Слитый белок теломеразной обратной транскриптазы, кодирующие его нуклеотиды и их применение

Слитый белок теломеразной обратной транскриптазы, кодирующие его нуклеотиды и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на связанные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №60/851183, поданной 12 октября 2006 года, содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

Область изобретения

Настоящее изобретение в основном относится к лечению злокачественных заболеваний. Более конкретно, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим слитые белки, которые содержат по меньшей мере часть ассоциированного с опухолью полипептида теломеразной обратной транскриптазы (TERT). Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам и хозяевам, содержащим указанные полинуклеотиды, к очищенным слитым белкам и способам индукции или усиления иммунной реакции в ответ на белковый продукт гена TERT с использованием композиций и молекул, описываемых в настоящем документе.

Предпосылки изобретения

Вакцинация стала стандартной процедурой для профилактики множества инфекционных заболеваний. Применение вакцин для других заболеваний, таких как злокачественные опухоли, является в настоящее время привлекательной возможностью ввиду прогресса в молекулярной инженерии и лучшего понимания иммунологии опухолей.

Злокачественные опухоли представляют собой одну из ведущих причин смертности в мире. Несмотря на множество связанных со злокачественными опухолями исследований, традиционные способы лечения, сочетающие хирургию, радиационное излучение и химиотерапию, часто не обеспечивают эффективное лечение злокачественных опухолей на поздних сроках. Также недоступными остаются надежные способы профилактики.

Злокачественная опухоль, как правило, включает нарушение функции генов, участвующих в регуляции клеточного цикла или клеточной пролиферации, таких как гены факторов роста и их рецепторов, онкогены и гены опухолевых супрессоров. Продукты многих из этих генов экспрессированы на поверхности широкого спектра опухолевых клеток и, таким образом, являются опухолеспецифическими антигенами (TAA). Во многих экспериментальных моделях показано, что введение кодирующих TAA генов непосредственно индивиду вызывает защитный иммунный ответ против TAA, делая эти молекулы мишенью вакцинотерапии. Однако поскольку многие из этих генных продуктов также экспрессируются в нормальных клетках, хотя и на более низких уровнях, было показано, что многие иммунологические способы лечения, направленные на TAA, являются неэффективными.

Гены, кодирующие некоторые опухолеспецифические антигены (TAA), выделены, охарактеризованы и встроены в генетические векторы, такие как плазмидные ДНК и вирусные векторы. Один из опухолеспецифических антигенов, который вовлечен в патогенез злокачественной опухоли, представляет собой теломеразу (TERT).

Теломераза представляет собой ДНК-полимеразу, функция которой в норме заключается в сохранении длины теломер на концах хромосом. В течение роста нормальной клетки к 5'-концу ДНК присоединяется РНК-праймер и начинается репликация. После удаления РНК-праймера на участке образующейся дочерней цепи ДНК остается пропуск. Таким образом, репликация линейной цепи ДНК обычными полимеразами приводит к уменьшению длины теломеры в каждом следующем раунде репликации. Такое уменьшение длины теломеры отвечает за нормальное старение или созревание клеток у нормальных соматических клеток человека.

Теломераза представляет собой рибонуклеопротеин, содержащий компонент РНК и каталитический белковый компонент (теломеразную обратную транскриптазу). Каталитический компонент теломеразы человека описан Meyerson et al. (Cell 1197: 785-95 (1990) и Nakamura et al. (Science 277: 955-59 (1997)). Фермент TERT использует свой компонент РНК в качестве матрицы для синтеза ДНК теломеры, таким образом, позволяя теломерам поддерживать их длину на протяжении последовательных стадий клеточного роста. Такое поддержание длины теломер в течение многих циклов пролиферации позволяет клеткам избежать нормального старения и стать бессмертными, позволяя опухоли расти и метастазировать в течение длительных периодов времени. Так как теломераза дает клеткам репликационное бессмертие, теломеразная активность выявлена в линиях злокачественных клеток и широком диапазоне типов опухолей (Kim et al. Science 266: 2011-15 (1994)). Наоборот, в нормальных тканях человека и в культурах нормальных соматических клеток теломераза не активна или только временно экспрессируется на низких уровнях. Сочетание сверхэкспрессии теломеразы в большинстве типов злокачественных опухолей, а также низкая или отсутствующая экспрессия в нормальных клетках, делает TERT мишенью для терапии и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с нарушенной клеточной пролиферацией, таких как злокачественная опухоль.

