен (Fareston); и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанного.

Антигенные пептиды

Как отмечено выше, настоящее изобретение относится к средствам, которые усиливают или улучшают терапевтический эффект химиотерапии, в частности, антигенным пептидам, которые нацелены на VEGFR2, индуцируют цитотоксические Т-клетки против клеток, экспрессирующих VEGFR2, и впоследствии усиливают или улучшают терапевтический эффект химиотерапевтических средств, таких как гемцитабин.

Антигенные пептиды, имеющие субпоследовательности VEGFR2, могут быть использованы для способа, набора или композиции по настоящему изобретению. Антигенные пептиды, подходящие для применения в рамках настоящего изобретения, предпочтительно имеют последовательность аминокислот, выбираемую из показанных ниже.

VYSSEEAEL (SEQ ID NO:2),

GYRIYDVVL (SEQ ID NO:3),

SYMISYAGM (SEQ ID NO:4),

RFVPDGNRI (SEQ ID NO:1),

KKWEFPRDRL (SEQ ID NO:5), или

DFLTLEHLI (SEQ ID NO:6).

Известно, что мутантные или модифицированные пептиды, пептиды, имеющие последовательности аминокислот, модифицированные делецией, добавлением и/или заменой одного или более остатков аминокислот определенной последовательности аминокислот, сохраняют их исходную биологическую активность (Mark D.F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller M.J. and Smith M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang A. Et al., Science 224,1431-1433, Dalbadie-McFarland G. Et al. Proc.Natl.Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413). Соответственно, настоящее изобретение предусматривает варианты и модификации вышеуказанных последовательностей. В частности, антигенные пептиды, в которых одна, две или несколько аминокислот замещены или добавлены к одной из последовательностей аминокислот, упомянутых выше, также обнаруживают применение в условиях настоящего изобретения, с условием, что полученные модифицированные пептиды сохраняют необходимую способность к индуцированию цитотоксических Т-клеток. Такие модифицированные пептиды, обладающие способностью к индуцированию CTL, а также последовательностью аминокислот, как упомянуто выше, в которой одна, две или несколько аминокислот замещены или добавлены, предусматриваются в настоящем описании, с условием, что они не соответствуют последовательности аминокислот другого белка.

Соответственно в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения вторая аминокислота с N-конца предпочтительно замещена фенилаланином, тирозином, метионином или триптофаном, или С-концевая аминокислота предпочтительно заменена фениаланином, лейцином, изолейцином, триптофаном или метионином; или одна или более аминокислот добавлены к N-концу и/или С-концу.

Альтернативно, нонапептиды и декапептиды, выбираемые из пептидов, имеющих последовательность аминокислот, показанную ниже, также являются предпочтительными как пептиды, обладающие выраженной способностью к индуцированию CTL.

AMFFWLLLV (SEQ ID NO:7),

VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8),

AVIAMFFWL (SEQ ID NO:9),

KLIEIGVQT (SEQ ID NO:10),

YMISYAGMV (SEQ ID NO:11),

IQSDVWSFGV (SEQ ID NO:12) или

VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13).

В условиях настоящего изобретения также могут быть использованы пептиды со способностью к индуцированию цитотоксических Т-клеток, где одна, две или несколько аминокислот замещены или добавлены к одной из последовательностей аминокислот, как упомянуто выше. Пептиды, имеющие последовательности аминокислот, состоящие из девяти или десяти аминокислот, как упомянуто выше, в которых одна, две или несколько аминокислот замещены или добавлены, могут обладать способностью к индуцированию CTL, пока они не соответствуют последовательности аминокислот другого белка. В частности, например, вторая аминокислота с N-конца предпочтительно замещена лейцином или метионином, или С-концевая аминокислота предпочтительно замещена валином или лейцином; или одна или две аминокислоты добавлены на N-конце и/или С-конце.

