Вакцины на основе пептида foxp3

Вакцины на основе пептида foxp3

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США 60/878615, поданной 3 января 2007, и предварительной заявки США 60/896472, поданной 22 марта 2007, содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

Настоящее изобретение относится к области биологии, более конкретно к терапии рака. Конкретно, настоящее изобретение относится к пептидам Foxp3, которые необычайно эффективны в качестве противораковых вакцин, и к лекарственным средствам для лечения и профилактики опухолей.

Предшествующий уровень техники

Было показано, что CD8+ цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) распознают пептидные эпитопы, выделенные из связанных с опухолями антигенов (TAA), присутствующих на молекуле MHC класса I, и затем уничтожают опухолевые клетки. С момента обнаружения MAGE-семейства, первого примера антигенов TAA, было обнаружено много других антигенов TAA с использованием иммунологических способов (Boon T, Int J Cancer 54: 177-80, 1993; Boon T et al., J Exp Med 183: 725-9, 1996; van der Bruggen P et al., Science 254: 1643-7, 1991; Brichard V et al., J Exp Med 178: 489-95, 1993; Kawakami Y et al., J Exp Med 180: 347-52, 1994), и некоторые из них находятся в настоящее время в процессе клинического исследования в качестве мишеней иммунотерапии.

Идентификация новых антигенов TAA, которые индуцируют сильный и специфичный противоопухолевый иммунный ответ, стала основанием для дальнейшей разработки клинического применения стратегий пептидной вакцинации для различных типов рака (Harris CC, J Natl Cancer Inst 88: 1442-5, 1996; Butterfield LH et al., Cancer Res 59: 3134-42, 1999; Vissers JLM et al., Cancer Res 59: 5554-9, 1999; Van der Burg SH et al., J Immunol 156: 3308-14, 1996; Tanaka F et al., Cancer Res 57: 4465-8, 1997; Fujie T et al., Int J Cancer 80: 169-72, 1999; Kikuchi M et al., Int J Cancer 81: 459-66, 1999; Oiso M et al., Int J Cancer 81: 387-94, 1999).

Были выполнены различные типы антиген-специфичной иммунотерапии, однако до сих пор получали низкую клиническую эффективность из-за очевидной опухолевой регрессии (Rosenberg SA et al., Nat Med 10:909-15, 2004). Одной из главных причин является слабый иммунный ответ противоопухолевых эффекторных лимфоцитов (TIL) и лимфоцитов периферической крови (PBL) у пациентов с поздней стадией рака (Miescher S et al., J Immunol 136: 1899-907, 1986). Такая иммуносупрессия, индуцированная опухолью, является причиной слабого ответа на опухолевые антигены (Young RC et al., Am J Med 52: 63-8, 1972), слабой пролиферации Т-клеток (Alexander JP et al., Cancer Res 53: 1380-7, 1993), причиной ослабления продукции цитокинов (Horiguchi S et al., Cancer Res 59: 2950-6, 1999) и дефектной сигнальной трансдукции Т-клеток и природных клеток-киллеров (Kono K et al., Clin Cancer Res 11: 1825-8, 1996, Kiessling R et al., Cancer Immunol Immunother 48: 353-62, 1999).

Для улучшения клинической эффективности иммунотерапии важным является преодоление эффекта иммуносупрессивных факторов, индуцированных опухолями. Иммунологическую толерантность и защиту от аутоиммунности обеспечивают центральный и периферический механизмы, включая клональную делецию самоактивирующихся T-клеток в тимусе и индукцию анэргии при встрече с аутоантигенами на периферии. Недавно стало ясно, что регуляторные Т-клетки (T-reg), характеризующиеся ко-экспрессией маркеров CD4 и CD25, представляют собой функционально уникальную популяцию Т-клеток и функционируют для поддержания иммунного гомеостаза (Sakaguchi S et al., J Immunol. 155: 1151-64, 1995, Dieckmann D et al., J Exp Med 193: 1303-10, 2001). Клетки T-reg являются одним из главных участников подавления различных типов иммунного ответа (Miescher S et al., J Immunol 136: 1899-907, 1986; Young RC et al., Am J Med 52: 63-72, 1972; Alexander JP et al., Cancer Res 53: 1380-7, 1997; Horiguchi S et al., Cancer Res 59: 2950-6, 1999; Kono K et al., Clin Cancer Res 11: 1825-8, 1996; Kiessling R et al., Cancer Immunol Immunother 48: 353-62, 1999).

Хотя молекулярные взаимодействия и сигнальные пути, которые являются важными для создания и функционирования клеток T-reg, еще до конца не ясны, клетки T-reg требуют наличия транскрипционного фактора скурфин (scurfin) семейства Forkhead (Foxp3; SEQ ID NO:2), кодируемого геном Foxp3 (GenBank Accession No. NM_014009; SEQ ID NO:1), который контролирует их развитие и регуляторные свойства (Fontenot JD et al., Nat Immunol 4: 330-6, 2003, Hori S et al., Science 299: 1057-61, 2003, Khattri R et al., Nat Immunol 4: 304-6, 2003). Кроме того, вакцинация мышей дендритными клетками, трансфецированными мРНК Foxp3, вызывает Foxp3-специфичный ответ клеток CTL (Smita N et al., Cancer Res. Jan 1; 67(l):371-80, 2007).

