Поперечно сшитые полисахаридные и белковые матрицы и способы их получения

Поперечно сшитые полисахаридные и белковые матрицы и способы их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США, порядковый номер 60/713390, поданной 2 сентября 2005, включенной в настоящее описание ссылкой во всей ее полноте.

Область изобретения

Данное изобретение относится, главным образом, к матрицам и препаратам на основе поперечно сшитого полисахарида и, более конкретно, к новому способу поперечной сшивки амино-полисахаридов и амино-функционализированных полисахаридов с использованием восстанавливающих сахаров и их производных в качестве агентов поперечной сшивки и к поперечно сшитым полисахаридным матрицам и препаратам, полученным с использованием данного способа.

Уровень техники

Характеристики продуктов на основе гиалуроновой кислоты или на основе другого амино-сахарида зависят, с одной стороны, от регуляции их функциональной долговечности в организме-хозяине и, с другой стороны, от сохранения биологических свойств природной гиалуроновой кислоты (НА) или другого полисахаридного компонента. Функциональная долговечность НА или другого полисахаридного компонента зависит от их способности противостоять специфическому ферментативному расщеплению гиалуронидазой или какими-либо другими расщепляющими полисахарид ферментами, присутствующими в организме-хозяине. Эта способность непосредственно соотносится с числом внутримолекулярных и межмолекулярных поперечных связей в полимере на основе НА или другого полисахарида. Обычно более высокое число поперечных связей имеет результатом более высокую устойчивость к такому ферментативному расщеплению.

Типичными предпочтительными поперечно сшивающими агентами, известными в технике для поперечной сшивки полисахаридов, и/или производных полисахаридов, и/или искусственно функционализированных форм полисахаридов, являются бифункциональные (или полифункциональные) линкеры, такие как, например, 1,4-бутандиолдиглицидиловый эфир, множество других синтетических бифункциональных кросс-линкеров и других родственных нефизиологических агентов. Такие поперечно сшивающие агенты взаимодействуют с аминогруппами или другими функциональными группами молекулы полисахарида с образованием межмолекулярных поперечных связей. Однако эти жесткие агенты могут оказывать негативное влияние на биосовместимость и биологическую активность биопродуктов на основе поперечно сшитого полисахарида, что может быть вызвано изменениями конформации полисахаридной молекулы и выщелачиванием поперечно сшивающих агентов. Так, полисахаридные продукты, поперечно сшитые нефизиологическими агентами, могут проявлять некоторую степень антигенности. Более того, локализованные воспалительные и более сложные системные реакции, включая местное опухание, зуд, временную или продолжительную эритему, отек, образование гранулемы, поверхностную некротическую крапивницу и угревидные повреждения, могут быть неблагоприятными побочными эффектами у небольшого относительного количества пациентов, применяющих в эстетических целях существующие коммерческие поперечно сшитые полисахаридные продукты.

Кроме того, в случае, когда продукты готовят для инъекции в виде суспензий, гелей или эмульсий, применение искусственных кросс-линкеров, известных в технике, не всегда позволяет получить поперечно сшитые продукты, имеющие удовлетворительную устойчивость к ферментативному расщеплению в сочетании с желаемыми реологическими свойствами препарата для инъекций.

Сущность изобретения

Поэтому в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения предложен способ получения поперечно сшитых полисахаридов. Способ включает взаимодействие по меньшей мере одного полисахарида, выбранного из амино-полисахарида, и/или амино-функционализированного полисахарида, и/или их сочетаний с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром с образованием поперечно сшитого полисахарида.