В настоящее время возможно получение специфичной для теломеразы вакцины, так как клонированы и охарактеризованы каталитический и РНК компоненты теломеразы (см., например, патент США 6166178). Однако получение и промышленное внедрение многих вакцин затруднено из-за сложностей, связанных с получением высоких уровней экспрессии желаемого иммуногена в успешно трансформированных организмах-хозяевах. Получение эффективных вакцин на основе ДНК также затруднено из-за отсутствия возможности получить иммунный ответ достаточной силы у индивидуумов, получаемых в клинических условиях лечение для регрессии опухоли. Таким образом, несмотря на идентификацию нуклеотидных последовательностей дикого типа, кодирующих описанные выше белки теломераз, крайне желательно получить вакцину, которая могла бы при введении млекопитающему вызывать усиленный специфичный для TERT иммунный ответ по сравнению с полноразмерной кДНК TERT дикого типа. Также желательно разработать способы лечения или профилактики ассоциированных с TERT злокачественных опухолей, в которых используются молекулы нуклеиновой кислоты или белки, которые безопасно и эффективно усиливают специфичный для TERT иммунный ответ.

Сущность изобретения

Как указано выше, экспрессия гена опухолеспецифического антигена теломеразной обратной транскриптазы (TERT), как правило, связана с развитием или наличием аденокарцином, включая колоректальные карциномы. В связи с этим настоящее изобретение относится к композициям и способам индукции или усиления иммунного ответа к белковым продуктам, экспрессируемым геном TERT человека (hTERT). В частности, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим слитые белки, которые содержат белок hTERT или его вариант, слитый со значительной частью субъединицы B термолабильного энтеротоксина (LTB) E. coli. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам, включающим, без ограничения перечисленным, аденовирусные и плазмидные векторы, содержащие указанные полинуклеотиды, и к клеткам-хозяевам, содержащим указанные рекомбинантные векторы. Также в настоящем описании представлены очищенные слитые белки, кодируемые полинуклеотидами по изобретению. Слитые белки hTERT-LTB и полинуклеотиды, кодирующие указанные слитые белки, могут использоваться в качестве вакцин для профилактики и/или лечения ассоциированной с теломеразой злокачественной опухоли. Указанные вакцины можно использовать как монотерапию или как часть схемы лечения, которая включает введение второй вакцины, такой как полинуклеотидная, клеточная, белковая или пептидная вакцина, или включает проведение лучевой терапии или химиотерапии.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая hTERT, и/или нуклеотидная последовательность, кодирующая LTB, содержит кодоны, которые оптимизированы для высоких уровней экспрессии в клетке-хозяине человека. Другими словами, в определенных вариантах осуществления характер использования кодонов полинуклеотидной последовательности совпадает с характером использования кодонов высокоэкспрессированных генов млекопитающих и/или человека.

В другом аспекте изобретение относится к экспрессирующей конструкции, содержащей нуклеотиды, кодирующие hTERT-LTB. В предпочтительных вариантах осуществления этой части изобретения конструкция содержит перед кодирующей последовательностью гена TERT лидерную последовательность TPA для гарантии секреции слитого белка TERT-LTB.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения теломеразную каталитическую активность антигена теломеразы инактивируют, чтобы кодируемый слитый белок TERT был более безопасным при вакцинации, чем TERT дикого типа. Ферментативную активность слитого белка TERT можно инактивировать введением в нуклеотидную последовательность, кодирующую TERT, мутаций/делеций. В конкретных вариантах осуществления изобретения, представленных в качестве примеров, нуклеотиды мутированы с изменением конкретных аминокислот D712A и V713I в последовательности белка TERT человека, и D702A и V703I в последовательности белка TERT мыши.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к аденовирусным и плазмидным векторам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую слитый белок hTERT-LTB. В настоящем изобретении также описано использование аденовирусных и плазмидных векторов в иммуногенных композициях и вакцинах для профилактики и/или лечения ассоциированной с hTERT злокачественной опухоли.