Таким образом, Foxp3 служит мишенью для противораковой иммунотерапии и, более того, неполные пептиды белка, кодируемого геном Foxp3, служат в качестве антигенов, распознаваемых клетками CTL.

Сущность изобретения

Для повышения клинической эффективности иммунотерапии важно подавить иммуносупрессивные факторы, индуцированные опухолью. Было обнаружено, что клетка T-reg является одним из главных участников подавления различных типов иммунного ответа. Таким образом, необходимо разработать вакцины, направленные на клетки T-reg, экспрессирующие Foxp3, чтобы подавить T-reg-индуцированную иммуносупрессию.

Настоящее изобретение основано, по крайне мере отчасти, на идентификации пептидов эпитопа генного продукта Foxp3, которые вызывают ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), специфичных к соответствующим пептидам Foxp3 или эпитопам. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) здорового донора стимулировали, используя HLA-A*24- и HLA-A*02-связывающие кандидатные пептиды Foxp3. Было показано, что эти пептиды являются пептидами с эпитопами, ограниченными HLA-A24- или HLA-A02, которые могут индуцировать эффективный и специфичный иммунный ответ в отношении клеток T-reg, экспрессирующих Foxp3.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способам регуляции иммуносупрессии, включающим стадию введения полипептидов Foxp3 по изобретению. Антииммуносупрессия (т.е. реверсия или противодействие иммуносупрессии), например, цитотоксических T-лимфоцитов индуцируется с помощью введения полипептидов Foxp3. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам индукции антииммуносупрессии, включающим стадию введения полипептидов Foxp3, а также к фармацевтическим средствам для регуляции иммуносупрессии, включающим полипептиды Foxp3.

В одном аспекте изобретение относится к пептидам, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:3-5, 7-9, 12, 15-19, 22, 24, 27-30, 37, 67 или 74.

В другом аспекте изобретение относится к пептидам, обладающим способностью индуцировать цитотоксические Т-клетки, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из группы:

(a) SEQ ID NO:3-5, 7-9, 12, 17, 67 или 74; и

(b) SEQ ID NO:3-5, 7-9, 12, 17, 67 или 74, в которых заменены или введены 1, 2 или несколько аминокислот.

В следующем аспекте изобретение относится к пептидам, обладающим способностью индуцировать цитотоксические Т-клетки, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из группы:

(a) SEQ ID NO:15-19, 22, 24, 27-30 или 37, и

(b) SEQ ID NO:15-19, 22, 24, 27-30 или 37, в которых заменены или введены 1, 2 или несколько аминокислот.

Что касается вариантов осуществления, в некоторых вариантах осуществления второй аминокислотой с N-конца является фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан. В некоторых вариантах осуществления C-концевой аминокислотой является фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин. В некоторых вариантах осуществления второй аминокислотой с N-конца является лейцин или метионин. В некоторых вариантах осуществления C-концевой аминокислотой является валин или лейцин. Например, пептид, содержащий замены, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:95, 97 или 98.

Изобретение дополнительно относится к композициям, содержащим пептиды Foxp3 по изобретению или полинуклеотиды, кодирующие пептиды Foxp3 по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В некоторых вариантах осуществления композиции приготовлены для введения в виде вакцины.

Композиции могут содержать один пептид или множество различных пептидов Foxp3 по изобретению. Композиции могут применяться для ингибирования клеток T-reg, например для ингибирования пролиферации или подавления функции клетки T-reg.

В некоторых вариантах осуществления композиции содержат один или несколько пептидов Foxp3, которые вызывают иммунный ответ, который ингибирует клетки T-reg у индивида, антиген HLA которого представляет собой HLA-A24. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат один или несколько пептидов Foxp3, которые вызывают иммунный ответ, который ингибирует клетки T-reg у индивида, антиген HLA которого представляет собой HLA-A02.

В другом аспекте изобретение относится к композициям, содержащим полинуклеотид, кодирующий пептид Foxp3 по изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат множество (т.е. два или несколько) полинуклеотидов, кодирующих множество пептидов Foxp3 по изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат полинуклеотид, который кодирует множество пептидов Foxp3 по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления композиции содержат другой пептид, который обладает способностью индуцировать цитотоксические Т-клетки против раковых клеток, или содержат другой полинуклеотид, кодирующий этот другой пептид.

В следующем аспекте изобретение относится к экзосоме, которая презентирует на своей поверхности комплекс, содержащий антиген HLA и пептид Foxp3 по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антиген HLA выбран из группы, состоящей из антигенов HLA-A24, HLA-A2402, HLA-A02 и HLA-A0201.