Более того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения по меньшей мере один полисахарид выбран из природного амино-полисахарида, синтетического амино-полисахарида, амино-гетерополисахарида, амино-гомополисахарида, амино-функционализированного полисахарида и его производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированной гиалуроновой кислоты и ее производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированного гиалуронана и его производных форм и сложных эфиров и солей, хитозана и его производных форм и сложных эфиров и солей, гепарина и его производных форм и сложных эфиров и солей, амино-функционализированных гликозаминогликанов и их производных форм и сложных эфиров и солей и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из альдозы, кетозы, производного альдозы, производного кетозы, диозы, триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, септозы, октозы, нанозы, декозы, глицерозы, треозы, эритрозы, ликсозы, ксилозы, арабинозы, рибозы, аллозы, альтрозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, гулозы, идозы, галактозы и талозы, восстанавливающего моносахарида, восстанавливающего дисахарида, восстанавливающего трисахарида, восстанавливающего олигосахарида, производных форм олигосахаридов, производных форм моносахаридов, сложных эфиров моносахаридов, сложных эфиров олигосахаридов, солей моносахаридов, солей олигосахаридов, мальтозы, лактозы, целлобиозы, генциобиозы, мелибиозы, туранозы, трегалозы, изомальтозы, ламинарибиозы, маннобиозы и ксилобиозы, глицеральдегида, сорбозы, D-рибоза-5-фосфата, глюкозамина и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере один восстанавливающий сахар может быть выбран из правовращающей формы по меньшей мере одного восстанавливающего сахара, левовращающей формы по меньшей мере одного восстанавливающего сахара и смеси правовращающей и левовращающей форм по меньшей мере одного восстанавливающего сахара.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, взаимодействие включает инкубирование по меньшей мере одного полисахарида в растворе, содержащем по меньшей мере один растворитель и по меньшей мере один восстанавливающий сахар, с образованием поперечно сшитого полисахарида.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, раствор является забуференным раствором, содержащим по меньшей мере один буфер.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель является водным забуференным растворителем, содержащим по меньшей мере один буфер для регулирования pH раствора.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель является водным растворителем, содержащим по меньшей мере одну ионизируемую соль для регулирования ионной силы раствора.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель (растворители) включает по меньшей мере один растворитель, выбранный из группы, состоящей из органического растворителя, неорганического растворителя, полярного растворителя, неполярного растворителя, гидрофильного растворителя, гидрофобного растворителя, растворителя, смешивающегося с водой, не смешивающегося с водой растворителя и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель включает воду и по меньшей мере один дополнительный растворитель, выбранный из гидрофильного растворителя, полярного растворителя, растворителя, смешивающегося с водой, и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, растворитель выбран из группы, состоящей из воды, забуференного фосфатом солевого раствора, этанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 1-гексанола, ацетона, этилацетата, дихлорметана, диэтилового эфира, гексана, толуола и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, взаимодействие включает добавление по меньшей мере одного белка и/или полипептида, имеющего поперечно сшиваемые аминогруппы, к по меньшей мере одному полисахариду и по меньшей мере одному восстанавливающему сахару для формирования композиционной поперечно сшитой матрицы.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере один белок и/или полипептид, имеющий поперечно сшиваемые аминогруппы, выбран из коллагена, белка, выбранного из надсемейства коллагена, белков внеклеточного матрикса, ферментов, структурных белков, выделенных из крови белков, гликопротеинов, липопротеинов, природных белков, синтетических белков, гормонов, факторов роста, белков, стимулирующих рост хряща, стимулирующих рост кости белков, внутриклеточных белков, внеклеточных белков, мембранных белков, эластина, фибрина, фибриногена и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, коллаген выбран из природного коллагена, фибриллярного коллагена, фибриллярного ателопептидного коллагена, содержащего телопептид коллагена, лиофилизованного коллагена, коллагена, полученного из животных