Примером такого модифицированного пептида является пептид VIAMFFWLL (SEQ ID NO:8), в котором вторая аминокислота с N-конца замещена лейцином (VLAMFFWLL (SEQ ID NO:13)); однако, настоящее изобретение не ограничено этим примером. Клоны CTL, полученные при стимуляции такими модифицированными пептидами, могут распознавать исходные пептиды и вызывать повреждение.

Примеры предусмотренных вставок в последовательности аминокислот включают амино- и/или карбоксиконцевые сшивки, варьирующиеся по длине от одного до нескольких остатков, а также вставки внутри последовательности единичного или множественных остатков аминокислот. Примеры концевых вставок включают N-концевой метионил-остаток или антитело, сшитое с цитотоксическим полипептидом. Пептиды, используемые для настоящего изобретения, также могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, пока модификации не нарушают биологическую активность пептидов, как описано в настоящем описании. Другие модификации включают сшивки с N- или С-концом пептида фермента или полипептида, которые увеличивают период полужизни антитела в сыворотке. Примеры последних включают D-аминокислоты или другие аминокислотные миметики.

В рамках вставок аминокислот, где один или более остатков аминокислот добавляют к пептиду по настоящему изобретению, настоящее изобретение также предусматривает сшитые белки. Сшитые белки обычно состоят из интересующего полипептида или белка с полипептидом или белком с известными свойствами. Сшитые белки могут быть получены методиками, хорошо известными специалисту в области техники, например, связыванием ДНК, кодирующей пептид по настоящему изобретению, с ДНК, кодирующей другие пептиды или белки, так что рамки соответствуют, вставляя сшитую ДНК в вектор экспрессии и экспрессируя ее в организме-хозяине. Не существует ограничений по отношению к пептидам или белкам, которые могут быть сшитыми с белком по настоящему изобретению. Однако примеры известных пептидов, которые могут быть использованы в условиях сшитых белков, включают, но не ограничиваются перечисленным, FLAG (Hopp T.P. et al., Biotechnology (1988) 6, 1204-1210), 6×His, содержащий шесть His (гистидин) остатков, 10×His, агглютинин вируса гриппа (НА), фрагмент человеческого c-myc, VSP-GP фрагмент, фрагмент p18HIV, T7-tag, HSV-tag, E-tag, антигенный фрагмент SV40T, lck tag, фрагмент альфа-тубулина, B-tag, фрагмент протеина С и подобные. Примеры белков, которые могут быть сшиты с белком по изобретению, включают GST (глютатион-S-трансферазу), агглютинин вируса гриппа (НА), постоянный участок иммуноглобулина, бета-галактозидазу, МВР (белок, связывающий мальтозу) и подобные. В условиях замещений аминокислот, замещаемый остаток аминокислоты предпочтительно мутирован в другую аминокислоту, в которой сохраняются свойства боковой цепи аминокислоты (процесс, известный как консервативная замена аминокислоты). Примеры свойств боковых цепей аминокислот представляют собой гидрофобные аминокислоты (A, I, L. M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) и боковые цепи, имеющие следующие функциональные группы или характеристики в общем: алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (S, T, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (С, М); боковые цепи, содержащие карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковые цепи, содержащие основание (R, K, H); и боковые цепи, содержащие ароматический компонент (H, F, Y, W). Обратите внимание, группы в скобках указывают однобуквенные коды аминокислот.

Антигенные пептиды по настоящему изобретению могут быть получены с использованием хорошо известных методик. Например, пептиды могут быть получены синтетически, с использованием или методики рекомбинантной ДНК или химического синтеза. Пептиды могут быть синтезированы отдельно или в виде более длинных полипептидов, состоящих из двух или более пептидов. Такие пептиды являются предпочтительно изолированными, т.е. по существу свободными от других естественных белков и их фрагментов клеток-хозяев.