В подобном аспекте изобретение относится к способам лечения рака (например, уменьшения роста опухолевых клеток, стимулирования смерти опухолевых клеток) путем введения индивиду пептида Foxp3 или полинуклеотида, кодирующего этот пептид Foxp3.

В другом аспекте изобретение относится к способам индукции антиген-презентирующих клеток, обладающих высокой способностью индуцировать цитотоксические Т-клетки, путем введения пептида Foxp3 по изобретению или полинуклеотида, кодирующего этот пептид Foxp3.

В другом аспекте изобретение относится к способам индукции цитотоксических Т-клеток путем введения пептида Foxp3 по изобретению или полинуклеотида, кодирующего этот пептид Foxp3.

В подобном аспекте изобретение относится к выделенной цитотоксической Т-клетке, индуцируемой пептидом Foxp3 по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к антиген-презентирующей клетке, которая содержит комплекс, образованный антигеном HLA и пептидом Foxp3 по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антиген-презентирующая клетка является выделенной.

В следующем аспекте изобретение относится к способам регуляции клеток T-reg у индивида, включающим введение индивиду вакцины, содержащей пептид Foxp3 по изобретению или иммунологически активный фрагмент пептида или полинуклеотид, кодирующий этот пептид.

При применении способов лечения индивидуумом или пациентом может являться человек.

Следует понимать, что и описанная выше сущность изобретения, и следующее подробное описание представляют собой конкретные варианты осуществления и не ограничивают изобретение или другие альтернативные варианты осуществления изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг.1. На фиг.1 изображены фотографии, показывающие результаты анализа IFN-γ-ELISPOT на клетках CTL, которые индуцировали пептидами, полученными из Foxp3. На фиг.1A клетки CTL в лунках с номерами #2 и 7, стимулированные Foxp3-A24-9-363 (SEQ ID NO:3), #1 и #6, стимулированные Foxp3-A24-9-366 (SEQ ID NO:7), #5, стимулированные Foxp3-A24-9-190 (SEQ ID NO:9) и #7, стимулированные Foxp3-A24-10-87 (SEQ ID NO:67) и Foxp3-A24-10-60 (SEQ ID NO:74), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем. На фиг.1B клетки CTL в лунке под номером #4, стимулированные Foxp3-A24-9-207 (SEQ ID NO:4), #6, стимулированные Foxp3-A24-9-332 (SEQ ID NO:5), #6, стимулированные Foxp3-A24-9-337 (SEQ ID NO:8), и #1, стимулированные Foxp3-A24-10-l14 (SEQ ID NO:12), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем.

Фиг.2A-B. На фиг.2 изображены фотографии, показывающие результаты анализа IFN-γ-ELISPOT на клетках CTL, которые индуцировали пептидами, полученных из Foxp3. На фиг.2A, клетки CTL в лунке под номером #2, стимулированные Foxp3-A2-9-390 (SEQ ID NO:15), #2, стимулированные Foxp3-A2-9-69 (SEQ ID NO:16), #6, стимулированные Foxp3-A2-9-252 (SEQ ID NO:17), #4, стимулированные Foxp3-A2-10-359 (SEQ ID NO:22), #7, стимулированные Foxp3-A2-263 (SEQ ID NO:24), и #2 и #5, стимулированные Foxp3-A2-10-94 (SEQ ID NO:27), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем. На фиг.2B, клетки CTL во всех лунках, стимулированные Foxp3-A2-10-233 (SEQ ID NO:28), в лунках с номерами #6 и #7, стимулированные Foxp3-A2-10-152 (SEQ ID NO:29), #5, стимулированные Foxp3-A2-10-77 (SEQ ID NO:30), и #l, стимулированные Foxp3-A2-10-246 (SEQ ID NO:37) и Foxp3-A2-10-94 (SEQ ID NO:27), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем.

Фиг.2C. На фиг.2C, клетки CTL в лунках с номерами #1, #2, #4, #5, #7, #9, #11 и #12, стимулированные Foxp3-A2-9-390 (SEQ ID NO:15), #5 и #11, стимулированные Foxp3-A2-9-304 (SEQ ID NO:19), #7, стимулированные Foxp3-A2-9-68 (SEQ ID NO:7), и #12, стимулированные Foxp3-A2-9-252 (SEQ ID NO:17), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем.

Фиг.3A-D. На фиг.3 показано, что клетки в положительных лунках были размножены и был осуществлен анализ IFN-γ-ELISA. На фиг.3A, B и C, клеточные линии CTL, стимулированные Foxp3-A02-9-390 (SEQ ID NO:15) (сплошной ромб), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем (сплошной квадрат). На фиг.3D, клеточные линии CTL, стимулированные Foxp3-A02-9-252 (SEQ ID NO:17) (сплошной ромб), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем (сплошной квадрат).

