Способ снижения содержания эндотоксина в образце, содержащем полисиаловую кислоту и эндотоксин

Способ снижения содержания эндотоксина в образце, содержащем полисиаловую кислоту и эндотоксин

Реферат

Настоящее изобретение касается снижения содержания эндотоксина в полисиаловой кислоте (PSA) и ее конъюгатах путем инкубации в присутствии сильного основания с последующим извлечением PSA, обычно с помощью адсорбции и элюирования с анионообменной колонки. Очищенная PSA с пониженным содержанием эндотоксина может быть использована для дериватизации систем доставки лекарственных веществ, биологических молекул, включающих лекарственные вещества белковой и пептидной природы, что улучшает фармакокинетику и фармакодинамику лекарственного вещества.

Полисиаловые кислоты - это природные неразветвленные полимеры сиаловой кислоты, продуцируемые некоторыми штаммами бактерий, а также в некоторых клетках млекопитающих [Roth et. al., 1993]. Они могут быть синтезированы с различной степенью полимеризации от n=около 80 и более остатков сиаловой кислоты и вплоть до n=2, путем ограниченного кислотного гидролиза или расщепления с помощью нейраминидаз, или же путем фракционирования природных форм этого полимера бактериального происхождения. Состав различных полисиаловых кислот также варьируется, так что имеются гомополимерные формы, например, альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота, включающая капсулярный полисахарид штамма K1 Е. Соli и meningococci группы В, и которая обнаруживается также на эмбриональной форме молекул адгезии нервных клеток (N-CAM). Гетерополимерные формы также существуют - например, чередующаяся альфа-2,8 альфа-2,9 полисиаловая кислота штамма К92 E. Соli и полисахариды группы С у N. meningitidis. Сиаловая кислота может быть также обнаружена в чередующихся сополимерах с мономерами, отличными от сиаловой кислоты, например, в группе W135 или Y у N. meningitidis. Полисиаловые кислоты выполняют важные биологические функции, включающие уход патогенных бактерий от воздействия иммунной системы и системы комплемента, а также регуляцию глиальной адгезивности незрелых нейронов во время развития плода (где полимеры несут анти-адгезивную функцию) [Muhlenhoff et. al., 1998], хотя на данный момент нет известных рецепторов для полисиаловых кислот у млекопитающих. Альфа-2,8-связанные Полисиаловые кислоты штамма K1 Е. Соli известны также как "коломиновая кислота" (СА, colominic acid) и использованы (с разной длиной), чтобы продемонстрировать в примерах настоящее изобретение.

Альфа-2,8-связанная форма полисиаловой кислоты, среди прочих бактериальных полисахаридов, не является иммуногенной (не вызывая ни Т-клеточный ответ, ни продукцию антител в организме млекопитающих, даже будучи конъюгированной с иммуногенными белками-носителями), что может отражать ее статус как полимер млекопитающих (в равной степени как и бактериальный полимер). Более короткие формы этого полимера (вплоть до n=4) обнаруживаются на ганглиозидах клеточной поверхности, которые широко распространены в организме и которые, как считается, в значительной мере обуславливают и поддерживают иммунологическую толерантность к полисиаловой кислоте. В последние годы биологические свойства полисиаловых кислот, особенно альфа-2,8-связанной гомополимерной полисиаловой кислоты, использовались для модификации фармакокинетических свойств белковых и низкомолекулярных лекарственных веществ [Gregoriadis, 2006; Jain et. al., 2003; US-A-5846,951; WO-A-0187922]. Дериватизация полисиаловой кислоты приводит к поразительному улучшению времени полужизни в кровотоке ряда терапевтических белков, включая каталазу и аспарагиназу, а также позволяет применять эти белки, несмотря на наличие предсуществующих антител, продукция которых явилась нежелательным (а иногда и неизбежным) последствием предшествующего воздействия этих терапевтических белков. Во многих отношениях модифицированные свойства полисиалированных белков сравнимы со свойствами белков, дериватизированных с помощью полиэтиленгликоля (PEG). Например, в каждом случае значения времени полужизни возрастают, а белки или пептиды становятся более устойчивы к протеолитическому расщеплению, но биологическая активность оказывается большей в случае PSA, по сравнению с PEG [Hreczuk-Hirst et. al., 2002]. Кроме того, имеются проблемы в использовании PEG вместе с терапевтическими средствами, которые следует вводить постоянно, поскольку PEG лишь в очень малой степени подвергается биологической деградации [Beranova et. al., 2000], и высокомолекулярные формы имеют тенденцию к накоплению в тканях [Bendele et. al., 1998; Convers et. al., 1997]. Было обнаружено, что дериватизированные с помощью полиэтиленгликоля белки вызывают выработку антител против PEG, что также может влиять на время жизни конъюгата в кровотоке [Cneng et. al., 1999]. Несмотря на укоренившуюся практику использования PEG как парентерально вводимого полимера, конъюгированного с лекарственными веществами, потребуется большее понимание его иммунотоксикологии, фармакологии и метаболизма [Hunter and Moghimi, 2002]. Более того, существуют сложности в использовании PEG в терапевтических средствах, для которых могут потребоваться большие дозировки, поскольку накопление PEG может привести к токсическим проявлениям. Поэтому альфа-2,8-связанная полисиаловая кислота представляет собой заманчивую альтернативу PEG, поскольку представляет собой иммунологически невидимый биодеградируемый полимер, который является естественной составляющей частью человеческого организма и который расщепляется с помощью тканевых нейраминидаз до сиаловой кислоты, нетоксичного сахарида. Однако неочищенная PSA загрязнена высоким содержанием эндотоксина, что ограничивает ее терапевтическое применение.

