Способ оценки внутриклеточного метаболизма нейтрофилов у работников нефтехимического и химического производства

Способ оценки внутриклеточного метаболизма нейтрофилов у работников нефтехимического и химического производства

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицине труда, и может быть использовано для оценки состояния метаболизма в клетках у работников нефтехимических и химических производств.

Нефтехимическая и химическая отрасли занимают одно из ведущих мест по потенциальной опасности химического воздействия, более 100 тысяч наименований химических веществ присутствует в воздухе рабочей зоны предприятий [Карамова Л.М. Профессиональный риск для здоровья работников химических и нефтехимических производств / Л.М.Карамова, Л.К.Каримова, Г.Р.Башарова. - Уфа, 2006. - 306 с.].

В основе механизма токсического действия большинства химических соединений лежит их способность взаимодействовать с молекулами клеточных органелл и мембран, что обуславливает нарушение внутриклеточного метаболизма в организме у работников нефтехимической и химической отрасли [Газалиева М.А. Цитохимические показатели в клетках слизистой оболочки носа и периферической крови у рабочих бериллиевого производства // Гигиена санитария. - 2010. - №1. - С.69-70].

Нарушение внутриклеточного метаболизма предшествует развитию различных заболеваний, в т.ч. заболеваний, обусловленных профессиональными факторами [Базарный В.В. Цитохимическая характеристика нейтрофильных гранулоцитов при различных вариантах ишемической болезни сердца / В.В.Базарный, Е.А.Тихонина, Ю.В.Шилко // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - №8. - С.48 -49].

Клетки представляют собой сложно организованные системы, в которых протекают окислительно-восстановительные, гидролитические и другие процессы. К настоящему времени известны тысячи отдельных биохимических реакций, изучены участвующие в них ферменты.

Кислая и щелочная фосфатазы характеризуют функциональное состояние клеток как гидролитических систем, участвуют в обмене углеводов, нуклеотидов и фосфолипидов. Эти гидролитические системы имеют отношение к процессам внутриклеточного переваривания. Функция фосфатаз в организме состоит в поддержании концентрации фосфата, необходимого для различных биохимических процессов. Значительная активность фосфатазы в клетке свидетельствует о дестабилизации лизосомных мембран.

Миелопероксидаза, наиболее чувствительная к вредному воздействию химических веществ, обладает антиоксидантными свойствами и является показателем снижения секреторной функции органелл в клетках [Hayhoe, F.G. J. Haematological cytochemistry / F.G. J. Hayhoe, D. Quaglino. - New Jork, 1983. - 197 Р].

Гликоген, как один из продуктов метаболического превращения глюкозы, является важнейшим субстратом дыхания и гликолиза. Гликоген характеризует энергетические процессы, протекающие в клетках. Благодаря гликогену клетки обладают способностью ресинтезировать АТФ в анаэробных условиях. Внутриклеточный гликоген играет важную роль в обеспечении клеток энергией для осуществления ими специфических функции [Нагоева М.Х. Содержание гликогена в нейтрофильных гранулоцитах при ангинах различной природы // Современные наукоемкие технологии. - 2005. - №4 - С.95-96].

Известен способ определения активности кислой фосфатазы (КФ) с помощью реакции азосочетания по Goldberg и Barka (1962), щелочной фосфатазы (ЩФ) - по М.Г.Щубич, (1965); миелопероксидазы (МПО) - по методу Грэхема-Кнолля (1983), гликогена - по методу А.Л.Шабадаша (1947) [Hayhoe, F.G. J. Haematological cytochemistry / F.G. J. Hayhoe, D. Quaglino. - New Jork, 1983. - 197 Р].

Известен способ исследования метаболической активности нейтрофилов [Виксман М.Е., Маянский А.Н. Характеристика опсонических факторов по реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1980, т.89, №2, с.214-215].