Фиг.3E-G. На фиг.3E, клеточные линии CTL, стимулированные Foxp3-A24-10-60 (SEQ ID NO:74) (сплошной ромб), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем (сплошной квадрат). На фиг.3F клеточные линии CTL, стимулированные Foxp3-A02-10-94 (SEQ ID NO:27) (сплошной ромб), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем (сплошной квадрат). На фиг.3G клеточные линии CTL, стимулированные Foxp3-A24-10-87 (SEQ ID NO:67) (сплошной ромб), продемонстрировали эффективное продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем (сплошной квадрат).

Фиг.4. На фиг.4 показана специфичная активность клеток CTL в отношении клеток-мишеней, эндогенно экспрессирующих Foxp3 и HLA-A* 02 или 24. На фиг.4A и B, клеточные линии CTL, выращенные в присутствии Foxp3-A02-9-390 (SEQ ID NO:15) и Foxp3-A02-9-252 (SEQ ID NO:17), продемонстрировали высокоспецифичную активность клеток CTL в отношении клеток 293T, которые были трансфецированы с помощью обоих генов Foxp3 и HLA-A02. С другой стороны, не было продемонстрировано существенной специфичной активности клеток CTL в отношении контролей. На фиг.4C, клеточные линии CTL, выращенные в присутствии Foxp3-A02-9-252 (SEQ ID NO:17) продемонстрировали высокоспецифичную активность клеток CTL в отношении клеток 293T, которые были трансфецированы с помощью обоих генов Foxp3 и HLA-A24. С другой стороны, не было продемонстрировано существенной специфичной активности клеток CTL в отношении контролей.

Фиг.5. На фиг.5 показан in vivo анализ иммуногенности пептида Foxp3-252_h и пептида Foxp3-252_m. IFA-конъюгированный пептид или индивидуально IFA вводили подкожно мышам BALB/c в дни 0 и 7. На 14 день спленоциты вакцинированных мышей собирали и использовали в качестве клеток-респондеров. 1×10⁴ RLmalel клеток, стимулированных соответствующим пептидом (сплошной квадрат) или в отсутствие пептида (не закрашенный квадрат), использовали для анализа IFN-γ-ELISPOT. Вакцинацию с использованием Foxp3-252_h (A) и Foxp3-252_m (B) осуществляли пяти мышам (M1-M5) и в качестве контроля в каждом анализе осуществляли инъекцию IFA в отсутствие какого-либо пептида трем мышам (N1-N3).

Фиг.6. На фиг.6 показаны in vivo противоопухолевые эффекты вакцинации с использованием пептида эпитопа Foxp3. 1×10⁵ клеток клеточной линии 4Tl рака груди вводили мышам BALB/c в день 0. IFA-конъюгированный пептид Foxp3-252_h (-не закрашенный круг-), IFA-конъюгированный пептид Foxp3-252_m (-сплошной квадрат-), индивидуально IFA в отсутствие пептида (-сплошной треугольник-) вводили в дни 3 и 10. В качестве контроля нормального роста опухоли в этом анализе также получали невакцинированных мышей (-x-). Наблюдали существенное отличие в подавлении роста опухоли при вакцинации с помощью пептида эпитопа Foxp3. *, P<0,01; **, P<0,005.

Фиг.7A-B. На фиг.7 показан анализ аффинности пептида Foxp3-9-252, содержащего замены, в отношении молекулы HLA. На фиг.7A клетки CTL, индуцированные Foxp3-9-252-WT, распознают клетки, презентирующие пептид Foxp3-9-252-9V на молекуле HLA-A2. Осуществляли IFN-γ-ELISPOT анализ с использованием клеточной линии CTL, индуцированной пептидом Foxp3-9-252-WT, в качестве клеток-респондеров, и клеток T2, стимулированных пептидом Foxp3-9-252-WT или пептидом Foxp3-9-252-9V, в качестве стимулирующих клеток соответственно. Клетки T2 без стимулирования пептидом получали в качестве контроля. На фиг.7B Foxp3-9-252-9V и Foxp3-9-252-WT продемонстрировали сходную аффинность в отношении молекулы HLA-A2. Осуществляли анализ IFN-γ-ELISA с использованием клеточной линии CTL, индуцированной пептидом Foxp3-9-252-WT, в качестве клеток-респондеров (1×10⁵ клеток/лунка), и клеток T2, стимулированных пептидом Foxp3-9-252-WT (-сплошной круг-), пептидом Foxp3-9-252-9V (-не закрашенный круг-) или HIV-A02 (-сплошной треугольник-), в качестве стимулирующих клеток (1×10⁴ клеток/лунка). Пептидное стимулирование стимулирующих клеток проводили при 37 градусах по Цельсию в течение 2 часов с каждым типом пептида и с каждой концентрацией пептида.