В предшествующих научных статьях и выданных патентах нашей группой была описана очистка и фракционирование PSA, а также ее использование для улучшения фармакокинетических свойств белковых терапевтических средств [Gregoriadis, 2006, Jain et. al., 2004; US-A-05846, 951; WO-A-0187922]. Теперь мы описываем получение очищенных полисиаловых кислот (PSAs) со сниженным содержанием эндотоксина, которые могут быть использованы для получения PSA-дериватизированных белков и других лекарственных веществ. Эти новые материалы и методы особенно подходят для получения PSA-дериватизированных терапевтических средств, предназначенных к применению у людей и животных, в которых химическое и молекулярное определение подлинности лекарственных веществ имеет повышенную важность ввиду медицинской этики и требований безопасности со стороны таких распорядительных органов, как FDA и ЕМЕА.

Эндотоксин (который является липополисахаридом) был впервые охарактеризован Рихардом Пфайфером (Richard Pfeiffer) в 1892 году как устойчивое к нагреванию токсичное вещество, выделяющееся при разрыве бактериальных оболочек. Воспалительная реакция в инфицированном организме хозяина приводит к развитию токсического эффекта, что, по-видимому, является оптимально адаптированной реакцией для устранения большинства местных инфекций. Тем не менее при этом может возникнуть воспалительная реакция, которая приведет к септическому шоку и смерти, если имеется системное распространение серьезных инфекций.

Этот липополисахарид (LPS) участвует в большинстве стадий, которые протекают в процессе презентации эндотоксина миелоидным клеткам иммунной системы и продукции провоспалительных цитокинов. Наиболее действенным компонентом LPS является липид А, и последний стал синонимом эндотоксина. Бактериальные медиаторы воспаления, такие как пептидогликан, диацилглицерилцистеиновая часть бактериальных липопротеинов и характерные элементы (сигнатуры, signatures) бактериальных нуклеиновых кислот, также относят к эндотоксину. Недавно было обнаружено, что толл-подобный рецептор (TLR4) является передатчиком воспалительного сигнала от липида А. Помимо этого были идентифицированы передатчики сигнала для различных медиаторов воспаления. Структура эндотоксина важна, поскольку информация о ней дает возможность понять, как эндотоксин можно удалить.

LPS состоит из трех частей: проксимальная - гидрофобный участок, образованный липидом А, который «заякоривает» LPS во внешнем слое внешней мембраны (ОМ); дистальный, представляющий собой гидрофильные повторы O-антигена и расположенный в водной среде; и связующая центральная часть (кор) - олигосахарид. Сахара O-антигена и кора, хотя и не являются существенными для выживания, но обеспечивают бактериальную устойчивость к различным антимикробным агентам, включая детергенты и мембрано-атакующий комплекс сывороточного комплемента.

Клетки дикого типа, продуцирующие O-антиген, называют «гладкими» (благодаря тому, что они образуют гладкие колонии), а те, которые не имеют O-антигена, - «шероховатыми». Молекулы, содержащие полисахарид O-антигена, обычно обозначают как LPS, а молекулы, не имеющие O-антигена, такие как в Neisseria, обозначают как липоолигосахарид, или LOS. Поскольку липид А жизненно важен и является также мощным медиатором воспаления, он представляет в настоящий момент мишень для разработки антибиотиков и противовоспалительных средств.