Прототипом изобретения является способ исследования поглотительной и метаболической активности нейтрофилов периферической крови методами фагоцитоза и нст-теста, заключающийся в том, что гепаринизированную венозную кровь разливают в пять конических пробирок по 0,1 мл, первые три из которых содержат по 0,1 мл суспензии неокрашенного латекса с размером частиц 1,5 мкм, 4-я - 0,1 мл среды 199 и 0,1 мл 0,1% водного раствора нитросинего тетразолия (НСТ), 5-я - 0,1 мл суспензии латекса и 0,1 мл 0,1% водного раствора НСТ. Инкубируют в термостате при t 37°С: 1-ю пробирку - 5 мин, 2-ю - 30 мин, 3-ю - 1 час, 4-ю и 5-ю - 40 мин. Готовят из 0,2 мл инкубационной смеси мазки на стеклах, высушивают при t 37°С, фиксируют в пламени горелки, окрашивают 1% водным раствором метиленового синего, повторно высушивают и микроскопируют под иммерсией при увеличении 90×10. Результаты исследования оценивают по поглотительной активности в реакциях фагоцитоза, определяя процент фагоцитирующих клеток, фагоцитарное число, фагоцитарный интегральный индекс и показатели скорости фагоцитоза. Реакцию НСТ-теста определяют путем подсчета процента формазан-позитивных клеток, вычисления цитохимического показателя активности и индекса стимуляции НСТ-теста (патент RU 2249215, 2005 г.).

Однако не существует интегрального показателя, в целом характеризующего степень нарушения различных сторон метаболизма.

Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного способа оценки внутриклеточного метаболизма у работников нефтехимической и химической промышленности.

Технический результат - получение интегральной оценки состояния внутриклеточного метаболизма у работников химического и нефтехимического производства при обследованиях.

Предлагаемый способ оценки внутриклеточного метаболизма осуществляется следующим образом:

1. Приготовление мазков крови.

4 мазка крови делают на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного стекла. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается "метелочкой". После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска.

Сухие мазки крови фиксируют в 10% спирт - формалиновой смеси 10 сек - для определения МПО, 30 сек - для определения КФ и ЩФ, 10 мин - для гликогена. Промывают проточной водой.

2.Приготовление рабочих растворов.

Для миелопероксидазы - растворяют содержимое одного флакона бензидина в 3 мл 96° этилового спирта и доливают 2 мл дистиллированной воды. Хорошо взбалтывают и перед употреблением добавляют пипеткой 1 каплю 3% перекиси водорода.

Для кислой фосфатазы - приготавливают ацетатный буфер (содержимое флакона ацетата Na растворяют в колбе в 500 мл дистиллированной воды, охлаждают. 20 мг нафтола-AS-фосфата растворяют в 0,5 мл диметилформамида, доливают 40 мл холодного ацетатного буфера), приготавливают 4% раствор азотистокислого Na (содержимое флакона с азотистокислым Na растворяют в 10 мл дистиллированной воды, в отдельной небольшой посуде (пробирке) смешивают 8 капель парарозанилина и 8 капель 4% раствора азотистокислого Na). Полученные растворы тщательно смешивают, отфильтровывают (рН должен быть 5,2-5,4).

Для щелочной фосфатазы - приготавливают 0,05 М буферного раствора (к содержимому флакона маточного раствора пропандиолового буфера добавляют 70 мл дистиллированной воды (рН 9,6-9,7)), приготавливают 2% раствор метилового зеленого (содержимое флакона метилового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды и выливают в делительную воронку. В ту же воронку заливают 50 мл хлороформа. Экстрагируют хлороформом, полученный метиленовый фиолетовый удаляют). Приготавливают раствор из содержимого флакона с альфа-нафтилфосфатом натрия с 5 мл 0,05 М буферного раствора и добавляют содержимое флакона прочного синего РР, перемешивают.

Для гликогена - содержимое флакона с йодной кислотой растворяют в 50 мл дистиллированной воды (получают 1% раствор йодной кислоты).

Рабочие растворы хранятся в течение 3 месяцев в темном месте и используются на 6-15 исследований.