Также представлены аденовирусные векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TERT или вариант белка TERT человека. Варианты, подходящие для настоящего аспекта по изобретению, содержат мутации, функцией которых является элиминация теломеразной каталитической активности. В предпочтительных вариантах осуществления этой части изобретения аденовирусный вектор представляет собой вектор Ad6. В других предпочтительных вариантах осуществления вектор Ad представляет собой вектор Ad5.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам профилактики развития злокачественной опухоли у пациента или лечения пациента с ассоциированной с теломеразой опухолью путем индукции иммунного ответа на белок TERT за счет введения вакцины или фармацевтической композиции, содержащей слитые последовательности TERT или слитые белки TERT, предоставленные изобретением. В предпочтительных вариантах осуществления способов по настоящему документу иммунный ответ усилен по сравнению с ответом, индуцируемым TERT дикого типа.

Как используется в настоящем описании и в приложенной формуле изобретения, если в контексте явно не указано иначе, формы единственного числа включают указание на множественное число.

Как используется в настоящем описании и в приложенной формуле изобретения, используют следующие определения и сокращения:

Термин "промотор" относится к сайту распознавания на цепи ДНК, с которой связывается РНК-полимераза. Промотор образует инициирующий комплекс с РНК-полимеразой для инициации и запуска транскрипционной активности. Комплекс может быть модифицирован активирующими последовательностями, называемыми "энхансерами", или ингибирующими последовательностями, называемыми "сайленсерами".

Термин "кассета" относится к нуклеотидной или генной последовательности, которая экспрессируется с вектора, например, нуклеотидная или генная последовательность, кодирующая слитую последовательность hTERT(AI)-LTB. Как правило, кассета содержит генную последовательность, которая может быть встроена в вектор, который в некоторых вариантах осуществления содержит регуляторные последовательности для экспрессии нуклеотидной или генной последовательности. В других вариантах осуществления регуляторные последовательности для своей экспрессии содержит сама нуклеотидная или генная последовательность. В дополнительных вариантах осуществления вектор содержит некоторые регуляторные последовательности, а нуклеотидная или генная последовательность содержит другие регуляторные последовательности. Например, вектор может содержать промотор для транскрипции нуклеотидной или генной последовательности, а нуклеотидная или генная последовательность содержит последовательность терминации транскрипции. Регуляторные последовательности, которые могут содержаться в векторе, включают, но не ограничиваются ими, энхансеры, последовательности терминации транскрипции, последовательности акцепторных участков и донорных участков сплайсинга, интроны, последовательности связывания рибосом и последовательности добавления поли(A).

Термин "вектор" относится к некоторым средствам, с помощью которых фрагменты ДНК могут быть введены в организм хозяина или в ткань хозяина. Существуют различные типы векторов, включая плазмиды, вирусы (в том числе аденовирусы), бактериофаги и космиды.

Как используется по отношению к аденовирусным векторам, термин "первое поколение" описывает аденовирусные векторы, которые дефектны по репликации. У аденовирусных векторов первого поколения, как правило, удалена или инактивирована генная область E1 и, предпочтительно, удалена или инактивирована генная область E3.

Обозначение "pV1JnsA/TPA-mTERT(AI)-LTBopt" относится к описываемой в настоящем документе плазмидной конструкции, содержащей предранний (IE) промотор CMV с интроном A, полноразмерный ген TERT мыши с оптимизированными кодонами, слитый с геном LTB с оптимизированными кодонами, и полученные из бычьего гормона роста последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции (см. пример 2). Дополнительно, со стороны 5' от нуклеотидной последовательности, кодирующей mTERT-LTB, находится лидерная последовательность, кодирующая сигнальную последовательность активатора тканевого плазминогена (TPA) человека. Обозначение "AI" указывает на то, что в последовательность для функционального устранения теломеразной каталитической активности TERT введены мутации. Обозначение "pV1JnsA/mTERT(AI)opt" относится к конструкции, в основном такой же, как описано выше, за исключением того, что конструкция содержит оптимизированную для мыши нуклеотидную последовательность TERT, которая не слита с LTB или с TPA.