Антигенные пептиды по настоящему изобретению могут быть представлены в смеси или могут быть конъюгированы друг с другом с использованием стандартных методик. Например, пептиды могут экспрессироваться в виде единственной полипептидной последовательности. Пептиды в комбинации могут быть одинаковыми или различными. При введении пептидов по настоящему изобретению пептиды представлены с высокой плотностью на HLA антигенах антигенпредставляющих клеток, которые в свою очередь индуцируют CTL, которые специфически реагируют с комплексом, образуемым между указанным пептидом и HLA антигеном. Альтернативно, антигенпредставляющие клетки, имеющие иммобилизованные пептиды по настоящему изобретению на поверхности клеток, полученные выделением дендритных клеток от пациентов, могут быть стимулированы пептидами по настоящему изобретению. Повторное введение таких клеток соответствующему пациенту индуцирует CTL и, в результате, агрессивность в отношении клеток-мишеней может быть повышена.

Фармацевтические композиции и способы их применения

Настоящее изобретение обеспечивает лекарственные средства для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы, используемые в комбинации с химиотерапевтическим средством, таким как гемцитабин. Пептиды, используемые для изобретения, обнаруживают особое применение в лечении рака поджелудочной железы.

Стимуляция дендритных клеток in vivo и in vitro антигенными пептидами по настоящему изобретению может быть легко осуществлена путем воздействия на клетки высокой концентрации пептидов, что способствует тому, что такие пептиды заменяют пептиды, исходно иммобилизованные на клетках. Следовательно, для применения в рамках настоящего изобретения антигенные пептиды должны иметь, по меньшей мере, определенный уровень способности связывания с HLA антигенами.

Фармацевтические препараты, содержащие такие пептиды, могут непосредственно вводиться в виде пептидов как таковых, или могут вводиться в виде фармацевтических композиций, которые рецептированы обычными методами рецептирования. В таких случаях фармацевтические препараты могут соответствующим образом включать в добавление к пептидам носители, вспомогательные вещества и подобные, которые обычно используются для фармацевтических препаратов, без определенных ограничений. Фармацевтические препараты могут быть использованы для лечения и профилактики рака поджелудочной железы в комбинации с гемцитабином.

Фармацевтические препараты для лечения и/или профилактики рака поджелудочной железы, включающие антигенный пептид по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, могут вводиться с адъювантами, которые эффективно индуцируют клеточный иммунитет; могут вводиться с другими активными ингредиентами, такими как противоопухолевые средства; и могут вводиться в гранулярной форме. Подходящие добавки описаны в литературе (Clin. Microbiol. Rev.,7: 277-289, 1994). Более того, фармацевтические препараты по настоящему изобретению могут вводиться в виде препаратов липосом, в виде гранулярной композиции, связанной с шариками нескольких микрометров в диаметре и в виде композиций, с которыми связаны липиды.

Способы введения могут осуществляться, например, перорально, внутрикожно или подкожно, или посредством внутривенной инъекции или подобных. Может быть применимо системное введение или местное введение в окружение целевой опухоли или непосредственно в целевую опухоль. Дозы пептида по настоящему изобретению могут быть скорректированы соответствующим образом, в зависимости от подвергаемого лечению заболевания, возраста и массы тела пациента, способов введения и подобного. Обычно от 0,001 мг до 1000 мг, предпочтительно от 0,001 мг до 1000 мг, более предпочтительно от 0,1 мг до 10 мг пептидов предпочтительно вводят один раз в несколько дней или несколько месяцев. В частности, с целью усиления терапевтического эффекта гемцитабина, в предпочтительном варианте осуществления изобретения от 0,5 мг до 2,0 мг пептидов можно вводить один раз в несколько дней - несколько месяцев, более предпочтительно в неделю (7 дней) в комбинации с гемцитабином. Специалист в области техники может соответствующим образом выбрать подходящие дозы.