Многие медиаторы воспаления, помимо LPS, могут рассматриваться как эндотоксины, включая пептидогликан, диацилглицерилцистеиновую часть бактериальных липопротеинов, характерные элементы бактериальных нуклеиновых кислот и неактивные эндотоксины (продуцируемые эндотоксин-мутантными штаммами).

Модифицированная структура липида А была использована для разработки новых антагонистов эндотоксина и иммуностимуляторов [Christ et al., 1995]. Выяснение биохимических особенностей структуры и функции липида А позволяет понять его роль в бактериальном патогенезе и вводить новые методы борьбы с инфекцией [Bishop 2005].

Были разработаны способы для снижения содержания эндотоксина в жидкостях. Например, в WO 87/07531 описано удаление эндотоксина из содержащих эндотоксин жидкостей, таких как кровь, с использованием полимиксина В, иммобилизованного на твердофазном носителе.

В US 6,942,802 B2 описаны методы удаления бактериального эндотоксина из белкового раствора с целью извлечения белка. В этом патенте используется металл-аффинная хроматография.

US 6,713,611 B2 касается способа удаления эндотоксина из раствора, содержащего основные белки. Данный способ включает добавление поверхностно-активного вещества к раствору и нанесение полученного раствора на катионообменную колонку с последующим снятием основного белка с колонки.

В US 6,617,443 описан способ удаления эндотоксинов из материала, из которого следует получить нуклеиновые кислоты. Эндотоксины удаляются путем преинкубации нуклеиновых кислот в бессолевом растворе детергента и последующей анионообменной хроматографии с помощью анионообменника, изготовленного на основе технологии «щупалец».

В US 5,169,539 описан способ удаления эндотоксина из раствора, содержащего белок и эндотоксин, где рН раствора доводится до рН 9 или ниже (изоэлектрическая точка белка), и раствор пропускают через колонку, упакованную перекрестно связанным гранулярным хитозаном. Эндотоксин абсорбируется, а белок выходит.

В US 5,917,022 описан способ удаления эндотоксина из биологических продуктов, например белков для терапевтического применения, фракции плазмы крови и растворы альбумина. Этот способ включает связывание эндотоксина, присутствующего в указанных биологических продуктах, с перекрестно связанной гидрофильной матрицей, образованной сополимером аллилдекстрана и N,N'-метиленбисакриламида, с которым эндотоксин связывается с некоторой степенью специфичности. Этот способ относится к классу методов аффинной хроматографии.

US 7,109,322 раскрывает способ снижения содержания или удаления эндотоксинов из композиций, содержащих активные лекарственные вещества, как правило, нуклеиновые кислоты, выделенные из природных источников с помощью генной инженерии и/или биотехнологии. С этой целью композиции, извлекаемые, например, из культурального бульона, обрабатывают с помощью хроматографических материалов. Фракции природных источников, такие как культуральный бульон E. coli, получают и центрифугируют, лизируют с помощью 200 мМ NaOH, 1% додецилсульфата натрия, фильтруют и затем пропускают через анионообменную колонку, на которой преимущественно (по сравнению с эндотоксином) абсорбируется нуклеиновая кислота. Нуклеиновую кислоту смывают элюирующим буфером и собирают. В другом примере перед анионообменной колонкой применяют металл-аффинный абсорбент для эндотоксина.

Изобретение US 6,699,386 В2 представляет абсорбент, обладающий высокой способностью селективно абсорбировать эндотоксин, а также способ абсорбции эндотоксина из раствора белка. Данный абсорбент состоит из вещества основной природы, связанного с материалом-носителем с помощью перекрестно сшивающего реагента.

В изобретении US 6,774,102 описано вещество для обработки крови, обладающее способностью селективно удалять эндотоксин и индуцирующие цитокин вещества из крови или плазмы путем экстракорпоральной адсорбции, для терапевтического лечения септического шока. Здесь также представлены методы и оборудование, в которых используется адсорбент, включающий полидисперсный олигопептид по изобретению, иммобилизованный на твердофазной подложке, для удаления эндотоксина из крови человека или животного.

Также были описаны способы для удаления эндотоксина из образцов полисахаридов.

В US 5,589,591 раскрыт способ получения полисахаридной композиции, в существенной мере освобожденной от эндотоксина, в котором применяется методика разделения по размеру, предпочтительно ультрафильтрация. Этот способ подходит для удаления эндотоксина из маннанов, гуммиарабика и арабиногалактана, полученных из их растительных источников.