Фиг.7C-D. На фиг.7C клетки CTL могли быть индуцированы с помощью стимулирования пептидом Foxp3-9-252, содержащим замены, нацеленного на молекулу HLA-A2. Клетки CTL для всех пептидов, содержащих замены, нацеленных на молекулу HLA-A2, получали таким способом, как описано в разделе "Материалы и способы". Клетки в лунках с номерами 3 и 7, стимулированные Foxp3-9-252-3M, в лунке под номером 7, стимулированные Foxp3-9-252-3L, и в лунке под номером 8, стимулированные Foxp3-9-252-9V, продемонстрировали продуцирование IFN-γ по сравнению с контролем. На фиг.7D клетки CTL, полученные с помощью Foxp3-9-252-9V, распознают стимулирующие клетки, покрытые пептидом Foxp3-9-252-WT. Клеточную линию CTL, индуцированную с помощью Foxp3-9-252-9V-пептида, использовали в качестве клеток-респондеров. Клетки T2, инкубированные в присутствии пептида Foxp3-9-252-9V (-сплошной круг-), или в присутствии пептида Foxp3-9-252-WT (-не закрашенный круг-), или в отсутствие пептида (-не закрашенный квадрат-), использовали в данном анализе в качестве стимулирующих клеток (1×10⁴ клеток/лунка).

Подробное описание изобретения

I. Определения

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в описании взаимозаменяемо и означают полимер, состоящий из аминокислотных остатков. Термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются модифицированными остатками или синтетическими остатками, например, к искусственному химическому миметику соответствующей природной аминокислоты, кроме того, термины применяют к природным аминокислотным полимерам.

Как используется в настоящем описании, термин "аминокислота" означает природные и синтетические аминокислоты, а также аналоги аминокислот и миметики аминокислот, которые функционируют подобно природным аминокислотам. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и O-фосфосерин). Термин "аналог аминокислоты" означает соединения, которые имеют такую же основную химическую структуру (атом альфа-углерода, связанный с водородом, карбоксигруппа, аминогруппа и R-группа), как и природная аминокислота, но имеют модифицированную R-группу или модифицированные остовы (например, гомосерин, норлейцин, метионин сульфоксид, метионин метилсульфоний). Термин "миметик аминокислоты" означает химические соединения, которые имеют отличную структуру, но функцию, сходную с функцией основных аминокислот.

Аминокислоты обозначаются в данном случае с помощью общеизвестных трехбуквенных символов или однобуквенных символов, рекомендованных Комиссией Биохимической Номенклатуры IUPAC-IUB.

Термины "ген", "полинуклеотиды", "нуклеотиды" и "нуклеиновые кислоты" используются взаимозаменяемо, если не указано иное, и аналогично аминокислотам обозначаются с помощью общепринятых однобуквенных кодов.

Если не указано иного, все технические и научные термины, используемые в описании, имеют значение, общепринятое в кругу специалистов в данной области, к которой относится настоящее изобретение. В случае возникновения разночтения настоящее описание, в том числе определения, следует истолковывать как руководство.

II. Пептиды

Для того чтобы продемонстрировать, что пептиды, полученные из Foxp3, функционируют как антигены, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками (CTL), в настоящем изобретении были проанализированы пептиды, которые являются подпоследовательностями Foxp3, на предмет того, являются ли они антигенными эпитопами, ограниченными HLA-A24 или HLA-A02, которые являются широко распространенными на земле HLA-аллелями (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). Возможные HLA-A24- и HLA-A02-связывающие пептиды, которые являются подпоследовательностями Foxp3, идентифицировали на основе информации об аффинности связывания с HLA-A24 и HLA-A02. После in vitro стимуляции T-клеток дендритными клетками (DC), инкубированными с этими пептидами, успешно получали клетки CTL, используя последовательности:

Foxp3-A24-9-363 (SEQ ID NO:3),

Foxp3-A24-9-366 (SEQ ID NO:7),

Foxp3-A24-9-190 (SEQ ID NO:9),

Foxp3-A24-9-207 (SEQ ID NO:4),

Foxp3-A24-9-332 (SEQ ID NO:5),

Foxp3-A24-9-337 (SEQ ID NO:8),

Foxp3-A24-10-114 (SEQ ID NO:12),

Foxp3-A2-9-390 (SEQ ID NO:15),

Foxp3-A2-9-69 (SEQ ID NO:16),

Foxp3-A2-9-252 (SEQ ID NO:17),

Foxp3-A2-10-359 (SEQ ID NO:22),

Foxp3-A2-10-263 (SEQ ID NO:24),

Foxp3-A2-10-94 (SEQ ID NO:27),

Foxp3-A2-10-233 (SEQ ID NO:28),

Foxp3-A2-10-152 (SEQ ID NO:29),

Foxp3-A2-10-77 (SEQ ID NO:30),

Foxp3-A2-10-246 (SEQ ID NO:37),

Foxp3-A2-9-68 (SEQ ID NO:18),

Foxp3-A2-9-304 (SEQ ID NO:19),

Foxp3-A24-10-87 (SEQ ID NO:67) и

Foxp3-A24-10-60 (SEQ ID NO:74).