источников, коллагена человека, коллагена млекопитающего, рекомбинантного коллагена, пепсинизированного коллагена, восстановленного коллагена, бычьего ателопептидного коллагена, свиного ателопептидного коллагена, коллагена, полученного из видов позвоночных, рекомбинантного коллагена, генно-инженерного или модифицированного коллагена, коллагена типов I, II, III, V, XI, XXIV, фибрил-связанных коллагенов типов IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII и XXVI, коллагенов типов VIII и X, коллагенов типа IV, коллагена типа VI, коллагена типа VII, коллагенов типа XIII, XVII, XXIII и XXV, коллагенов типа XV и XVIII, искусственно полученного коллагена, производимого генетически модифицированными эукариотическими или прокариотическими клетками или генетически модифицированными организмами, очищенного коллагена и восстановленного очищенного коллагена, частиц фибриллярного коллагена, фибриллярного восстановленного ателопептидного коллагена, коллагена, выделенного из клеточной культуральной среды, коллагена, полученного из генно-инженерных растений, фрагментов коллагена, протоколлагена и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, взаимодействие включает добавление по меньшей мере одной добавки к по меньшей мере одному полисахариду и по меньшей мере одному восстанавливающему сахару для образования поперечно сшитой матрицы, содержащей по меньшей мере одну добавку.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере одна добавка выбрана из фармакологических веществ, лекарств, белков, полипептидов, анестезирующих агентов, антибактериальных агентов, противомикробных агентов, противовирусных агентов, противогрибковых агентов, антимикозных агентов, противовоспалительных агентов, гликопротеинов, протеогликанов, гликозаминогликанов, различных компонентов внеклеточного матрикса, гормонов, факторов роста, трансформирующих факторов, рецепторов или рецепторных комплексов, природных полимеров, синтетических полимеров, ДНК, РНК, олигонуклеотидов, терапевтического агента, морфогенетических белков, мукопротеинов, мукополисахаридов, белков матрикса, факторов транскрипции, пептидов, генетического материала для генной терапии, нуклеиновой кислоты, химически модифицированной нуклеиновой кислоты, химерной конструкции ДНК/РНК, ДНК или РНК зондов, антисмысловой ДНК, антисмысловой РНК, гена, части гена, композиции, включающей природные или искусственно полученные олигонуклеотиды, плазмидной ДНК, космидной ДНК, вирусных и невирусных векторов, необходимых для стимуляции клеточного поглощения и транскрипции, хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, кератансульфата, дерматансульфата, гепарина, гепарансульфата, гиалуронана, обогащенного лецитином внутритканевого протеогликана, декорина, бигликана, фибромодулина, лумикана, аггрекана, синдеканов, бета-гликана, версикана, центрогликана, серглицина, фибронектина, фиброгликана, хондроадгеринов, фибулинов, тромбоспондина-5, фермента, ингибитора фермента, антитела и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, взаимодействие также включает добавление одной или нескольких живых клеток к по меньшей мере одному полисахариду и по меньшей мере одному восстанавливающему сахару до, во время или после указанной поперечной сшивки для образования поперечно сшитой матрицы, содержащей по меньшей мере одну живую клетку, включенную в матрицу.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, живые клетки выбраны из хондроцитов позвоночных, остеобластов, остеокластов, стволовых клеток позвоночных, эмбриональных стволовых клеток, стволовых клеток, выделенных из ткани взрослого, клеток-предшественников позвоночных, фибробластов позвоночных, клеток, генетически созданных для секреции одного или нескольких белков матрикса, гликозаминогликанов, протеогликанов, морфогенетических белков, факторов роста, факторов транскрипции, противовоспалительных агентов, белков, гормонов, пептидов, одного или нескольких типов живых клеток, созданных генной инженерией для экспрессии рецепторов к одной или нескольким молекулам, выбранным из группы, состоящей из белков, пептидов, гормонов, гликозаминогликанов, протеогликанов, морфогенетических белков, факторов роста, факторов транскрипции, противовоспалительных агентов, гликопротеинов, мукопротеинов и мукополисахаридов и любых их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, способ дополнительно включает подвергание поперечно сшитого полисахарида обработке, выбранной из сушки, лиофилизации, дегидратации, сушки при критической точке, формования, стерилизации, гомогенизации, обработки механическим сдвигом, облучения ионизирующим излучением, облучения электромагнитным излучением, смешивания с фармацевтически приемлемым носителем, насыщения добавкой и их сочетаний.