Обозначение "pV1JnsA/TPA-hTERT(AI)-LTBopt" относится к описываемой в настоящем документе плазмидной конструкции, содержащей предранний (IE) промотор CMV с интроном A, полноразмерный ген TERT человека с оптимизированными кодонами, слитый с геном LTB с оптимизированными кодонами, и полученные из бычьего гормона роста последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции (см. пример 2). Дополнительно, со стороны 5' от нуклеотидной последовательности, кодирующей hTERT-LTB, находится лидерная последовательность, кодирующая сигнальную последовательность активатора тканевого плазминогена (TPA) человека. Последовательность hTERT в данной конструкции содержит мутации для функционального устранения теломеразной каталитической активности.

Обозначения "Ad6/TPAmTERT(AI)-LTBopt" и "Ad6/hTERT(AI)" относятся к двум описываемым в настоящем документе конструкциям, которые содержат геном аденовируса Ad6 с делецией областей E1 и E3. В конструкции "Ad6/TPAmTERT(AI)-LTBopt" область E1 заменена геном TERT-LTB мыши с оптимизированными кодонами в параллельной E1 ориентации под контролем промотора CMV человека без интрона A, с последующим сигналом полиаденилирования бычьего гормона роста. Кодирующая TERT последовательность содержит мутации для устранения теломеразной каталитической активности. Конструкция со стороны 5' от кодирующей TERT(AI)-LTB нуклеотидной последовательности дополнительно содержит последовательности, кодирующие сигнальную последовательность активатора тканевого плазминогена (TPA) человека. Конструкция "Ad6/hTERT(AI)" в основном является такой же, как описано выше, за исключением того, что область E1 генома Ad6 заменена кДНК последовательностью TERT, где указанная последовательность содержит мутации для устранения ферментативной активности.

Сокращение "LTB", как правило, относится к субъединице B термолабильного энтеротоксина E. coli или значительной ее части, включая субъединицы, которые укорочены на C-конце или N-конце, но сохраняют адъювантную активность, а также субъединицы, содержащие внутренние аминокислотные вставки, делеции или замены, но сохраняющие адъювантную активность (Fingerut et al. Vaccine 23:4685-4696(2005)).

Как используют в настоящем документе, "слитый белок" относится к белку, имеющему по меньшей мере два гетерологичных полипептида, ковалентно связанных, где один полипептид получен из одной белковой последовательности или домена, а другой полипептид получен из второй белковой последовательности или домена. Слитые белки по настоящему изобретению содержат полипептид TERT или его фрагмент или вариант и второй полипептид, содержащий значительную часть LTB. Полипептид TERT, его фрагмент или вариант могут представлять собой TERT человека или гомолог TERT других видов, например мыши. Полипептиды, составляющие слитый белок, предпочтительно связаны N-концом с C-концом. Слияние полипептида TERT и полипептида LTB можно проводить в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения C-конец полипептида TERT слит с N-концом LTB, как проиллюстрировано на фигурах 1 и 2. Однако также рассматриваются слитые белки, в которых субъединица LTB слита с N-концом полипептида TERT.

Термин "слитый белок TERT" или "слитый белок TERT-LTB" используют в настоящем документе взаимозаменяемо как общий термин, который относится к слиянию, как описано выше, которое включает полипептид TERT или его фрагмент или вариант, слитый с полипептидом LTB. Термин "слитая последовательность TERT-LTB" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, в которой по меньшей мере часть гена TERT слита со значительной частью субъединицы LTB термолабильного энтеротоксина E. coli. Термин "слитый белок TERT-LTB" относится к полипептиду, кодируемому слитой последовательностью TERT-LTB, как описано. Следует понимать, что термины "слитая последовательность TERT-LTB" и "слитый белок TERT-LTB" также относятся к их фрагментам, их гомологам и их функциональным эквивалентам (совместно обозначаемым как "варианты"), таким как варианты, в которых одна или несколько аминокислот вставлены, удалены или заменены другой аминокислотой(ами). Слитые последовательности TERT-LTB по настоящему изобретению после введения млекопитающему, такому как человек, могут стимулировать иммунный ответ хелперных T-клеток или цитотоксических T-клеток по меньшей мере так же, как последовательность hTERT "дикого типа". В предпочтительных вариантах осуществления изобретения слитая последовательность TERT-LTB может усиливать иммунный ответ по сравнению с hTERT дикого типа.

Термин "лечение" относится к терапевтическому лечению и профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, у кого уже имеется нарушение, а также тех, кто предрасположен к нарушению, или тех, у кого необходимо предупредить нарушение. Как используют в настоящем описании, "лечение" также включает снижение вероятности возникновения нарушения, а также снижение тяжести нарушения у тех, кто уже болен.