Полученные клетки CTL показали эффективную специфичную CTL-активность в отношении клеток-мишеней, стимулированных пептидом. Эти результаты согласуются с выводом о том, что Foxp3 является антигеном, распознаваемым клетками CTL, и что последовательности

Foxp3-A24-9-363 (SEQ ID NO:3),

Foxp3-A24-9-366 (SEQ ID NO:7),

Foxp3-A24-9-190 (SEQ ID NO:9),

Foxp3-A24-9-207 (SEQ ID NO:4),

Foxp3-A24-9-332 (SEQ ID NO:5),

Foxp3-A24-9-337 (SEQ ID NO:8),

Foxp3-A24-10-114 (SEQ ID NO:12),

Foxp3-A2-9-390 (SEQ ID NO:15),

Foxp3-A2-9-69 (SEQ ID NO:16),

Foxp3-A2-9-252 (SEQ ID NO:17),

Foxp3-A2-10-359 (SEQ ID NO:22),

Foxp3-A2-10-263 (SEQ ID NO:24),

Foxp3-A2-10-94 (SEQ ID NO:27),

Foxp3-A2-10-233 (SEQ ID NO:28),

Foxp3-A2-10-152 (SEQ ID NO:29),

Foxp3-A2-10-77 (SEQ ID NO:30),

Foxp3-A2-10-246 (SEQ ID NO:37),

Foxp3-A2-9-68 (SEQ ID NO:18),

Foxp3-A2-9-304 (SEQ ID NO:19),

Foxp3-A24-10-87 (SEQ ID NO:67) и

Foxp3-A24-10-60 (SEQ ID NO:74) представляют собой пептиды эпитопов, ограниченных HLA-A24 и HLA-A2. Так как Foxp3 экспрессируется в клетках большинства пациентов, больных раком, и связан с иммуносупрессией, индуцированной иммуносупрессивными факторами опухолями, то Foxp3 представляет собой приемлемую мишень для иммунотерапии с целью стимулирования клинической эффективности антиген-специфичной противораковой иммунотерапии.

Таким образом, настоящее изобретение относится к нонапептидам (пептидам, состоящим из девяти аминокислотных остатков) и декапептидам (пептидам, состоящим из десяти аминокислотных остатков). Пептиды Foxp3 по изобретению связываются с молекулой HLA и индуцируют цитотоксическую активность цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). Более конкретно, настоящее изобретение относится к пептидам, состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO:3-5, 7-9, 12, 15-19, 22, 24, 27-30, 37, 67 или 74.

Как правило, для компьютерного расчета аффинности связывания различных пептидов и антигенов HLA и может использоваться программное обеспечение, доступное в настоящий момент из сети Интернет, например программы, описанные у Parker KC. et al, в J Immunol. 1994 Jan 1; 152(1): 163-75. Аффинность связывания с антигенами HLA может измеряться in vitro, как описано, например, у Parker KC. et al, в J Immunol. 1994 Jan l;152(l):163-75.; Nukaya I. et al, Int J Cancer. 1999 Jan 5;80(l):92-7.; Kuzushima K, et al.( (2001) Blood.;98(6):1872-81.; Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190.; Protein Science, 2000, 9: 1838-1846).

Кроме того, пептиды Foxp3 по настоящему изобретению могут фланкироваться дополнительными аминокислотными остатками при условии сохранения пептидами Foxp3 способности индуцировать клетки CTL. Такие пептиды, обладающие способностью индуцировать клетки CTL, могут содержать менее чем примерно 40 аминокислот, например менее чем примерно 20 аминокислот, например менее чем примерно 15 аминокислот. Аминокислотная последовательность, фланкирующая пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO:3-5, 7-9, 12, 15-19, 22, 24, 27-30, 37, 67 и 74, не ограничена и может содержать аминокислоты любого типа, если они не ингибируют способность пептида индуцировать клетки CTL. Таким образом, настоящее изобретение также относится к пептидам, обладающим способностью индуцировать клетки CTL, причем пептиды включают аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO:3-5, 7-9, 12, 15-19, 22, 24, 27-30, 37, 67 и 74.

По существу, известно, что модификация одной или нескольких аминокислот в белке не влияет на функцию белка или в некоторых случаях даже усиливает желаемую функцию исходного белка. Фактически известно, что модифицированные пептиды (т.е. пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, модифицированную заменой или вставкой одной, двух или нескольких аминокислотных остатков в исходную указанную последовательность) сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6, 1984; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-500, 1982; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13, 1982. Таким образом, в соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения пептид, обладающий способностью индуцировать клетки CTL, по настоящему изобретению может содержать аминокислоты, включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3-5, 7-9, 12, 15-19, 22, 24, 27-30, 37, 67 или 74, где одна или несколько аминокислот вставлены и/или заменены.