Предложен также, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, способ получения поперечно сшитых полисахаридов. Способ включает стадии взаимодействия полисахарида с одним или несколькими реагентами до образования производной формы полисахарида. Производная форма содержит одну или несколько аминогрупп и поперечную сшивку производного полисахарида с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром с образованием поперечно сшитого полисахарида.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, аминогруппы выбраны из первичных аминогрупп и вторичных аминогрупп.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, один или несколько реагентов включают карбодиимид.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, один или несколько реагентов включают карбодиимид в присутствии дигидразида адипиновой кислоты.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, карбодиимидом является гидрохлорид 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из альдозы, кетозы и их сочетаний.

Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, по меньшей мере один восстанавливающий сахар выбран из глицеральдегида, рибозы, эритрозы, арабинозы, сорбозы, фруктозы, глюкозы, D-рибоза-5-фосфата, глюкозамина, диозы, триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, септозы, октозы, нанозы, декозы, глицерозы, треозы, ликсозы, ксилозы, аллозы, альтрозы, маннозы, гулозы, идозы, галактозы, талозы, восстанавливающего моносахарида, восстанавливающего дисахарида, восстанавливающего трисахарида, восстанавливающего олигосахарида, производных форм олигосахаридов, производных форм моносахаридов, сложных эфиров моносахаридов, сложных эфиров олигосахаридов, солей моносахаридов, солей олигосахаридов, мальтозы, лактозы, целлобиозы, генциобиозы, мелибиозы, туранозы, трегалозы, изомальтозы, ламинарибиозы, маннобиозы и ксилобиозы и их сочетаний.

Предложен также, в соответствии с вариантом осуществления изобретения, способ получения композиционной поперечно сшитой матрицы. Способ включает поперечную сшивку с по меньшей мере одним восстанавливающим сахаром по меньшей мере одного полисахарида, выбранного из амино-полисахарида, амино-функционализированного полисахарида и их сочетаний, в присутствии по меньшей мере одного поперечно сшиваемого белка до образования композиционной поперечно сшитой матрицы.

И, наконец, предложены также, в соответствии с вариантами осуществления изобретения, поперечно сшитые полисахариды и композиционные матрицы, включающие полисахариды и один или несколько белков, полученные способами, описанными выше.

Краткое описание рисунков

Для того чтобы понять изобретение и понять, как оно может быть осуществлено на практике, несколько предпочтительных вариантов осуществления будут описаны только в виде неограничивающего примера со ссылкой на сопутствующие рисунки:

Фиг. 1 - это схематический график, представляющий УФ-видимый спектр амино-функционализированной гиалуроновой кислоты (AFHA), представленный пунктирной кривой, и представленный сплошной кривой спектр поперечно сшитой DL-глицеральдегидом AFHA, полученной в соответствии с вариантом осуществления способа по данному изобретению.

Фиг. 2 - это схематический график, представляющий УФ-видимый спектр поперечно сшитой D(-)-рибозой AFHA, представленный пунктирной кривой, поперечно сшитой D(-)-эритрозой AFHA, представленный сплошной кривой, и поперечно сшитой D(-)-арабинозой AFHA, представленный штриховой кривой, полученных в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению.

Фиг. 3 - это схематический график, представляющий УФ-видимый спектр несшитого поперечно хитозана, представленный сплошной кривой, поперечно сшитого D(-)-рибозой хитозана, представленный пунктирной кривой, и поперечно сшитого DL-глицеральдегидом хитозана, представленный штриховой кривой, полученных в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению.

Фиг. 4 - это схематический график, представляющий инфракрасный спектр Fourier Transform (FTIR) гиалуроновой кислоты, представленный штриховой кривой, AFHA, представленный пунктирной кривой, и поперечно сшитой DL-глицеральдегидом AFHA, представленный сплошной кривой, в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению.

Фиг. 5-7 представляют схематические графики, поясняющие результаты измерений реологических свойств шести различных составов полисахаридов на основе AFHA, поперечно сшитых при различных концентрациях DL-глицеральдегида в течение различных периодов времени в соответствии с вариантами осуществления способа по данному изобретению, в сравнении с реологическими свойствами некоторых коммерчески доступных матриц на основе гиалуроновой кислоты.