В патенте US 5,039,610 описан способ удаления эндотоксина из грамотрицательных полисахаридов, таких как полирибозилрибитолфосфат. Содержащий полисахариды порошок, полученный из культурального бульона грамотрицательных бактерий, солюбилизируют с целью получения двухвалентного противоиона для эндотоксина. Добавляют в возрастающем количестве спирт, чтобы вызвать осаждение липополисахарида, и полученный материал смешивают с неионной смолой, детергентом и хелатирующим реагентом.

Однако до сих пор остается актуальной задача снижения содержания эндотоксина в образцах полисиаловой кислоты до приемлемого уровня для применения в лекарственных препаратах. Полисахарид из культуральных бульонов имеет содержание анионов и молекулярный вес, очень близкие к эндотоксину. Природное соединение также является липополисахаридом. По этим причинам большинство методов очистки приводят к частичной соочистке PSA и эндотоксина. Настоящее изобретение позволяет решить эти проблемы.

В соответствии с первым аспектом данного изобретения, мы представляем способ снижения содержания эндотоксина в образцах, содержащих полисиаловую кислоту и эндотоксин, включающий последовательные стадии:

(i) добавление к образцу основания, имеющего рКа по меньшей мере 12, чтобы получить основный раствор с рН по меньшей мере 12, инкубация раствора в течение предварительно определенного времени при предварительно определенной температуре; и затем

(ii) извлечение из раствора полисиаловой кислоты, имеющей сниженное содержание эндотоксина.

В одном воплощении извлечение PSA из раствора включает стадии:

(iii) пропускание обработанного основанием раствора через анионообменную колонку, в ходе чего полисиаловая кислота абсорбируется на анионообменной смоле;

(iv) промывание колонки одним промывочным буфером, в результате чего полисиаловая кислота остается абсорбированной на анионообменной смоле; и

(v) элюирование полисиаловой кислоты с колонки с помощью элюирующего буфера для получения конечного раствора полисиаловой кислоты, имеющего сниженное содержание эндотоксина. Считается, что по меньшей мере некоторое количество обработанного основанием продукта эндотоксина выходит из ионообменной колонки в мертвом объеме.

В другом воплощении стадия извлечения (ii) включает стадию обработки с целью удаления солей, т.е. основанную на эксклюзионной хроматографии, при этом более высокомолекулярные вещества, такие как полисахариды, получают свободными от солей. Это изобретение особенно полезно для обработки бактериальных культуральных бульонов.

Раствор, содержащий полисиаловую кислоту и эндотоксин, который подвергают обработке основанием согласно способу по изобретению, является предпочтительно культуральным бульоном (обычно супернатант после центрифугирования) или продуктом предварительных стадий обработки с целью удаления нежелательных загрязняющих веществ, таких как питательные вещества, липиды, белки и нуклеиновая кислота. Тем не менее образец может содержать белок, присутствие которого нежелательно в конечном продукте, поскольку ожидается, что он будет расщеплен основанием, а продукты деградации будут легко удалены в ходе стадий извлечения PSA.

Данный способ позволяет получить образцы PSA, которые имеют сниженное содержание эндотоксина и которые подходят для применения в изготовлении лекарств. Для специалиста в данной области удивительно то, что использование сильного основания не приводит к деградации (молекулярного веса) или деацетилированию PSA. Опытный специалист постарался бы избежать контакта PSA с сильным основанием, таким как NaOH, в тех случаях, когда следует избегать деацетилирования (см., например, Мое et al.). Тем не менее мы показали, что инкубация с основанием с последующим извлечением PSA, например с помощью элюирования с анионообменной колонки, является исключительно эффективным способом снижения содержания эндотоксина в PSA и при этом не приводит ни к химической модификации (например, к деацетилированию), ни к снижению молекулярного веса.

В соответствии со вторым аспектом изобретения, представлен образец PSA материала, имеющий сниженное содержание эндотоксина, который можно получить указанным выше способом.

Содержание эндотоксина должно быть снижено до фармацевтически приемлемого уровня. Предпочтительно, чтобы содержание эндотоксина в образце после применения способа по изобретению было менее 25 ЭЕ/мг (эндотоксиновых единиц на мг) в PSA-материале. Таким образом, третий аспект изобретения представляет образец PSA, имеющий содержание эндотоксина 25 ЭЕ/мг или менее в PSA-материале, что определено с помощью теста LAL. Предпочтительно, чтобы содержание эндотоксина было в переделах 0,05-25 ЭЕ/мг в PSA-материале. Настоящее изобретение предоставляет образцы самой PSA, а также образцы конъюгатов с PSA, например конъюгаты с биологической молекулой или системой доставки лекарственных веществ (которые далее будут обозначаться как PSA-материал), имеющие низкое содержание эндотоксина.