3.Окраска мазков.

На миелопероксидазу - на предметное стекло приливают рабочий раствор, оставляют на 15-20 мин, промывают дистиллированной водой и промачивают фильтровальной бумагой, промывают стекла в проточной воде. Докрашивают 0,5% раствором красителя по Романовскому (15-20 мин), промывают стекла в проточной воде, высушивают.

На кислую фосфатазу - помещают в свежеприготовленный рабочий раствор, инкубируют в темноте при t 37°С (2-3 часа), промывают дистиллированной водой и промачивают фильтровальной бумагой, докрашивают ядра гематоксилином Майера (15 мин), промывают стекла в проточной воде, высушивают.

На щелочную фосфатазу - инкубируют в субстратной смеси (10 мин) при комнатной температуре, промывают проточной водой, докрашивают 2% раствором метилового зеленого в течение (15 мин), высушивают.

На гликоген - помещают мазки в 1% раствор йодной кислоты (10 мин), промывают дистиллированной водой и промачивают фильтровальной бумагой, помещают мазки в реактив Шиффа (30 мин), промывают в проточной воде, докрашивают мазки гематоксилином Майера (15 мин), промывают в проточной воде, высушивают.

4. Микроскопия и подсчет СЦК, % фосфатазоположительных клеток.

Для подсчета кислой и щелочной фосфатазы используют принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски.

В зависимости от окраски исследуемые клетки делят на 4 группы:

с отрицательной реакцией (-),

слабоположительной (+),

положительной (++)

резко положительной (+++).

Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски суммируют и вычитают количество клеток без окраски, результат выражают в процентах. Результат выражают в % фосфатазоположительных клеток.

Для подсчета миелопероксидазы и гликогена рассчитывают средний цитохимический коэффициента (СЦК) по Каплоу (1955). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по степени интенсивности окраски, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумму этих произведений делят на 100, что и составляет СЦК.

5. Оценка показателя нарушения метаболизма

Полученные значения сопоставляют с референтными значениями [Методические рекомендации по разработке референтных величин лабораторных показателей: Мет.рекомендации / В.В.Меньшиков, Л.М.Пименова. - М., 1983, Биохимические и цитохимические методы определения активности ферментов и фермент-субстратных систем различной клеточной локализации: мет.рекомендации / Р.В.Меркурьева, Г.Л.Билич, Р.П.Нарциссов. - М., 1982, 19-21 с.].

Референтные значения

МПО=2,23-2,89 у.е.	КФ=17-30%
Гликоген=1,74-2,04 у.е.	ЩФ=18-54%

Для оценки состояния внутриклеточного метаболизма вводят показатель степени нарушения метаболизма в нейтрофиле (ПНМ), характеризующий нарушение процессов в нейтрофиле. ПНМ рассчитывается как сумма условных единиц, характеризующих состояние каждого из 4-х показателей (значение, отклоненное от референтных значений, соответствует 1, значение в пределах референтных значений соответствует 0), и изменяется в интервале от 0-4.

Степень нарушения внутриклеточного метаболизма оценивают по значению ПНМ

0 - метаболизм в клетке в норме (ПНМ=0)

I - легкая степень нарушения внутриклеточного метаболизма (ПНМ=1)

II - средняя степень нарушения внутриклеточного метаболизма (ПНМ=2)

III - высокая степень нарушения внутриклеточного метаболизма (ПНМ=3-4)

Пример 1. Работник А., стаж работы - 10 лет, возраст - 34 года. Диагноз: хронический профессиональный бронхит. Находился на стационарном лечении в клинике института медицины труда и экологии человека.

При поступлении в мазке крови (в нейтрофилах) определен уровень миелопероксидазы (2,16 у.е.), гликогена (2,11 у.е.), кислой фосфатазы (55%), щелочной фосфатазы (76%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,16 у.е., значительно ниже референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,11 у.е, значительно выше референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 1.

Уровень кислой фосфатазы - 55%, превышает референтые значения 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень щелочной фосфатазы - 76%, превышает референтые значения 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=1+1+1+1=4.