Фиг. 8 представляет схематический график, поясняющий результаты измерения набухаемости амино-функционализированной НА, поперечно сшитой при различных концентрациях DL-глицеральдегида в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг. 9 представляет схематический график, поясняющий результаты измерения набухаемости хитозана, поперечно сшитого при различных концентрациях DL-глицеральдегида в соответствии с вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг. 10 представляет схематический график, поясняющий результаты карбазолового анализа расщепления гиалуронидазой поперечно сшитой DL-глицеральдегидом амино-функционализированной НА и коммерчески доступного Perlane®.

Фиг. 11 представляет схематический график, поясняющий результаты карбазолового анализа фиг. 10, где величины поглощающей способности для Perlane® были умножены на десять, чтобы компенсировать 10-кратное разбавление исследуемых образцов Perlane®.

Фиг. 12 представляет схематический график, поясняющий % устойчивости к расщеплению гиалуронидазой in vitro типичного образца матрицы поперечно сшитой D(-)-фруктозой амино-функционализированной НА и Perlane® как функцию времени расщепления.

Подробное описание изобретения

Используемые здесь условные обозначения

Следующие условные обозначения используются в данной заявке.

Термин	Определение
мкл	микролитр
ADH	дигидразид адипиновой кислоты
AFHA	амино-функционализированная гиалуроновая кислота
AGE	преобладающие продукты гликозилирования
CH	хитозан
DI вода	деионизированная вода
EDC	гидрохлорид 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида
FTIR	Fourrier Transform Infra-red
G	Калибр
HA	гиалуроновая кислота
Гц	Герц
ИК	инфракрасный
М	молярный
МДа	миллион Дальтон
мг	миллиграмм
мл	миллилитр
мМ	миллимолярный
Mw	молекулярная масса
Н	нормальный
Па	Паскаль
PBS	забуференный фосфатом солевой раствор
об/мин	оборотов в минуту

Данное изобретение относится к новому способу получения новых биосовместимых матриц на основе поперечно сшитого полисахарида и препаратам, имеющим превосходную устойчивость к ферментативному расщеплению in vivo и другие полезные реологические и/или биологические свойства. Способ базируется, наряду с прочим, на поперечной сшивке амино-полисахаридов (таких как, но без ограничения, хитозан) и/или амино-функционализированных полисахаридов (таких как, но без ограничения, амино-функционализированная гиалуроновая кислота) с восстанавливающими сахарами, такими как D(-)-рибоза, DL-глицеральдегид, D(-)-эритроза, D(-)-арабиноза и многие другие типы восстанавливающих сахаров, известные в технике. Также раскрыты примеры таких новых поперечно сшитых матриц.

Данное изобретение также относится к новому способу получения композиционных поперечно сшитых матриц, полученных поперечной сшивкой смесей одного или нескольких амино-полисахаридов, и/или одного или нескольких амино-функционализированных полисахаридов, и/или одного или нескольких белков (и/или полипептидов) с одним или несколькими восстанавливающими сахарами (в качестве кросс-линкера) для образования новых композиционных матриц на основе полисахарида/белка, и к препаратам, имеющим превосходные свойства устойчивости к ферментативному расщеплению in vivo и in vitro и другие полезные реологические и/или биологические свойства.

Термины "полисахарид" и "полисахариды" и их сопряженные формы используются здесь для определения какого-либо природного и/или искусственно полученного (и/или искусственно синтезированного) полисахарида или полисахаридов, включая любые химически модифицированные формы и/или производные такого полисахарида (полисахаридов) и включая, но без ограничения, сложные эфиры и соли таких полисахаридов или их производных форм.

Термины "амино-полисахарид" и "амино-полисахариды" и их сопряженные формы используются здесь для определения какой-либо формы полисахарида или полисахаридов, которые содержат одну или несколько аминогрупп, способных быть поперечно сшитыми восстанавливающим сахаром.

Термины "амино-функционализированный полисахарид" и "амино- функционализированные полисахариды" и их сопряженные формы используются здесь для определения любого полисахарида, который был химически модифицирован для присоединения к нему одной или нескольких химических групп, включая, наряду с прочим, одну или несколько аминогрупп, которые способны быть поперечно сшитыми восстанавливающим сахаром.