Способ по изобретению осуществляют в условиях, которые обеспечивают хороший выход PSA. Предотвратить загрязнение PSA аффинными лигандами, такими как полимиксин В, или поликатионами, такими как поли-D-лизин, которые обычно используют в аффинных адсорбентах, разработанных для удаления эндотоксина, можно либо опуская применение этих материалов совсем, либо применяя их в условиях, при которых не происходит деградация матрицы (при этом удаление эндотоксина может быть не оптимизированным). Такую «очищенную» PSA можно применять для дериватизации терапевтических средств, например белков, и вводить в человеческий организм без риска возникновения токсических проявлений эндотоксина.

Уровень эндотоксина измеряли с помощью LAL-теста, как описано в Европейской Фармакопее 5.0, Приложение XIVC.

На стадии (i) способа образец добавляют к основанию, имеющему рКа по меньшей мере 12. Не ограничиваясь какой-либо теорией, предполагают, что основание расщепляет связи, по всей видимости, сложноэфирные связи эндотоксина, делая его неактивным и/или способствуя удалению продуктов реакции. Таким образом, для того, чтобы основание могло быть применено в способе согласно данному изобретению, оно должно быть достаточно сильным, чтобы реагировать с эндотоксином и гидролизовать последний. Удивительно, что концентрация эндотоксина снижалась без существенного разрушения полисиаловой кислоты, например, посредством деацетилирования N-ацетильных групп или расщепления цепей полисиаловой кислоты.

Предпочтительно, чтобы основание имело рКа по меньшей мере 13 или, более предпочтительно, по меньшей мере 14. Желательно, чтобы основание давало основный раствор, имеющий рН по меньшей мере 13, более предпочтительно - по меньшей мере 14. Образец обычно инкубируют с основанием в подходящем буфере, например в буфере HEPES, или в воде.

Основания, пригодные для применения в данном изобретении, - это NaOH, КОН и LiOH. Особенно предпочтителен NaOH. NaOH подходит для применения в концентрации 2н.

Стадию (i) проводят в течение предварительно определенного времени, которое обычно находится в пределах от 5 минут до 24 часов, предпочтительно, от 30 минут до 6 часов. Предварительно определенная температура обычно находится в пределах от 0°С до 60°С и предпочтительно от 2°С до 40°С. Более высокие температуры и/или большее время может привести к нежелательной деградации самой PSA.

В одном из воплощений изобретения инкубацию на стадии (i) проводят в течение 2 часов при 20°С при постоянном перемешивании. За стадией (i) может непосредственно следовать дополнительная стадия, в которой образец нейтрализуют. Нейтрализацию можно осуществлять, например, с помощью HCl, для достижения конечной рН раствора около 7,4.

Подходящий способ, включающий применение ионообменной хроматографии, на которой могут быть основаны стадии (iv) и (v), описан в нашей предыдущей заявке на патент WO 2006/016161. Этот способ может быть адаптирован для применения в настоящем изобретении в случаях, где нет необходимости на этой стадии разделять PSA на фракции с различным средним молекулярным весом. Согласно этому известному способу, полисиаловую кислоту разделяют на фракции с различным средним молекулярным весом. Водный раствор PSA вводят в контакт с анионообменной смолой в колонке, в ходе чего PSA адсорбируется. Затем PSA селективно элюируют водными элюирующими буферами и PSA извлекают из элюированных фракций. Селективное элюирование включает промывание смолы на колонке, по меньшей мере, одним элюирующим буфером. Если используют более чем один элюирующий буфер, каждый из них может иметь различную ионную силу и/или рН, причем второй и последующие буферы имеют более высокую ионную силу и/или рН, чем буферы, использованные на непосредственно предшествующей стадии. Процедура фракционирования с использованием ионного обмена приводит к небольшому снижению содержанию эндотоксина.

В предпочтительных воплощениях способа по данному изобретению образец пропускают через анионообменную колонку после того, как он был обработан основанием. Возможно, потребуется подготовить образец перед его нанесением на колонку; возможно, например, его необходимо разбавить. По меньшей мере, небольшое количество эндотоксина пройдет сквозь колонку, и желательно выбрать буфер для нанесения таким образом, чтобы PSA адсорбировалась полностью, а по меньшей мере, некоторое количество эндотоксина не могло бы адсорбироваться. Примеры буферов для нанесения описаны ниже.