"Нарушение" представляет собой любое состояние, которое можно облегчить путем лечения молекулами по настоящему изобретению, включая молекулы нуклеиновой кислоты, описываемые в настоящем документе, и слитые белки, кодируемые указанными молекулами нуклеиновой кислоты. В термин "нарушение" включены хронические и острые нарушения или заболевания, включая патологические состояния, которые вызывают у млекопитающего предрасположение к рассматриваемому нарушению. Молекулы по настоящему изобретению предназначены для использования в качестве лекарственных средств для нарушений или патологических состояний, характеризуемых нарушенной клеточной пролиферацией, включая, но не ограничиваясь перечисленным, рак молочной железы, колоректальный рак и рак легких.

Термин "эффективное количество" обозначает, что введено достаточное количество композиции вакцины для продуцирования достаточных уровней полипептида так, чтобы в результате получить иммунный ответ. Специалисту в данной области понятно, что такой уровень может изменяться.

"Консервативная аминокислотная замена" относится к замене одного аминокислотного остатка другим, химически сходным, аминокислотным остатком. Примеры таких консервативных замен представляют собой: замену одного гидрофобного остатка (изолейцин, лейцин, валин или метионин) другим; замену одного полярного остатка другим полярным остатком того же заряда (например, аргинин лизином; глутаминовая кислота аспарагиновой кислотой).

"hTERT" относится к антигену теломеразной обратной транскриптазы человека или нуклеотидам, кодирующим антиген теломеразной обратной транскриптазы человека. "hTERTopt" относится к нуклеотидной последовательности с оптимизированными кодонами, кодирующей антиген теломеразной обратной транскриптазы человека.

"По существу сходная" означает, что данная нуклеиновая кислота или аминокислотная последовательность идентична по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% эталонной последовательности. В настоящем изобретении, как следует из контекста текста, эталонная последовательность может представлять собой подходящие части нуклеотидной или аминокислотной последовательности TERT человека дикого типа, как приведено в SEQ ID NO:11 и 12, соответственно, или нуклеотидной или аминокислотной последовательности LTB, как приведено в SEQ ID NO:13 (оптимизированная последовательность) и 14. Эталонная последовательность также может представлять собой, например, последовательность TERT дикого типа макака-резус или мыши. Таким образом, последовательность белка TERT, которая "по существу сходна" c белком дикого типа TERT человека или его фрагментом, по меньшей мере на 75% идентична эталонному фрагменту TERT дикого типа человека по длине фрагмента, предпочтительно на 85%, более предпочтительно на 90% и еще более предпочтительно на 95%. Является ли данная аминокислотная последовательность или нуклеотидная последовательность mTERT, hTERT или LTB "по существу сходной" с эталонной последовательностью, можно определить, например, путем сравнения информации последовательностей с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей, такого как компьютерная программа GAP, версии 6.0, доступная от University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). В программе GAP используют способ выравнивания Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970) с изменениями Smith и Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1981).

"Значительная часть" гена, его варианта, фрагмента или субъединицы означает часть, которая составляет по меньшей мере 50%, предпочтительно 75%, более предпочтительно 90% и еще более предпочтительно 95% эталонной последовательности.

"Ген" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность которой кодирует молекулу полипептида. Гены могут представлять собой непрерывные нуклеотидные последовательности или они могут включать такие вставочные сегменты, как интроны, промоторные области, сайты сплайсинга и повторяющиеся последовательности. Ген может представлять собой РНК или ДНК. Предпочтительный ген представляет собой ген, кодирующий полипептид по изобретению.

Термин "нуклеиновая кислота" или "молекула нуклеиновой кислоты" относится к рибонуклеиновой кислоте (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК), зондам, олигонуклеотидам, их фрагментам или частям и праймерам.

"TERT дикого типа" или "белок дикого типа" или "белок д.т." относится к белку, содержащему природную последовательность аминокислот, или его варианту. Аминокислотная последовательность дикого типа TERT человека приведена в SEQ ID NO:12. Аминокислотная последовательность дикого типа TERT человека описана ранее (патент США №6166178; патент США 6261836; патент США №6927285; патентная заявка США 2003-0096344; Meyerson et al, Cell 90: 785-95 (1997); Nakamura et al, Science 277: 955-59 (1997)).