Таким образом, способы поперечной сшивки, описанные здесь, могут быть использованы, наряду с прочим, для поперечной сшивки природных амино-полисахаридов, синтетических амино-полисахаридов, амино-гетерополисахаридов, амино-гомополисахаридов, амино-функционализированных полисахаридов, гиалуроновой кислоты и ее производных форм, гиалуронана и его производных форм, хитозана и его производных форм, гепарина и его производных форм и различных их сочетаний. Раскрытые способы включают поперечную сшивку любых подходящих сложных эфиров и солей таких амино-полисахаридов и амино-функционализированных полисахаридов.

Специалистам в химии углеводов должно быть понятно, что другие типы содержащих аминогруппу полисахаридов и/или амино-функционализированных полисахаридов, которые не описаны в конкретных примерах и экспериментах здесь ниже, также могут быть поперечно сшиты способами, раскрытыми здесь, с получением разнообразных поперечно сшитых продуктов. Следует отметить, что поперечная сшивка таких амино-полисахаридов или амино-функционализированных полисахаридов с помощью восстанавливающих сахаров (или производных восстанавливающего сахара) включена в объем способов и продуктов по данному изобретению.

Любой подходящий восстанавливающий сахар может быть использован в качестве поперечно сшивающего агента в способах по данному изобретению. Сахар может быть моносахаридом, дисахаридом, имеющим восстанавливающий конец, трисахаридом, имеющим восстанавливающий конец, или тому подобным. Подходящие сахара включают альдозы и кетозы. Когда моносахарид используют в качестве кросс-линкера, он может быть триозой, тетрозой, пентозой, гексозой, гептозой, но моносахариды с более чем семью атомами углерода также могут быть использованы. Так, в число сахаров, которые могут быть использованы в новых способах поперечной сшивки по данному изобретению, входят глицероза, треоза, эритроза, луксоза, ксилоза, арабиноза, аллоза, альтоза, глюкоза, манноза, гулоза, идоза, галактоза, фруктоза, талоза или любая другая диоза, триоза, тетроза, пентоза, гексоза, септоза, октоза, наноза или декоза и их различные подходящие производные формы.

Восстанавливающие производные указанных моносахаридов или олигосахаридов, которые имеют активную альдегидную или кетогруппу, также могут быть использованы в качестве поперечно сшивающих агентов в данном изобретении.

Скорость реакции поперечной сшивки может зависеть от равновесной концентрации альдегидной или кетогруппы, присутствующей в форме с открытым кольцом конкретного используемого сахара, как известно в данной области. Однако существует возможность компенсировать медленную скорость реакции некоторых специфических сахаров простым увеличением времени реакции, как известно в данной области.

Эксперименты, описанные здесь ниже, являются неограничивающими примерами, демонстрирующими типичные реакции таких амино-полисахаридов и полисахаридов, синтетически функционализированных аминогруппами, с выбранными типичными восстанавливающими сахарами и описывающими усовершенствованную устойчивость к расщеплению и реологические свойства полученных матриц. Следует отметить, что следующие эксперименты даны только для примера и не предназначены для ограничения объема притязаний данного изобретения. Так, как должно быть очевидно для специалистов в этой области, полисахариды, функционализированные полисахариды, восстанавливающие сахара (используемые в качестве кросс-линкеров), условия реакции, составы реакционной смеси, температуры реакции, продолжительность реакции и химические, физические, реологические свойства и свойства биологической долговечности полученных поперечно сшитых матриц могут отличаться от тех, которые конкретно описаны в экспериментах, раскрытых здесь ниже.

Термин гиалуроновая кислота (НА) используется в следующем тексте как родовое наименование для обозначения и гиалуроновой кислоты как таковой, так и ее солей или смесей солей и, в особенности, солей гиалуроната.

Термин амино-функционализированная гиалуроновая кислота используется в следующем тексте как родовое наименование для обозначения гиалуроновой кислоты и ее солей или смесей солей, которые были дериватизированы так, чтобы они содержали части молекулы со свободной аминогруппой. Аминогруппы могут быть первичными аминогруппами и/или вторичными аминогруппами. Предпочтительным местом для введения части молекулы, содержащей аминогруппу, является карбоксильная группа полисахарида, но существует возможность вводить такую часть молекулы, содержащую аминогруппу, в другие сайты на кольце (кольцах) сахарида. Нет необходимости, чтобы амино-функционализация была полной, и некоторые карбоксильные группы (или другие места дериватизации, если используются) могут оставаться недериватизированными.

