Антитела человека с высокой аффинностью к фактору роста нервов человека

Антитела человека с высокой аффинностью к фактору роста нервов человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам человека и антиген-связывающим фрагментам антител человека, которые специфическим образом связывают фактор роста нервов (NGF) человека, и к терапевтическим способам применения указанных антител.

Материалы, использованные при подготовке заявки

Фактор роста нервов (NGF) был первым из обнаруженных нейротрофинов, и его роль в развитии и выживании как периферических нейронов, так и нейронов центральной нервной системы, была хорошо описана. Было показано, что NGF является важнейшим фактором выживания и сохранения функций при развитии периферических симпатических и эмбриональных сенсорных нейронов и базальных холинергических нейронов переднего мозга (Smeyne et al. (1994) Nature 368:246-249; Crowley et al. (1994) Cell 76:1001-1011). NGF активизирует экспрессию нейропептидов в сенсорных нейронах (Lindsay et al. (1989) Nature 337:362-364), и его активность опосредована двумя различными интегрированными в мембрану рецепторами, рецептором TrkA и общим рецептором нейротрофинов p75.

Уровень NGF повышен в синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом и другими формами артрита. Было показано, что антагонисты NGF предупреждают гиперальгезию и аллодинию на моделях нейропатической и хронической воспалительной боли у животных.

Антитела против-NGF описаны, например, в WO 01/78698, WO 02/096458, WO 2004/032870, в публикациях патентов США 2005/0074821, 2004/0237124 и 2004/0219144.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к полноразмерным антителам человека и их антиген-связывающим фрагментам, которые специфическим образом связывают фактор роста нервов (NGF) человека с K_D порядка 5 пМ или менее и не вступают в перекрестную реакцию с нейротрофином-3 (NT-3). В предпочтительном варианте осуществления антитело против-NGF или его фрагмент связывает NGF человека с K_D порядка 1,0 пМ или менее. Для данных антител характерно связывание с NGF с высокой аффинностью, высокой специфичностью и способность нейтрализовать активность NGF. В предпочтительных вариантах осуществления антитело или его фрагмент связывает NGF человека приблизительно в 2-10 раз выше, чем NGF крысы и/или NGF мыши.

Антитела могут быть полноразмерными (например, антитела IgG1 или IgG4) или включать только антиген-связывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv) и могут быть модифицированы с целью воздействовать на функциональность, например удалять остаточные эффекторные функции (Glu, удаляющий остаточные эффекторные функции (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу или антиген-связывающему фрагменту антитела, содержащему вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы SEQ ID No: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 104, 108, 112, 116, 132, 136, 140, 156, 160, 176, 180, 184, 200, 204, 208, 224, 228, 232, 236, 240, 256, 260, 264, 280, 284, 288, 304, 308, 312, 328, 332, 336, 352, 356, 360, 376, 380, 384, 400, 404, 420, 424, 440, 456, 460, 464, 480, 484, 488, 504, 508, 512, 528 и 532, или ее, по существу, аналогичную последовательность, которая идентична указанной последовательности на не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; более предпочтительно, антитело или его фрагмент содержит HCVR, представленную как SEQ ID No: 108, 100 или 84; и еще более предпочтительно, HCVR является аминокислотной последовательностью, представленной как SEQ ID No: 108.

В одном из вариантов осуществления антитело или его фрагмент, кроме того, содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из группы SEQ ID No: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 102, 106, 110, 114, 124, 134, 138, 148, 158, 168, 178, 182, 192, 202, 206, 216, 226, 230, 234, 238, 248, 258, 262, 272, 282, 286, 296, 306, 310, 320, 330, 334, 344, 354, 358, 368, 378, 382, 392, 402, 412, 422, 432, 448, 458, 462, 472, 482, 486, 496, 506, 510, 520, 530 и 534, или ее существенно аналогичную последовательность, которая идентична указанной последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В предпочтительном осуществлении LCVR является SEQ ID No: 110, 102 или 92; еще более предпочтительно, LCVR является аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID No: 110.