Рассчитанный ПНМ был равен 4, что соответствует степени III - высокой степени нарушения внутриклеточного метаболизма.

На 3-ий день в мазке крови (в нейтрофилах) определен уровень миелопеоксидазы (2,18 у.е.), гликогена (2,08 у.е.), кислой фосфатазы (37%), щелочной фосфатазы (51%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,18 у.е., ниже референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,08 у.е, значительно выше референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 1.

Уровень кислой фосфатазы - 37%, превышает референтые значения 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень щелочной фосфатазы - 51%, находится в пределах референтых значений 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=1+1+1+0=3.

Рассчитанный ПНМ был равен 3,что соответствует степени III - высокой степени нарушения внутриклеточного метаболизма.

Через 6 дней в мазке крови (в нейтрофилах) определен уровень миелопеоксидазы (2,24 у.е.), гликогена (2,09 у.е.), кислой фосфатазы (38%), щелочной фосфатазы (50%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,24 у.е., находится в пределах референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,09 у.е, значительно выше референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 1.

Уровень кислой фосфатазы - 38%, превышает референтые значения 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 1.

Уровень щелочной фосфатазы - 50%, находится в пределах референтых значений 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=0+1+1+0=2.

Рассчитанный ПНМ был равен 2,что соответствует степени II - средней степени нарушения внутриклеточного метаболизма.

При выписке в мазке крови определен уровень миелопеоксидазы (2,26 у.е.), гликогена (2,08 у.е.), кислой фосфатазы (25%), щелочной фосфатазы (46%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,26 у.е., находится в пределах референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,08 у.е, выше референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 1.

Уровень кислой фосфатазы - 25%, находится в пределах референтых значений 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень щелочной фосфатазы - 46%, находится в пределах референтых значений 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=0+1+0+0=1.

Рассчитанный ПНМ был равен 1,что соответствует степени I-легкой степени нарушения метаболизма.

Пример 2. Работник В.. стаж работы - 5 лет, возраст - 29 лет.

Диагноз: здоров.

В мазке крови определен уровень миелопеоксидазы (2,56 у.е.), гликогена (2,00 у.е.), кислой фосфатазы (27%), щелочной фосфатазы (49%).

Уровень миелопероксидазы в нейтрофиле - 2,56 у.е., находится в пределах референтных значений 2,23-2,89 у.е., следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень гликогена в нейтрофиле - 2,00 у.е, находится в пределах референтных значений 1,74-2,04 у.е., следовательно, данное отклонение также условно принимают за 0.

Уровень кислой фосфатазы - 27%, находится в пределах референтых значений 17-30%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

Уровень щелочной фосфатазы - 49%, находится в пределах референтых значений 18-54%, следовательно, данное отклонение условно принимают за 0.

ПНМ, полученный, как сумма условно принятых единиц:

ПНМ=0+0+0+0=0.

Рассчитанный ПНМ был равен 0, что соответствует степени 0 - нормальному метаболизму в клетках.

Способ оценки внутриклеточного метаболизма нейтрофилов периферической крови, включающий исследование мазков крови, отличающийся тем, что в мазке крови определяют содержание миелопероксидазы, гликогена, кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, сравнивают с соответствующими референтными значениями каждого показателя, при этом отклонение от референтных значений принимают за единицу, значение в пределах референтных значений - ноль, после чего определяют показатель нарушения метаболизма (ПНМ) как сумму условных единиц, характеризующих состояние каждого из четырех показателей; при значении ПНМ, равном нулю, внутриклеточный метаболизм у работников нефтехимического и химического производства оценивают как норму, при значении ПНМ, равном 1, оценивают легкую степень нарушения внутриклеточного метаболизма, при значении ПНМ, равном 2, оценивают среднюю степень нарушения внутриклеточного метаболизма, при значении ПНМ, равном 3-4, - высокую степень нарушения внутриклеточного метаболизма.