Термин амино-функционализированный полисахарид используется в следующем тексте как родовой термин, обозначающий какой-либо полисахарид, который содержит аминогруппы, которые могут взаимодействовать с альдегидной или кетогруппой поперечно сшивающего восстанавливающего сахара. Аминогруппы могут быть первичными и/или вторичными аминогруппами. Аминогруппы могут быть расположенными непосредственно на сахаридной кольцевой структуре (как в хитозане), но могут быть также частью группы, ковалентно связанной с одним или несколькими сайтами или химическими группами на кольцах сахара полисахаридной цепи.

Так, аминогруппа может располагаться непосредственно на кольце сахара, как в случае хитозана (как раскрыто подробно здесь далее), который не требует функционализирования и может быть непосредственно поперечно сшит с восстанавливающим сахаром через аминогруппу кольцевой основы. Следует отметить, что полимеры на основе частично ацетилированного хитина также могут быть поперечно сшиты с применением способа поперечной сшивки сахаром по данному изобретению, как может быть сшит и любой полисахарид, имеющий свободные аминогруппы (первичные или вторичные).

Отмечено, что в соответствии с результатами экспериментов, раскрытых здесь, добавление к поперечно сшивающей реакционной смеси полярного смешивающегося с водой растворителя, такого как, но без ограничения, этанол, может значительно повысить эффективность поперечной сшивки и имеет результатом усовершенствованную устойчивость к расщеплению продуктов реакции по сравнению с поперечной сшивкой в присутствии забуференного водного раствора без какого-либо полярного растворителя.

Хотя действительные механизмы реакции поперечной сшивки и химическая природа получаемых поперечно сшитых полисахаридов в настоящее время не вполне понятны, предполагается, что реакции могут быть в чем-то подобны (хотя не обязательно идентичны) классической реакции гликозилирования, в которой восстанавливающий сахар используют для поперечной сшивки молекул белка на основе реакции альдегидной или кетогруппы сахара с аминогруппами аминокислот белков так, как, например, со свободной аминогруппой лизина или аргинина или других аминокислот, присутствующих в цепи белка.

Такие поперечно сшивающие белок реакции восстанавливающих сахаров хорошо известны в данной области. Вероятно, что такая реакция поперечной сшивки белка протекает по меньшей мере частично через перегруппировку Амадори первоначального продукта реакции, приводящую к образованию желтоватых или коричневых конечных продуктов гликозилирования.

Хотя авторы данного изобретения не полностью охарактеризовали структуру поперечно сшитых полисахаридов, полученных в экспериментах, раскрытых в данной заявке, характерные пики поглощения в диапазоне 225-235 и 285-355 нанометров полученных поперечно сшитых полисахаридов могут быть свидетельством присутствия продуктов гликозилирования, по природе до некоторой степени подобных (но не обязательно идентичных) продуктам гликозилирования белка и конечным продуктам гликозилирования белка (AGE).

Материалы, используемые в экспериментах

Натриевую соль гепарина EP (Партия No. 9818030) получали от JUK Kraeber GmbH & Co, Hamburg, Germany.

Restylane® (лот номер 7349) и Restylane-Perlane (лот номер 7064) коммерчески доступны от Q-Med AB, Uppsala Sweden. Hylaform® Plus (лот номер R0409) коммерчески доступен от Genzyme Biosurgery (подразделение Genzyme Corporation) через их агента по продаже INAMED AESTHETICS, Ireland.

Гомогенизации Turrax осуществляли с помощью модели ULTRA TURRAX® T-25 (основная), коммерчески доступной от IKA®-WERKE, Germany, если не установлено иначе.