В конкретных осуществлениях антитело или его фрагмент содержит пару последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), выбранную из группы SEQ ID No: 4/12, 20/28, 36/44, 52/60, 68/76, 84/92, 100/102, 104/106, 108/110, 112/114, 116/124, 132/134, 136/138, 140/148, 156/158, 160/168, 176/178, 180/182, 184/192, 200/202, 204/206, 208/216, 224/226, 228/230, 232/234, 236/238, 240/248, 256/258, 260/262, 264/272, 280/282, 284/286, 288/296, 304/306, 308/310, 312/320, 328/330, 332/334, 336/344, 352/354, 356/358, 360/368, 376/378, 380/382, 384/392, 400/402, 404/412, 420/422, 424/432, 440/448, 456/458, 460/462, 464/472, 480/482, 484/486, 488/496, 504/506, 508/510, 512/520, 528/530 и 532/534. В предпочтительном осуществлении парой HCVR/LCVR является SEQ ID No: 108/110, 100/102 или 84/92; более предпочтительно, SEQ ID No: 108/110.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к антителу или антиген-связывающему фрагменту антитела, содержащему домен CDR3 (HCDR3) тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID No: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 122, 146, 166, 190, 214, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 410, 430, 446, 470, 494 и 518, или его существенно аналогичную последовательность, которая идентична указанной последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и домен CDR3 (LCDR3) легкой цепи, выбранный из 18, 34, 50, 66, 82, 98, 130, 154, 174, 198, 222, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 418, 438, 454, 478, 502 и 526, или его существенно аналогичную последовательность, которая идентична указанной последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В предпочтительном осуществлении парой HCDR3/LCDR3 является SEQ ID No: 90 и 98, 214 и 222; 410 и 418; 430 и 438; или 446 и 454; более предпочтительно, SEQ ID No: 90 и 98.

В дальнейшем варианте осуществления настоящего изобретения приводится антитело или его фрагмент, дополнительно содержащий домен CDR1 (HCDR1) тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID No: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 118, 142, 162, 186, 210, 242, 266, 290, 314, 338, 362, 386, 406, 426, 442, 466, 490 и 514, или его существенно аналогичную последовательность, которая идентична указанной последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; домен CDR2 (HCDR2) тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID No: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 120, 144, 164, 188, 212, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 408, 428, 444, 468, 492 и 516, или его существенно аналогичную последовательность, которая идентична указанной последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; домен CDR1 (LCDR1) легкой цепи, выбранный из SEQ ID No: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 126, 150, 170, 194, 218, 250, 274, 298, 322, 346, 370, 394, 414, 434, 450, 474, 498 и 522, или его существенно аналогичную последовательность, которая идентична указанной последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и домен CDR2 (LCDR2) легкой цепи, выбранный из SEQ ID No: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 128, 152, 172, 196, 220, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 416, 436, 452, 476, 500 и 524, или его существенно аналогичную последовательность, которая идентична указанной последовательности не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В предпочтительном осуществлении последовательностями CDR тяжелой и легкой цепей являются SEQ ID No: 86, 88, 90, 94, 96 и 98; 210, 212, 214, 218, 220 и 222; 406, 408, 410, 414, 416 и 418; 442, 444, 446, 450, 452 и 454; и 426, 428, 430, 434, 436 и 438; еще более предпочтительно, последовательностями CDR являются SEQ ID No: 86, 88, 90, 94, 96 и 98.

В третьем аспекте настоящего изобретения приводятся молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против-NGF или их фрагменты. Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантные векторы экспрессии, несущие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, и клетки-хозяева, в которые включаются такие векторы, а также способы приготовления антител путем культивирования клеток-хозяев в условиях, допускающих производство антител и получение произведенных таким образом антител.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения приводится антитело или его фрагмент, содержащий HCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID No: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 103, 107, 111, 115, 131, 135, 139, 155, 159, 175, 179, 183, 199, 203, 207, 223, 227, 231, 235, 239, 255, 259, 263, 279, 283, 287, 303, 307, 311, 327, 331, 335, 351, 355, 359, 375, 379, 383, 399, 403, 419, 423, 439, 455, 459, 463, 479, 483, 487, 503, 507, 511, 527 и 531, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; более предпочтительно, HCVR кодируется последовательностью SEQ ID No: 107 или 99.