Специалисту в данной области будет понятно, что индивидуальные вставки или замены в аминокислотной последовательности, которые изменяют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот, приводят в результате к сохранению свойств аминокислотной боковой цепи; их, таким образом, обозначают как "консервативная замена" или "консервативная модификация", при этом изменение белка приводит в результате к получению белка с подобными функциями. Таблицы консервативных замен, на которых представлены функционально подобные аминокислоты, хорошо известны в данной области. Примеры свойств аминокислотных боковых цепей представляют собой гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) и боковые цепи, содержащие совокупно следующие функциональные группы или характеристики: алифатическую боковую цепь (G, A, V, L, I, P); боковую цепь, содержащую гидроксильную группу (S, T, Y); боковую цепь, содержащую атом серы (C, M); боковую цепь, содержащую карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковую цепь, содержащую основание (R, K, H); и боковую цепь, содержащую ароматическую группу (H, F, Y, W). Кроме того, каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые представляют собой консервативные замены друг другу:

1) аланин (A), глицин (G);

2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);

3) аспарагин (N), глутамин (Q);

4) аргинин (R), лизин (K);

5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V);

6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W);

7) серин (S), треонин (T) и

8) цистеин (C), метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins (1984)).

Такие консервативно модифицированные пептиды также рассматриваются как пептиды по настоящему изобретению. Однако пептид по настоящему изобретению не ограничен ими и может включать неконсервативные модификации, при условии, что пептид сохраняет способность индуцировать клетки CTL. Кроме того, модифицированные пептиды не исключают CTL-индуцируемые пептиды полиморфных вариантов, межвидовых гомологов и аллелей Foxp3.

Специалист может модифицировать (вставить или заменить) только небольшое количество (например, 1, 2 или несколько) или небольшой процент аминокислотных остатков, сохраняя требуемую способность индуцировать клетки CTL (т.е. активировать CTL). В данном случае термин "несколько" означает 5 или менее или, например, 3 или менее. Процент модифицированных аминокислотных остатков может составлять 20% или менее, например 15% или 10% или менее, например 1-5% всех аминокислот последовательностей SEQ ID NO:3-5, 7-9, 12, 15-19, 22, 24, 27-30, 37, 67 и 74. В настоящем изобретении рассматриваются пептиды Foxp3, обладающие по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% аминокислотной идентичностью последовательности со всеми идентифицированными последовательностями. Идентичность последовательности может быть измерена с использованием любого алгоритма, известного в данной области, например BLAST, доступного через Национальный Центр Биотехнологической Информации (по адресу ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).

Анализ гомологии (т.е. идентичности последовательности) представленных пептидов

Foxp3-A24-9-363 (SEQ ID NO:3),

Foxp3-A24-9-366 (SEQ ID NO:7),

Foxp3-A24-9-190 (SEQ ID NO:9),

Foxp3-A24-9-207 (SEQ ID NO:4),

Foxp3-A24-9-332 (SEQ ID NO:5),

Foxp3-A24-9-337 (SEQ ID NO:8),

Foxp3-A24-10-114 (SEQ ID NO:12),

Foxp3-A2-9-390 (SEQ ID NO:15),

Foxp3-A2-9-69 (SEQ ID NO:16),

Foxp3-A2-9-252 (SEQ ID NO:17),

Foxp3-A2-10-359 (SEQ ID NO:22),

Foxp3-A2-10-263 (SEQ ID NO:24),

Foxp3-A2-10-94 (SEQ ID NO:27),

Foxp3-A2-10-233 (SEQ ID NO:28),

Foxp3-A2-10-152 (SEQ ID NO:29),

Foxp3-A2-10-77 (SEQ ID NO:30),

Foxp3-A2-10-246 (SEQ ID NO:37),

Foxp3-A2-9-68 (SEQ ID NO:18),

Foxp3-A2-9-304 (SEQ ID NO:19),

Foxp3-A24-10-87 (SEQ ID NO:67) и

Foxp3-A24-10-60 (SEQ ID NO:74) показал, что они не имеют существенной гомологии с пептидами, полученными из любых других известных генных продуктов. Это снижает возможность неизвестных или нежелательных иммунных ответов при использовании для иммунотерапии.

Как используется в иммунотерапии, пептиды по настоящему изобретению будут представлены на поверхности клетки или экзосомы в виде комплекса с антигеном HLA. Таким образом, выбирают пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с антигеном HLA кроме их способности индуцировать клетки CTL. Более того, пептиды могут быть модифицированы заменой, вставкой и подобными модификациями аминокислотных остатков с достижением более высокой аффинности связывания. Кроме пептидов, которые обнаруживаются естественным образом, так как известна закономерность (т.е. соответствие) последовательностей пептидов, обнаруживающихся при связывании с антигенами HLA (J Immunol 152: 3913, 1994; Immunogenetics 41: 178, 1995; J Immunol 155: 4307, 1994), могут быть осуществлены модификации иммуногенных пептидов по изобретению на основе такой закономерности. Например, пептиды, проявляющие высокую аффинность связывания HLA-A24, могут содержать замену второй аминокислоты с N-конца на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан, а также пептиды, аминокислота которых с С-конца заменена на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин. С другой стороны, пептиды, у которых вторая аминокислота с N-конца заменена на лейцин или метионин и у которых С-концевая аминокислота заменена на валин или лейцин, могут использоваться в качестве пептидов, обладающих высокой аффинностью связывания HLA-A02. Замену осуществляют не только концевых аминокислот, но также в положении возможного сайта TCR-распознавания пептидов. В статье Zaremba et al. показано, что аминокислотные замены в пептиде CAP1 могут быть эквивалентны или лучше, чем у исходного пептида (Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997). Например, пептид, содержащий замены, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:95, 97 или 98. Кроме того, на N- и/или C-конце пептидов также могут быть добавлены одна или две аминокислоты. Такие модифицированные пептиды с высокой аффинностью связывания антигена HLA также включены в настоящее изобретение.