Стадия (iv) данного способа - это стадия промывки, в которой колонку промывают элюирующим буфером с низкой концентрацией ионного соединения. Например, такую начальную стадию промывки можно проводить с помощью буфера, имеющего концентрацию соли, равную 100 мМ или меньше. Как правило, промывочный буфер содержит триэтаноламин и имеет рН около 7,4. На этой начальной стадии могут вымываться низкомолекулярные загрязняющие вещества. На стадии промывки может быть использован по меньшей мере 1, предпочтительно, по меньшей мере, 1,5 объема колонки, рассчитанного из объема колонки с ионообменной смолой. В ходе этой стадии практически вся полисиаловая кислота остается на ионообменной смоле. Может быть проведена более чем одна стадия промывки. Второй промывочный буфер может быть идентичен первому или, в другом варианте, включать спирт и/или поверхностно-активное вещество. Подходящими примерами поверхностно-активных веществ являются неионные вещества, такие как PEG, Tween 20 и 80 и Triton. На стадиях промывки с колонки может происходить дальнейшее удаление эндотоксина.

Следует отметить, что колонка с ионообменной смолой может иметь диаметр поперечного сечения больший, чем высота, или, как в стандартной колонке, может иметь высоту большую, чем диаметр поперечного сечения. Объем может находиться в пределах от 1 мл до 5000 мл. Высота колонки может варьироваться от 1 см до 5000 см. Площадь поперечного сечения может быть в пределах от 1 см² до 5000 см². Поперечное сечение может иметь любую форму, но предпочтительно - круглую.

После стадии промывки анионообменной смолы PSA элюируют с помощью элюирующего буфера. Элюирующий буфер, используемый на стадии (v), обычно имеет относительно более высокую ионную силу, чем промывочный буфер, с тем чтобы удалить PSA с колонки. Как правило, элюирующий буфер содержит NaCl в концентрации по меньшей мере 0,4 М.

Нами было обнаружено, что предпочтительнее на стадии элюирования в желаемом воплощении использовать по меньшей мере 1,0, предпочтительно, по меньшей мере 1,25, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 1,5 объема колонки соответствующего элюирующего буфера. Желательно использовать не более чем 3 объема колонки элюирующего буфера. Скорость потока для матрицы объемом 75 мл предпочтительно должна быть 7 мл/мин.

Предпочтительное воплощение данного способа может включать более чем одну стадию, например, по меньшей мере 5, например, порядка 20 или, как правило, в пределах от 6 до 12 последовательных стадий элюирования, с помощью элюирующих буферов с последовательно возрастающей ионной силой. Ионная сила в первой из этих основных стадий находится обычно в пределах от 1 мМ до 1 М. Таким образом, элюируемую полисиаловую кислоту можно фракционировать на образцы, имеющие разный средний молекулярный вес.

Предпочтительно изменять ионную силу элюирующего буфера, варьируя содержание соли сильной минеральной кислоты и сильного минерального основания, предпочтительно, хлорида натрия.

После осуществления стадии (v) и получения раствора продукта можно повторить стадии (i) и от (iii) до (v). Предпочтительно, повторяют стадии (iii)-(v).

Можно и далее обрабатывать PSA. Последовательные стадии могут включать дальнейшие стадии очистки и/или концентрирования. С учетом последующих стадий, эти стадии обычно включают шаги, в которых полисахарид освобождают от всех солей, например, с помощью мембран, например мембран для ультрафильтрации. Подобные стадии могут позволить провести дополнительное концентрирование PSAs с получением более высоко концентрированных растворов. Над такими растворами можно проводить дополнительные стадии обработки с помощью мембран, например, ультрафильтрацию или другие стадии фильтрации.

Элюирующий буфер для анионообменной хроматографии может содержать летучую кислоту или основание, и в этом случае дальнейшие стадии могут включать выпаривание летучего основания из элюированных фракций. Хотя возможно извлечь PSA из водных растворов с помощью преципитации, например, применяя осадители для PSAs, предпочтительно, чтобы такие растворители не использовались, поскольку они могут сделать конечное выделение из соответствующих растворителей более сложным. Соответственно, конечный шаг выделения предпочтительно включает выпаривание воды и, предпочтительно, всех остаточных летучих компонентов буфера, оставшихся от стадий элюирования. В предпочтительном варианте, где присутствует триэтаноламин, как катион триэтаноламина, так и ацетат-анион являются летучими и могут быть легко удалены под вакуумом.