В одном варианте осуществления антитело или его фрагмент дополнительно содержит LCVR, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID No: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 101, 105, 109, 113, 123, 133, 137, 147, 157, 167, 177, 181, 191, 201, 205, 215, 225, 229, 233, 237, 247, 257, 261, 271, 281, 285, 295, 305, 309, 319, 329, 333, 343, 353, 357, 367, 377, 381, 391, 401, 411, 421, 431, 447, 457, 461, 471, 481, 485, 495, 505, 509, 519, 529 и 533, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; предпочтительно, LCVR кодируется последовательностью SEQ ID No: 109 или 101.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения приводится антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, содержащий домен HCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID No: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 121, 145, 165, 189, 213, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 409, 429, 445, 469, 493 и 517, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и домен LCDR3, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID No: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 129, 153, 173, 197, 221, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 417, 437, 453, 477, 501 и 525, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В предпочтительном осуществлении последовательности HCDR3 и LCDR3 кодируются SEQ ID No: 89 или 97 соответственно.

В дополнительном варианте осуществления антитело или его фрагмент дополнительно содержит домен HCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID No: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 117, 141, 161, 185, 209, 241, 265, 289, 313, 337, 361, 385, 405, 425, 441, 465, 489 и 513, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; домен HCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID No: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 119, 143, 163, 187, 211, 243, 267, 291, 315, 339, 363, 387, 407, 427, 443, 467, 491 и 515, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; домен LCDR1, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID No: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 125, 149, 169, 193, 217, 249, 273, 297, 321, 345, 369, 393, 413, 433, 449, 473, 497 и 521, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%; и домен LCDR2, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из SEQ ID No: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 127, 151, 171, 195, 219, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 415, 435, 451, 475, 499 и 523, или ее существенно аналогичную последовательность с гомологией не менее 90%, не менее 95%, не менее 98% или не менее 99%. В предпочтительном осуществлении антитело или его фрагмент содержит последовательности CDR тяжелой цепи, кодируемые SEQ ID No: 85, 87 и 89; и последовательности CDR легкой цепи, кодируемые SEQ ID No: 93, 95 и 97.

В четвертом аспекте настоящего изобретения приводится изолированное антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, который специфическим образом связывает NGF человека, содержащий HCDR3 и LCDR3, где HCDR3 содержит аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ - X⁹ - X¹⁰ - X¹¹ - X¹² - X¹³ - X¹⁴ - X¹⁵ - X¹⁶ - X¹⁷ - X¹⁸ (SEQ ID No: 537), где X¹ - Ala или Ser, X² - Thr или Lys, X³ - Glu или Ile, X⁴ - Phe или Gly, X⁵ - Val или Gly, X⁶ - Val или Trp, X⁷ - Val или Phe, X⁸ - Thr или Gly, X⁹ - Asn или Lys, X¹⁰ - Phe или Leu, X¹¹ - Asp или Phe, X¹² - Asn или Ser, X¹³ - Ser или отсутствует, X¹⁴ - Tyr или отсутствует, X¹⁵ - Gly или отсутствует, X¹⁶ - Met или отсутствует, X¹⁷ - Asp или отсутствует и X¹⁸ - Val или отсутствует; и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ - X⁹ (SEQ ID No: 540), где X¹ - Gln, X² - Gln, X³ - Tyr, X⁴ - Asn, X⁵ - Arg или Asn, X⁶ - Tyr или Trp, X⁷ - Pro, X⁸ - Tyr или Trp и X⁹ - Thr.