"Ген TERT дикого типа" относится к гену, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую природный белок TERT, включая белки человеческого происхождения или белки, полученные из другого организма, включая, но не ограничиваясь перечисленным, другие млекопитающие, такие как крыса, мышь и макак-резус. Нуклеотидная последовательность гена TERT человека доступна в данной области (выше).

Обозначение "TERT(AI)" относится к последовательности теломеразной обратной транскриптазы, которая содержит мутации, устраняющие или уменьшающие теломеразную каталитическую активность.

Термин "млекопитающее" относится к любому млекопитающему, включая человека.

Аббревиатура "Ag" означает антиген.

Аббревиатура "ORF" означает открытую рамку считывания гена.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 приведены нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) иллюстративной слитой последовательности TPA-hTERT(AI)-LTBopt.

На фиг.2 приведена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4) иллюстративной слитой последовательности TPA-mTERT(AI)-LTBopt.

На фиг.3 приведены результаты анализа ELIspot IFNγ у мышей BALB/c, вакцинированных повторными инъекциями плазмиды pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt. В каждой группе 5 мышей использовали для мониторинга иммунного ответа, направленного против mTERT или LTB, с использованием пулов пептидов. Нанесенные на диаграмму данные получены у 6 разных мышей (незакрашенная окружность). Указаны значения геометрических средних (закрашенные окружности). У мышей, обработанных препаратом отрицательного контроля, T-клеточного ответа на mTERT не выявлено (не показано). См. пример 7.

На фиг.4 приведены результаты внутриклеточного окрашивания на IFNγ в спленоцитах вакцинированных мышей BALB/c. CD4⁺ и CD8⁺ T-клеточный ответ на мышиный TERT измеряли с использованием пулов перекрывающихся пептидов, которые покрывают весь белок. Также мониторингу подвергали иммунный ответ на LTB. Нанесенные на диаграмму данные получены у 6 разных мышей (закрашенные треугольники). Указаны значения геометрических средних (прямая линия). У мышей, обработанных препаратом отрицательного контроля, T-клеточного ответа на TERT не выявлено (не показано). См. пример 7.

На фиг.5 приведены результаты высвобождения ⁵¹Cr при CTL цитолизе эффекторными T-клетками клеток-мишеней 4T1, импульсно меченных специфичным для CD8⁺ T-клеток пептидом mTERTaa167 (AYQVCGSPL; SEQ ID NO:20). Эффекторные клетки получены из спленоцитов двух иммунизированных мышей BALB/c, и их повторно стимулировали in vitro специфичным пептидом. Результаты представлены в виде процента специфического цитолиза при различных соотношениях эффектор/мишень. См. пример 8.

На фиг.6 показана индукция иммунного ответа на TERT мыши. Мышей C57BL/6 иммунизировали 5 еженедельными инъекциями плазмиды pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt. Иммунный ответ оценивали по спленоцитам мышей анализом ELIspot IFNγ с использованием пулов пептидов TERT мыши. Ответ антигенспецифических CD4⁺ и CD8⁺ T-клеток приведен в виде значений геометрических средних 6 иммунизированных мышей, также приведено стандартное отклонение. См. пример 7.

На фиг.7 показана индукция специфического иммунного ответа на mTERT у мышей BALB/c. Мышей иммунизировали 5 еженедельными инъекциями конструкций pV1J-mTERT(AI)opt или pV1J-TPAmTERT(AI)-LTBopt. Иммунный ответ определяли путем внутриклеточного окрашивания на IFNγ в PBMC с использованием CD8⁺ эпитопа, соответствующего пептидной последовательности mTERTaa167 (AYQVCGSPL; SEQ ID NO:20). Нанесенные на диаграмму данные получены у 8 разных мышей (закрашенные треугольники). Приведены значения геометрических средних (прямые линии).