PSA может быть окончательно выделена из раствора путем высушивания, желательно, при пониженном давлении. Это предпочтительно осуществляют с помощью лиофилизации.

Преципитация, желательно с использованием осадителя, может осуществляться как стадия, предшествующая фракционированию, с целью удаления части популяции молекул PSA и уменьшения полидисперсности фракций с наибольшим молекулярным весом. Предпочтительно используют дифференциальную преципитацию этанолом.

Способ может включать дополнительную стадию либо перед стадией (i), либо между стадиями (i) и (ii), либо после стадии (ii). Это может быть хроматография гидрофобных взаимодействий (hydrophobic interaction chromatography, HIC), аффинная хроматография, например металл-аффинная хроматография (immobilized metal affinity chromatography, IMAC) или эксклюзионная хроматография (size exclusion chromatography, SEC).

Подходящая HIC-колонка должна быть такой, чтобы на ней адсорбировался эндотоксин, но не сорбировалась PSA, например Phenyl FF. Буфером для нанесения обычно является сульфат аммония, хлорид натрия и т.п. в деионизированной воде или же деионизированная вода с рН, доведенной до 7,4.

HIC предпочтительно осуществляют перед стадией (i). Фактически, полагают, что здесь HIC впервые была применена для удаления эндотоксина из образца PSA. Удивительно то, что HIC можно использовать для удаления эндотоксина без соудаления полисиаловой кислоты, например, из культурального бульона, т.е. в форме липополисахарида, или, наоборот, например, в случаях, когда материал PSA конъюгируют для того, чтобы сделать его более гидрофобным, чем эндотоксин. Путем подбора соответствующей колонки и условий можно добиться, чтобы эндотоксин адсорбировался на колонке, в то время как PSA выходит, не задерживаясь, или наоборот, либо в мертвом объеме (в буфере для нанесения), либо путем элюирования с помощью подходящего элюирующего буфера. Таким образом, в соответствии со следующим аспектом изобретения, мы представляем новый способ снижения содержания эндотоксина в образце, содержащем полисиаловую кислоту и эндотоксин, включающий пропускание образца через колонку для хроматографии гидрофобных взаимодействий, на которой адсорбируется эндотоксин, в то время как PSA проходит сквозь колонку, и ее собирают, получая конечный раствор полисиаловой кислоты, имеющий сниженное содержание эндотоксина. В соответствие с дальнейшим аспектом изобретения, мы представляем новый способ снижения содержания эндотоксина в образце, содержащем полисиаловую кислоту и эндотоксин, включающий пропускание образца через колонку для хроматографии гидрофобных взаимодействий, на которой адсорбируется материал PSA, причем эндотоксин проходит сквозь колонку, а материал PSA адсорбируется, а затем материал PSA элюируют и собирают, получая конечный раствор полисиаловой кислоты, имеющий сниженное содержание эндотоксина. Предпочтительно использовать фенильную колонку, поскольку фенильные группы связываются с эндотоксином, в то же время обеспечивая прохождение PSA сквозь колонку. В первом воплощении, после прохождения мертвого объема, содержащего эндотоксин, колонку можно промыть промывочным буфером и собрать промывочные фракции, которые тоже могут содержать PSA. Второе воплощение особенно подходит для очистки конъюгатов PSA с белками, например с относительно гидрофобными белками.

В способе по изобретению после стадии (ii) могут быть применены средства аффинной фильтрации. Подбирают аффинные матрицы, которые специфически улавливают эндотоксин. Условия подбирают таким образом, чтобы PSA не адсорбировалась при нанесении раствора. Часто бывает желательным избегать применения эндотоксин-специфичной аффинной хроматографии, чтобы избежать загрязнения продуктами деградации матрицы. Желательно во всех случаях, когда включают подобную стадию, подбирать условия таким образом, чтобы избежать подобной деградации. Несмотря на то, что такие условия могут быть подобраны ценой оптимизации удаления эндотоксина, при комбинации с основными стадиями способа по изобретению, в ходе многостадийной процедуры уровень эндотоксина может быть снижен до приемлемого уровня.

В одном воплощении настоящего изобретения применяется аффинная матрица, включающая иммобилизованный реагент, связывающий эндотоксин, для очистки образца PSA. Подходящим реагентом является гель полимиксина В, особенно Detoxi-Gel™.