Однако, если последовательность пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, с отличной функцией, то могут возникать побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения или аллергические реакции в отношении определенных веществ. Таким образом, поиск гомологии может осуществляться с использованием доступных баз данных, чтобы избежать, уменьшить или минимизировать ситуации, при которых последовательность пептида имеет гомологичную аминокислотную последовательность с другим белком. Если при поиске гомологии становится ясно, что не существует пептида, имеющего 1 или 2 отличия по аминокислотам по сравнению с заданным пептидом, то заданный пептид может быть модифицирован для увеличения аффинности связывания с антигенами HLA и/или увеличения способности индуцировать клетки CTL без какой-либо опасности побочных эффектов.

Пептиды, обладающие аффинностью связывания с антигенами HLA, как описано выше, являются высокоэффективными. Возможные пептиды, которые выбирают по наличию высокой аффинности связывания, также могу быть проанализированы на фактическое присутствие способности индуцировать клетки CTL. В данном случае фраза "способность индуцировать клетки CTL" указывает на способность пептида индуцировать клетки CTL, если он представлен на антиген-презентирующих клетках. Кроме того, "способность индуцировать клетки CTL" включает способность пептида индуцировать активацию клеток CTL, пролиферацию клеток CTL и включает способность пептида повышать продукцию IFN-γ.

Подтверждение способности индуцировать клетки CTL может быть осуществлено путем индукции антиген-презентирующих клеток, несущих антигены MHC человека (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток), или, более конкретно, дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека, и после стимулирования пептидами путем смешивания с CD8-положительными клетками и последующего измерения IFN-γ, продуцированного и высвобожденного клетками CTL против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы может использоваться трансгенное животное, которое получено для экспрессии антигена HLA человека (например, описанные BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, в Hum Immunol 61(8): 764-79, 2000, август, связанные статьи, книги, Link out Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DRl transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Например, клетки-мишени могут быть радиоактивно меченными ⁵¹Cr и тому подобное, и цитотоксическая активность может быть рассчитана исходя из радиоактивности, высвобожденной из клеток-мишеней. Альтернативно, активность может быть определена путем измерения IFN-γ, полученного и выделенного клетками CTL в присутствии антиген-презентирующих клеток, которые несут иммобилизованные пептиды, и с помощью визуализации в среде зоны ингибирования с использованием моноклональных антител против IFN-γ.

В результате определения у пептидов способности индуцировать клетки CTL, как описано выше, было установлено, что пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания в отношении антигена HLA, необязательно обладают высокой способностью индуцировать клетки. Кроме того, нонапептиды или декапептиды, выбранные из пептидов, содержащих аминокислотные последовательности, обозначенные последовательностями SEQ ID NO:3-5, 7-9, 12, 15-19, 22, 24, 27-30, 37, 67 или 74, показали особенно высокую способность индуцировать клетки CTL, а также высокую аффинность связывания с антигеном HLA.

Кроме вышеуказанной модификации пептидов по настоящему изобретению, пептиды по настоящему изобретению могут быть дополнительно связаны с другими веществами, при условии сохранения способности индуцировать клетки CTL. Используемые вещества включают: пептиды, липиды, сахара и цепи сахаров, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование; при условии, что модификации не нарушают биологической активности пептидов, как описано выше. Такие типы модификаций могут осуществляться для придания дополнительных функций (например, направляющей функции и функции доставки) или для стабилизации полипептида.

Например, как известно в данной области, для увеличения in vivo стабильности полипептида вводят подходящие разнообразные D-аминокислоты, аминокислотные миметики или неприродные аминокислоты; данная концепция также может быть адоптирована для полипептидов по настоящему изобретению. Стабильность полипептида может оцениваться рядом способов. Например, для определения стабильности использовали пептидазы и разнообразные биологические среды, такие как плазма и сыворотка человека (см., например, публикацию Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 11: 291-302, 1986).

III. Получение пептидов

Пептиды по изобретению могут быть получены с использованием хорошо известных методов. Например, пептиды могут быть получены синтетически, технологиями рекомбинантной ДНК или химическим синтезом. Пептиды по изобретению могут быть синтезированы независимо или в виде более длинных полипептидов, включая два или несколько пептида (например, два или несколько пептидов Foxp3 или пептид Foxp3 и