В более конкретном варианте осуществления антитело или его фрагмент дополнительно содержит последовательность HCDR1 формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ (SEQ ID No: 535), где X¹ - Gly, X² - Phe, X³ - Thr или Asn, X⁴ - Phe или Leu, X⁵ - Thr или Asp, X⁶ - Asp или Glu, X⁷ - Tyr или Leu и X⁸ - Ser или Ala; последовательность HCDR2 формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ (SEQ ID No: 536), где X¹ - Ile или Phe, X² - Asp или Ser, X³ - Pro или Trp, X⁴ - Glu или Asn, X⁵ - Asp или Ser, X⁶ - Gly, X⁷ - Thr, Glu или Ser, X⁸ - Thr или Ile; HCDR3 содержит аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ - X⁹ - X¹⁰ - X¹¹ - X¹² - X¹³ - X¹⁴ - X¹⁵ - X¹⁶ - X¹⁷ - X¹⁸ (SEQ ID No: 537), где X¹ - Ala или Ser, X² - Thr или Lys, X³ - Glu или Ile, X⁴ - Phe или Gly, X⁵ - Val или Gly, X⁶ - Val или Trp, X⁷ - Val или Phe, X⁸ - Thr или Gly, X⁹ - Asn или Lys, X¹⁰ - Phe или Leu, X¹¹ - Asp или Phe, X¹² - Asn или Ser, X¹³ - Ser или отсутствует, X¹⁴ - Tyr или отсутствует, X¹⁵ - Gly или отсутствует, X¹⁶ - Met или отсутствует, X¹⁷ - Asp или отсутствует и X¹⁸ - Val или отсутствует; последовательность LCDR1 формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ (SEQ ID No: 538), где X¹ - Gln или Arg, X² - Ala, Ser или Thr, X³ - Val или Ile, X⁴ - Arg или Thr, X⁵ - Asn, Phe или Tyr и X⁶ - Asp или Asn; последовательность LCDR2 формулы X¹ - X² - X³ (SEQ ID No: 539) где X¹ - Gly или Ala, X² - Ala и X³ - Ser или Phe; и LCDR3 содержит аминокислотную последовательность формулы X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ - X⁹ (SEQ ID No: 540), где X¹ - Gln, X² - Gln, X³ - Tyr, X⁴ - Asn, X⁵ - Arg или Asn, X⁶ - Tyr или Trp, X⁷ - Pro, X⁸ - Tyr или Trp и X⁹ - Thr.

В пятом аспекте настоящего изобретения приводится полностью человеческое антитело или фрагмент антитела, который блокирует активность NGF с IC₅₀ менее 10 нМ, согласно результатам измерения in vitro при помощи PC12-клеточного анализа (описано ниже). В предпочтительном осуществлении антитело изобретения демонстрирует IC₅₀ порядка 500 пМ или менее; еще более предпочтительно, IC₅₀ порядка 100 пМ или менее, порядка 50 пМ или менее, или порядка 25 пМ или менее.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение описывает изолированное антитело человека или его антиген-связывающую область, которое связывает NGF с константой аффинности (K_D) менее чем приблизительно 500 пМ, предпочтительнее, менее чем приблизительно 300 пМ, еще предпочтительнее, менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 50 пМ, менее чем приблизительно 20 пМ, менее чем приблизительно 10 пМ, менее чем приблизительно 5 пМ или менее чем приблизительно 1 пМ, по данным поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE™). В предпочтительном осуществлении антитело против-NGF человека или фрагмент антитела настоящего изобретения связывает NGF человека с K_D порядка 0,5 пМ или менее. В предпочтительных осуществлениях антитело или его фрагмент связывает NGF человека при более высокой аффинности - приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз выше чем NGF крысы, и приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз или 10 раз выше чем NGF мыши.

В предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент обладает высокой специфичностью в отношении NGF человека, например, не вступает в перекрестную реакцию с близко родственным нейротрофином-3 (NT-3). Так, в предпочтительном осуществлении антитело или его фрагмент с высокой аффинностью и высокой селективностью демонстрирует K_D для NGF человека на уровне 1,0 пМ или менее, ингибирует связывание NGF с рецепторами TrkA и p75 и не вступает в перекрестную реакцию с NT-3 человека, по данным поверхностного плазмонного резонанса. NT-3 играет решающую роль в таких физиологических процессах как, например, мышечная координация при помощи мотонейронов, и, таким образом, антитела или фрагменты антител, не вступающие в перекрестную реакцию с NT-3, обеспечивают неожиданное клиническое и терапевтическое преимущество по сравнению с уже известными антителами. Было показано, что NT-3 предотвращает развитие термальной гипералгезии на модели невропатической боли по типу хронической компрессии (см., например, Wilson-Gerwing et al. (2005) J Neuroscience 25:758-767). В последнее время было продемонстрировано, что NT-3 существенно снижает экспрессию натриевых каналов, предположительно провоцирующих невропатическую боль (Wilson-Gerwing & Verge (2006) Neuroscience 141:2075-2085). Эти данные указывают на благотворную роль NT-3 в подавлении нейропатической боли.

Настоящее изобретение относится к антителам против-NGF с модифицированной структурой гликозилирования. В некоторых приложениях может оказаться полезным удалить нежелательные сайты гликозилирования или использовать антитело без фукозного фрагмента в олигосахаридной цепи, например для усиления функции антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других приложениях может осуществляться модификация галактозилирования с тем, чтобы изменить комплементзависимую цитотоксичность (CDC).