На фиг.8 показано, что при инъекции аденовирусных векторов, экспрессирующих mTERT(AI)-LTBopt, усиливается специфический иммунный ответ на TERT. Группы из 10 мышей BALB/c подвергали 5 еженедельным инъекциям pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt (50 мкг/инъекцию). Через две недели после последней инъекции плазмидной ДНК мышей повторно стимулировали одной дополнительной инъекцией плазмидной ДНК (ДНК-ЭП) или 10¹⁰ в.ч. Ad6/TPA-mTERT(AI)-LTBopt (Ad). Иммунный ответ на TERT подвергали мониторингу посредством ICS на IFNγ в PBMC. Нанесенные на диаграмму данные получены у 10 разных мышей (закрашенные ромбы). Также приведены значения геометрических средних каждой группы (прямые линии). См. пример 10.

На фиг.9 приведен протокол, используемый для анализа индуцированного DMH канцерогенеза и вакцинации у мышей BALB/c. DMH вводили в/в еженедельно. Вакцинацию pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt проводили в указанные моменты времени. Анализ кишечных очагов проводили на 12 неделе. См. пример 11.

На фиг.10 показано противоопухолевое действие pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt при индуцированном DMH канцерогенезе. Мышей BALB/c обрабатывали DMH и проводили ДНК-ЭП, как указано на фигуре 9. Анализ ACF и образования аденомы в кишечнике проводили на 12 неделе от начала обработки. Количество ACF и очагов аденомы у вакцинированных мышей сравнивали с количеством ACF и очагов аденомы, выявленным у невакцинированных контрольных животных. См. пример 11.

На фиг.11 приведен протокол, используемый для анализа индуцированного DMH канцерогенеза и вакцинации у мышей BALB/c. DMH вводили в/в еженедельно. Вакцинацию посредством ДНК и Ad, содержащих pV1J/TPA-mTERT-LTB, проводили в указанные моменты времени. Анализ кишечных очагов проводили на 12 неделе. См. пример 11.

На фиг.12 показано противоопухолевое действие примирования ДНК/повторного стимулирующего введения Ad, содержащих pV1J/TPA-mTERT(AI)-LTBopt, на количество опухолевых очагов. Мышей BALB/c обрабатывали DMH и проводили ДНК-ЭП, как указано на фигуре 9. Анализ ACF и образования аденомы в кишечнике проводили на 30 неделе от начала обработки. Количество ACF и очагов аденомы у вакцинированных мышей сравнивали с количеством ACF и очагов аденомы, выявленным у невакцинированных контрольных животных. См. пример 11.

На фиг.13 показано противоопухолевое действие примирования ДНК/повторного стимулирующего введения Ad, содержащих pV1J/TPA-mTERT-LTB(AI)opt, на объем и стадию дифференцировки опухолевых очагов. Мышей BALB/c обрабатывали DMH и проводили ДНК-ЭП, как указано. Объем (панель A) и стадию гистологической дифференцировки (панель B) аденом кишечника, присутствующих у вакцинированных и контрольных мышей, анализировали через 30 недель после начала обработки. Опухоли классифицировали следующим образом: G1: хорошо дифференцированная аденокарцинома; G2: умеренно дифференцированная аденокарцинома; G3: плохо дифференцированная аденокарцинома. См. пример 11.

На фиг.14 показана индукция иммунного ответа на TERT человека. Трансгенных мышей HHD иммунизировали двумя инъекциями с двухнедельным интервалом (ДНК-ДНК) плазмиды pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt или одной инъекцией плазмиды pV1J/TPA-hTERT(AI)-LTBopt, с последующей одной инъекцией Ad6hTERT(AI) 10¹⁰ в.ч. (ДНК/Ad) через две недели. Иммунный ответ оценивали в PBMC мыши анализом ICS на IFNγ. PBMC мышей инкубировали c CD8 иммунодоминантным для аллеля HLA-A2 пептидом hTERT865 (SEQ ID No:22). Нанесенные на диаграмму данные получены у 10 разных мышей (закрашенные треугольники). Приведены значения геометрических средних (прямая линия). См. примеры 12 и 13.

На фиг.15 приведены результаты CTL анализа меченных Cr⁵¹ клеток-мишеней HeLa-HHD. CD8⁺ T-клетки, полученные у одной иммунизированной мыши, тестировали в анализе CTL против клеток HeLa-HHD, экзогенно нагруженных пептидом hTERT865 или без пептида, но в присутствии ДМСО, используемого для разведения пептида. Клетки HeLa-HHD также инфицировали вектором Ad, кодирующим hTERT, или Ad, кодирующим GFP, в качестве контроля. См. пример 14.