В геле Detoxi-Gel™ (гель, удаляющий эндотоксин, Endotoxin Removing Gel) применяется иммобилизованный полимиксин В для связывания и удаления пирогенов из раствора. Полимиксины представляют собой семейство антибиотиков, которые содержат катионный циклопептид с цепочкой жирной кислоты. Полимиксин В нейтрализует биологическую активность эндотоксинов за счет связывания с участком липида А бактериального липополисахарида. Исследования, проведенные Клугером (Kluger et at., 1985), показывают, что полимиксин В инактивирует некоторые, но не все эндотоксины.

Гель с иммобилизованным полимиксином В является стабильной аффинной матрицей, которая устойчива к утечке лиганда в ценный образец. Применение аффинной подложки позволяет осуществить быструю очистку буферов, клеточной культуральной среды, растворов, содержащих макромолекулы (например, белки) и фармакологически значимые компоненты. Гель Detoxi-Gel™ Endotoxin Removing Gel также был применен для удаления эндотоксина из образцов нуклеиновой кислоты (ДНК) (Wicks et al., 1995).

Как правило, перед применением геля полимиксина В его следует сначала дегазировать. Гели можно регенерировать путем промывки, обычно с помощью детергента, например деоксихолата натрия, с последующей промывкой для удаления детергента. Подходящим агентом для промывки геля является вода, не содержащая пирогенов. После того как гель один раз регенерировали, его упаковывают в колонку и добавляют буфер или воду, не содержащие пирогенов. Время инкубации колонки, как правило, составляет один час. После того как образец собрали, его обычно лиофилизируют для предотвращения бактериальных загрязнений.

Колонка Cellufine™ представляет собой другой тип колонки для аффинной хроматографии, которую можно применять для снижения содержания эндотоксина в образце PSA. Такую колонку обычно уравновешивают с помощью 2-8, например, 5 объемами колонки буфера, не содержащего эндотоксина, например буфера HEPES (рН 7,4). HEPES можно применять также в качестве буфера для нанесения. Cellufine является особенно подходящим материалом для применения, поскольку он содержит компонент, связывающий PSA с низкой специфичностью.

Другими коммерчески доступными эндотоксин-селективными колонками для аффинной хроматографии являются колонки EndoTrap. Колонка EndoTrap Red™ также может применяться для снижения содержания эндотоксина в образце PSA. Такую колонку обычно уравновешивают с помощью 5-10, например, 5 объемами колонки буфера, не содержащего эндотоксина, например, с помощью Regeneration Buffer Red™ и 20 мМ буфером HEPES (рН 7,4) или с помощью деионизированной воды (рН 7,4). HEPES или деионизированная вода могут быть также использованы в качестве буфера для нанесения.

Колонка EndoTrap Blue™ может применяться для снижения содержания эндотоксина в образце PSA. Такую колонку обычно уравновешивают с помощью 5-10, например, 5 объемами колонки деионизированной воды (рН 7,4), содержащей 50-100 мкМ Са²⁺.

По способу согласно первому аспекту изобретения образец можно обрабатывать другими средствами очистки. Например, обработка образца может включать одну или более предварительных стадий инкубации с поверхностно-активным веществом, хелатирующим реагентом, основанием, органическим растворителем, окислителем или пероксидазой перед стадией (i), между стадиями (i) и (ii) или после стадии (ii).

Желательно, чтобы поверхностно-активным веществом было анионное поверхностно-активное вещество, например додецилсульфат натрия (SDS). В другом варианте, поверхностно-активным веществом может быть 0,5% Triton X 114 или 1% Triton X 100 или 114. В качестве другого варианта могут быть применены катионные поверхностно-активные вещества, например бактерицидно-активные поверхностно-активные соединения, такие как бромид цетилтриметиламмония. Подходящее время инкубации - 1 час. Подходящие температуры находятся в пределах 0-50°С, хотя предпочтительны температуры в диапазоне 35-37°С.

В тех случаях, когда используют неионное поверхностно-активное вещество, раствор наносят на анионообменную колонку для удаления неионных поверхностно-активных веществ. Здесь может быть использован буфер 20 мМ TEA.

В одном воплощении настоящего изобретения образец PSA инкубируют в присутствии 1% SDS/ 2 Н NaOH в буфере HEPES в течение 1 часа, а затем раствор наносят на колонку для удаления соли и анионного поверхностно-активного вещества, например колонку GPC, и фракционируют с помощью подходящего буфера, как п