В шестом аспекте настоящего изобретения относится к составу, включающему рекомбинантное антитело человека или его фрагмент, которое специфически связывает NGF, и приемлемый носитель. В аналогичном аспекте настоящего изобретения приводится состав, представляющий собой сочетание ингибитора NGF и второго терапевтического средства. В одном варианте осуществления ингибитор NGF является антителом или его фрагментом. В предпочтительном осуществлении вторым терапевтическим средством является любое подходящее терапевтическое средство, которое оптимальным образом сочетается с ингибитором NGF.

В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования NGF человека с помощью антитела против-NGF или антиген-связывающей области антитела настоящего изобретения. Подлежащим лечению нарушением является любое заболевание или патологическое состояние, которое улучшается, облегчается, подавляется или предупреждается за счет устранения, ингибирования или снижения активности NGF. Более конкретно, в изобретении предлагается способ лечения патологических состояний или заболеваний, опосредованных NGF, например воспалительной боли, послеоперационной боли шва, комплексного регионарного болевого синдрома, боли при первичном или метастатическом раке кости, нейропатической боли, боли при переломах, боли при остеопорозных переломах, боли, вызванной ожогами, остеопорозом, суставной боли при подагре, боли, связанной с обострениями при серповидноклеточной анемии, других ноцицептивных болей, а также гепатоклеточной карциномы, рака молочной железы и цирроза печени путем введения ингибитора NGF, например антител настоящего изобретения или их фрагментов как при монотерапии, так и в качестве второго терапевтического средства. В предпочтительных вариантах нейропатической боли предпочтительна терапия реперкуссионной невралгии тройничного нерва, постгерпетической невралгии, фантомной боли в ампутированных конечностях, фибромиалгии, симпатической рефлекторной дистрофии и нейрогенных болях. Вторым терапевтическим средством может быть ингибитор интерлейкина-1 (IL-1), например слитой белок, подобный описанному в патенте США US6927044; или же антиэпилептическое средство, например габапентаин, прегабалин, топирамат или же трициклический антидепрессант, например амитриптиллин; целекоксиб; антагонист цитокинов, например белок-антагонист или антитело против IL-1, IL-6, IL-6R, IL-18 или IL-18R. В одном варианте осуществления вторым терапевтическим средством является другой нейротрофин, например NT-3.

В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к применению описанного выше антитела или антиген-связывающего фрагмента для смягчения или ингибирования заболевания или патологического состояния в организме человека, опосредованного NGF. Опосредованное NGF патологическое состояние или болезнь подавляются без заметного ухудшения моторной координации, и к таким состояниям относятся воспалительная боль, послеоперационная боль шва, нейропатическая боль, боль при переломах, суставная боль при подагре, постгерпетическая невралгия, боль, вызванная ожогами, боль при раке, боль при остеоартрите или ревматоидном артрите, ишиасе, боль, связанная с обострениями при серповидноклеточной анемии или постгерпетическая невралгия.

В связанном аспекте настоящее изобретение также предусматривает использование описанного выше антитела или антиген-связывающего фрагмента антитела при производстве лекарственного препарата, применяемого для смягчения или ингибирования заболевания или патологического состояния в организме человека, опосредованного NGF.

Другие цели и преимущества станут очевидными при ознакомлении с приведенным ниже подробным описанием.

ПОЛНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Прежде чем приступить к описанию представляемого способа, необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами и изложенными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия можно менять. Следует также понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для описания конкретных осуществлений и не носит ограничительного характера, поскольку охват настоящего изобретения ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое общеизвестно рядовым специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя на практике или при проверке настоящего изобретения могут использоваться любые методы и материалы, аналогичные или идентичные описанным в настоящем документе, ниже приводится описание предпочтительных методов и материалов.

Определения

Термин «фактор роста нервов человека» или «NGF», используемый в настоящем документе, означает NGF человека с последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID No: 1, и аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2, или его биологически активный фрагмент.