Все процедуры лиофилизации проводили с помощью модели сушилки FD 8 Freeze, коммерчески доступной от Heto Lab Equipment, Denmark. Температура конденсатора была -80°С. Температура хранения во время предварительного замораживания была -40°С. Температура хранения для лиофилизации была +30°С. Время предварительного замораживания было 8 часов и время лиофилизация было 24 часа. Вакуум во время лиофилизации был приблизительно 0,01 бар.

В таблице 1 ниже перечислены коммерческие источники материалов, используемых в экспериментах, описанных в данной заявке.

Таблица 1
Материал	Поставщик	Кат. №
Гидрохлорид N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида	Sigma	E7750
Дигидразид адипиновой кислоты	Sigma	A0638
Хитозан, средняя молекулярная масса	Aldrich	448877
D(-)-Арабиноза	Sigma	A3131
D(-)-Эритроза	Fluka	18934
DL-Глицеральдегид	Sigma	G5001
Цитохром С из бычьего сердца	Sigma	C2037
Дигидрат соли D-рибоза-5-фосфат динатрия	Sigma	83875
D(-)Фруктоза	Fluka	F0127
D(-)Рибоза	Sigma	R7500
D(+)Глюкоза	Sigma	49159
D(+)Сорбоза	Sigma	S4887
L(-)Сорбоза	Sigma	S3695
L(+)Фруктоза	Sigma	31140
Гидрохлорид D(+)глюкозамина	Sigma	G4875
Моногидрат мальтозы	Sigma	M5885
Моногидрат D(+)лактозы	Sigma	61340
1-Бутанол	Fluka	19430
1-Гексанол	Fluka	52840
2-Пропанол	Aldrich	32,047-1
Ацетон	Fluka	00585
Этилацетат	Fluka	45770
Дихлорметан	Sigma-Aldrich	443484
Диэтиловый эфир	Riedel de Haaen	32203
Этанол (абсолютный)	Merk	100983
Гексан	Fluka	52770
Толуол	Fluka	89682

Процедура I амино-функционализации HA

400 мг HA 150 (коммерчески доступной как продукт No. 2222003, гиалуронат натрия Pharma Grade 150 от NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway), имеющей молекулярную массу в диапазоне 1,4-1,8 МДа, или HA 80 (коммерчески доступной как продукт No. 2222002, гиалуронат натрия Pharma Grade 150 от NovaMatrix FMC Biopolymer, Oslo, Norway), имеющей молекулярную массу в диапазоне 0,62-1,15 МДа, растворяли в 350 мл DI воды, 7 грамм дигидразида адипиновой кислоты (ADH) добавляли к смеси. рH Полученного раствора доводили до 4,75 и раствор перемешивали в течение двух часов. 764 мг Гидрохлорида 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида растворяли в 2,0 мл DI воды и добавляли к смеси и pH снова доводили до 4,75 при комнатной температуре. Реакцию отслеживали по изменению pH и постоянно доводили его до 4,75. После того, когда уже нельзя было обнаружить никакого изменения pH, реакционную смесь оставляли на дополнительный час или на ночь. После этого раствор переносили в диализную пробирку и подвергали диализу против DI воды до тех пор, когда уже никакого ADH не обнаруживали при диализе. Подвергнутый диализу раствор переносили в 3,5 литра 100% этанола, добавляли 2 грамма NaCl и смесь перемешивали в течение одного часа. Для того чтобы отделить осажденную модифицированную HA, раствор центрифугировали в течение 20 минут при 7000 об/мин и супернатант удаляли. Полученную амино-функционализированную HA (AFHA) хранили при 4°С до использования.

Следует отметить, что во всех экспериментах поперечной сшивки с использованием AFHA, описанных ниже, амино-функционализированная HA, полученная в результате функционализации HA 80, соответственно упоминается как AFHA80 здесь далее, и амино-функционализированная HA, полученная в результате функционализации HA 150, соответственно упоминается как AFHA I 150 здесь далее. Эти два материала амино-функционализированной HA (AFHA80 и AFHA I 150) использовали для всех экспериментов поперечной сшивки HA, раскрытых здесь ниже).

Процедуры поперечной сшивки HA

Во всех экспериментах, описанных здесь далее, взбалтывани