Альтернативно, в рамках настоящего изобретения внутриклеточные пузырьки, которые представляют собой комплексы, образованные между пептидами по настоящему изобретению и HLA-антигенами на их поверхности, могут быть использованы для целей настоящего изобретения. Такие внутриклеточные пузырьки называются экзосомами. Экзосомы могут быть получены, например, в соответствии со способами, специфически описанными в Опубликованном Японском Переводе Международных Публикаций №№ Hei 11-510507 и 2000-512161. Экзосомы могут предпочтительно быть получены с использованием антиген-представляющих клеток, полученных от пациентов, которых планируют лечить или проводить профилактику. Экзосомы по настоящему изобретению могут быть введены в виде вакцин от рака, относительно пептидов по настоящему изобретению.

Тип используемых HLA антигенов должен соответствовать таковому пациента, нуждающегося в лечении и/или профилактики. Например, для японцев часто соответствующими являются HLA-A24 или HLA-A02, особенно HLA-A2402 или HLA-A0201.

Подобным образом, в рамках настоящего изобретения выделенные цитотоксические Т-клетки, которые индуцируют пептидами, также могут быть использованы для целей настоящего изобретения. Цитотоксические Т-клетки, которые были индуцированы стимуляцией антиген-представляющими клетками, которые представляют пептиды по настоящему изобретению, предпочтительно получают от пациентов, являющихся мишенью лечения и/или профилактики. Цитотоксические Т-клетки можно вводить отдельно или, с целью противоопухолевого действия, в комбинации с другими лекарственными препаратами, включая пептиды, экзосомы и так далее по настоящему изобретению. Полученные цитотоксические Т-клетки действуют специфически против клеток-мишеней, представляющих пептиды по настоящему изобретению, или предпочтительно, против клеток-мишеней, представляющих такие же пептиды, используемые для индукции. Клетками-мишенями могут быть клетки, которые эндогенно экспрессируют KDR, или клетки, которые вынуждают экспрессировать KDR. Более того, клетки, которые представляют пептиды по настоящему изобретению на поверхности в результате стимуляции такими пептидами, также могут быть нацеленными.

В рамках настоящего изобретения антиген-представляющие клетки, которые представляют собой комплексы между HLA антигенами и пептидами, также могут быть использованы для целей настоящего изобретения. Антиген-представляющие клетки, которые получают при контакте с пептидами или с нуклеотидами, кодирующими пептиды, предпочтительно получают от пациентов, которых планируют для лечения и/или профилактики. Антиген-представляющие клетки могут вводиться в виде вакцин отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами, такими как пептиды по настоящему изобретению, экзосомы и цитотоксические Т-клетки.

В рамках настоящего изобретения пептиды предпочтительно вводят в комбинации с гемцитабином. Гемцитабин представляет собой общее название, данное соединению моногидрохлориду 2'-деокси-2',2'-дифторцитидина (b-изомер). Фармацевтическая композиция, состоящая из соли гидрохлорида гемцитабина (гемцитабин HCl), обычно является коммерчески доступной в виде Gemzar (торговое наименование). В рамках настоящего изобретения, по меньшей мере, одно из гемцитабина, фармацевтически приемлемой соли гемцитабина или его пролекарства может вводиться в комбинации с вышеупомянутыми пептидами. Соответственно, если не указано иначе, в настоящем описании ссылки на гемцитабин включают его соль или пролекарство.

Гемцитабин представляет собой химиотерапевтическое средство, которое уже находится в клиническом применении в виде терапевтического средства для лечения нескольких видов рака, включая рак поджелудочной железы. Стандартный терапевтический протокол для введения гемцитабина взрослому для лечения рака поджелудочной железы включает введение 1000 мг/м² гемцитабина в неделю в течение до семи недель. Гемцитабин обычно вводят путем внутривенной инфузии. В лечении рака поджелудочной железы обычно схему трех недель введения с последующей одной неделей отсутствия лечения устанавливают как один цикл, и лечение продолжают и