Используемый в настоящем документе термин «антитело» предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, составленных из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена: CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми остовными областями (FR). Каждая область VH и VL образована тремя CDR и четырьмя FR, расположенными от амино-терминального конца к карбокси-терминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Используемый в настоящем документе термин «антиген-связывающая область» антитела (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном (например, NGF). Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может осуществляться фрагментами всей последовательности антитела. К примерам связывающих фрагментов, включенных в термин «антиген-связывающая область» антитела, относятся (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH отдельной области антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) отдельная определяющая комплементарность область (CDR). Более того, несмотря на то что два домена в фрагменте Fv, VL и VH кодируются различными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные технологии, посредством синтетического линкера, который позволяет построить из них единую белковую цепочку, в которой области VL и VH связываются с образованием моновалентных молекул (известных как одиночная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в сферу охвата термина «антиген-связывающая область» антитела. Сюда же входят и другие формы одноцепочечных антител, например диатела. Диатела представляют собой бивалентные биспецифичные антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но длина соединяющего их линкера слишком мала для связывания двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены одной цепи связываться с комплементарными доменами другой цепи, создавая тем самым два сайта связывания антигена (см., например, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Далее, антитело или его антиген-связывающая область могут быть частью более крупных иммуноассоциированных молекул, образованных ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела или части антитела и одной или более белковой молекулы или пептида. Примеры таких иммуноадгезивных молекул включают использование области ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркера-пептида и C-терминального полигистидинового маркера для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')₂, могут быть получены из цельных антител с помощью стандартных методик, таких как папаиновое и пепсиновое расщепление цельных антител соответственно. Кроме того, антитела, части антител и иммуноассоциированные молекулы могут быть получены с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК, как описано в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «антитело человека» предназначен для обозначения антител с вариабельной и константной областями, полученных из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевых линий человека. Описываемые в настоящем изобретении антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевых линий человека (например, мутации, вызванные случайным или сайт-специфичным мутагенезом in vitro или соматическими мутациями in vivo), например в областях CDR, особенно в области CDR3. Однако используемый в настоящем документе термин «антитело человека» не подразумевает включения антител, в которых в каркасные области последовательности человека вставлены CDR последовательности, полученные из зародышевых линий другого вида млекопитающих, например мыши.

Используемый в настоящем документе термин «рекомбинантное антитело человека» подразумевает включение всех типов антител человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с использованием рекомбинантных технологий, в том числе антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку-хозяина (как описано ниже), антител, выделеннных из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека (как описано ниже), антител, выделенных из животного (например, мыши), трансгенного по отношению к генам иммуноглобулина человека (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), а также антител, полученных, экспрессированных, созданных или выделенных с использованием любых других методов, использующих сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельную и константную области, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевых линий человека. В ряде осуществлений, однако, такие рекомбинантные антитела человека подвергаются мутагенезу in vitro (либо при использовании животных, трансгенных по иммуноглобулину человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител оказываются последовательностями, которые, хотя и получены из последовательностей VH и VL областей зародышевых линий человека и связаны с этими последовательностями, могут отсутствовать в естественно существующем in vivo наборе последовательностей зародышевых линий человека.

Используемый в настоящем документе термин «изолированное антитело» предназначен для обозначения антитела, существенно свободного от других антител, обладающих иной антигенной специфичностью (например, изолированное антитело, которое специфично связывает NGF, существенно свободно от антител, которые специфично связывают антигены, отличные от NGF). Изолированное антитело, которое специфично связывает NGF, тем не менее, может иметь перекрестную реактивность к другим антигенам, например молекулам NGF из других видов. Более того, изолированное антитело может быть существенно свободно от иных клеточных материалов и/или химических реагентов.

Используемый в настоящем документе термин «нейтрализующее антитело» (или «антитело, нейтрализующее активность NGF») предназначен для обозначения антитела, связывание которого с NGF приводит к ингибированию биологической активности NGF. Такое ингибирование биологической активности NGF может оцениваться посредством измерения одного или нескольких показателей биологической активности NGF, таких как клеточная активация, индуцированная NGF, и связывание NGF с рецептором NGF. Данные показатели биологической активности NGF могут оцениваться при помощи одного или нескольких методов анализа in vitro или in vivo, известных специалистам (см. примеры ниже).

«CDR» или определяющая комплементарность область представляет собой область гипервариабельности, перемежаемую областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми «остовными областями». Группу областей CDR можно определить как согласованную последовательность аминокислот.

Используемый в настоящем документе термин «поверхностный плазмонный резонанс» относится к оптическому явлению, которое позволяет проводить анализ биоспецифических взаимодействий в реальном времени за счет детектирования изменений концентраций белка в биосенсорной матрице, например с помощью системы BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).

Используемый в настоящем документе термин «K_D» предназначен для обозначения равновесной константы диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.

Используемый в настоящем документе термин «изолированная молекула нуклеиновой кислоты» применительно к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела или части антител (например, VH, VL, CDR3), которые связывают NGF, предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или части антител, свободны от других нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела или части антител, которые связывают антигены, отличные от NGF, и такие другие последовательности могут естественным образом располагаться по обоим концам этой нуклеиновой кислоты в геномной ДНК человека. Так, например, изолированная нуклеиновая кислота настоящего изобретения, кодирующая область VH антитела против-NGF, не содержит никаких других последовательностей, кодирующих другие области VH, которые связывают антигены, отличные от NGF человека.

Используемый в настоящем документе термин «эпитоп» включает любой детерминант, предпочтительно полипептидный детерминант, способный к специфичному связыванию с иммуноглобулином или рецептором Т-клетки. В ряде осуществлений эпитопные детерминанты включают сгруппированные на поверхности химически активные молекулы, такие как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в ряде осуществлений могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические зарядовые характеристики. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается с антителом. В некоторых осуществлениях считается, что антитело специфично связывается с антигеном, если оно предпочтительно опознает свой антиген-мишень в сложной смеси белков и (или) макромолекул. В предпочтительных осуществлениях считается, что антитело специфично связывается с антигеном, если равновесная константа диссоциации не превышает 10^-8 М, более предпочтительно, если равновесная константа диссоциации не превышает 10^-9 М, и наиболее предпочтительно, если равновесная константа диссоциации не превышает 10^-10 М.

Термин «существенная идентичность» или «по существу идентичны» в отношении нуклеиновой кислоты или ее фрагмента означает, что при оптимальном сопоставлении с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) с соответствующими добавлениями или делециями наблюдается идентичность нуклеотидной последовательности не менее примерно 90% и, более предпочтительно, не менее 95%, 96%, 97%, 98% или 99% оснований нуклеотидов, что измеряется с помощью любого известного алгоритма идентичности последовательностей, например FASTA, BLAST или GAP, которые обсуждаются ниже.

Применяемый в отношении полипептидов термин «существенное сходство» или «по существу подобные» означает, что две пептидные последовательности при их оптимальном сопоставлении, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с учетом веса гэпов по умолчанию демонстрируют идентичность последовательностей не менее 90%, и еще более предпочтительно, не менее 95%, 98% или 99%. Предпочтительно положение неидентичных остатков отличается консервативным замещением аминокислот. «Консервативное замещение аминокислот» - это такое замещение, при котором один аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (группу R) с аналогичными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). В общем случае консервативное замещение аминокислот не будет приводить к существенным изменениям функциональных свойств белка. В случае если две или более аминокислотные последовательности отличаются друг от друга консервативными замещениями, процент или степень аналогичности может корректироваться в сторону увеличения, с тем чтобы учесть консервативный характер замещения. Способы такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. К примерам групп аминокислот, имеющих боковые цепи с аналогичными химическими свойствами, относятся 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические гидроксилированные боковые цепи: серин и треонин; 3) боковые цепи с амидной группой: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) боковые цепи со свойствами основания: лизин, аргинин и гистидин; 6) боковые цепи со свойствами кислоты: аспартат и глутамат; и 7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительными группами для консервативного замещения аминокислот являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В альтернативном варианте консервативное замещение представляет собой любое изменение, приводящее к положительному значению в логарифмической матрице вероятностей PAM250, описанной в работе Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. «Умеренно консервативным» замещением называется любое изменение, приводящее к неотрицательному значению в логарифмической матрице правдоподопия PAM250.

Подобие последовательностей полипептидов обычно определяют с помощью программного обеспечения для анализа последовательности. Программа для анализа белков сопоставляет подобные последовательности с использованием показателей аналогичности, задаваемых для различных замещений, делеций и других модификаций, в том числе для консервативного замещения аминокислот. Например, программное обеспечение GCG содержит такие программы, как GAP и BESTFIT, которые могут использоваться с параметрами по умолчанию для определения гомологии или идентичности последовательности между близкородственными полипептидами, например гомологичными полипептидами различных видов организмов или между исходным белком и его мутантом. См., например,