На фиг.16 показана индукция клеточного иммунного ответа на hTERT у макак-резус, иммунизированных посредством ДНК-ЭП. Анализ ELIspot проводили на PBMC от иммунизированных hTERT макак-резус (pV1J/TPA-hTERT-LTB; ДНК-ЭП/ДНК-ЭП). Анализ проводили в двух повторах и приведено среднее значение из этих повторов. Показан анализ, проведенный после второй ДНК-ЭП (панель A). Также показан анализ, проведенный после пятой ДНК-ЭП (панель B). См. пример 15.

На фиг.17 показано, что у макак-резус, которых вакцинировали ДНК-ЭП и повторно стимулировали аденовирусом, экспрессирующим hTERT, по сравнению с CMI, вызываемым у макак, вакцинированных только ДНК-ЭП, усилен клеточный иммунный ответ на hTERT. ELIspot проводили на PBMC от иммунизированных hTERT макак-резус в конце программы иммунизации, которая включала пять инъекций ДНК-ЭП (pV1J/TPA-hTERT-LTB) с последующими двумя инъекциями Ad (Ad6-hTERT). Анализ проводили в двух повторах и показаны средние значения из этих повторов. См. пример 15.

Подробное описание изобретения

Экспрессию каталитического компонента теломеразы, известной как теломеразная обратная транскриптаза (TERT), как правило, можно обнаружить в широком диапазоне типов опухолей. Сочетание сверхэкспрессии теломеразы в большинстве типов опухолей, а также низкой или отсутствующей экспрессии в нормальных клетках, делает TERT мишенью для терапии и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с нарушенной клеточной пролиферацией, такой как злокачественная опухоль. В связи с этим настоящее изобретение относится к композициям и способам индукции или усиления иммунного ответа к белковым продуктам, экспрессируемым в виде опухолеспецифического антигена TERT, где нарушенная экспрессия TERT связана с карциномой или ее развитием. Ассоциация нарушенной экспрессии TERT с карциномой не требует экспрессии белка TERT в опухолевой ткани в каждый момент времени ее развития, так как аномальная экспрессия TERT может иметь место во время инициации опухоли и не выявляться позже при прогрессировании опухоли и наоборот.

Таким образом, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, векторам, клеткам-хозяевам и кодируемым белкам, содержащим последовательность TERT или ее вариант, для применения в вакцинах и фармацевтических композициях для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли. Полинуклеотиды по настоящему изобретению содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TERT или его вариант, слитую с нуклеотидной последовательностью, кодирующей субъединицу B термолабильного энтеротоксина (LTB) E. coli, которая способна эффективно оказывать адъювантное действие на иммунный ответ на ассоциированный антиген TERT.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидные последовательности, описываемые в настоящем документе, перед кодирующей последовательностью гена TERT дополнительно содержат лидерную последовательность TPA для гарантии секреции слитого белка TERT-LTB. В предпочтительных вариантах осуществления этого аспекта изобретения слитая последовательность TPA-hTERT(AI)-LTB кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2. Предпочтительная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:1. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления слитая последовательность TPA-mTERT(AI)-LTB кодирует аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:4. Предпочтительная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:3.

Нуклеотидные последовательности TERT по настоящему изобретению могут быть человеческого происхождения или могут представлять собой гомолог TERT других видов, например мыши. Нуклеотидная последовательность TERT дикого типа человека приведена в SEQ ID NO:12 и была опубликована ранее (см., например, патент США №6166178; патент США 6261836; патент США №6927285; патентная заявка США 2003-0096344; Meyerson et al, Cell 90:785-95 (1997); Nakamura et al, Science 277:955-59 (1997)). Часть TERT слитой последовательности TERT может быть полноразмерной или представлять собой любой вариант, достаточный для индукции специфичного для TERT T-клеточного иммунного ответа у млекопитающего. Варианты TERT по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются перечисленным, последовательности, которые укорочены на C- или N-конце, последовательности с консервативными заменами и последовательности с внутренними делециями или вставками. Предпочтительные варианты TERT по настоящему изобретению содержат мутации, которые функционально устраняют теломеразную каталитическую активность. Кодируемые слитые белки TERT по настоящему изобретению при введении реципиенту вакцины или нуждающемуся в этом пациенту способны индуцировать клеточный иммунный ответ.

Как указано выше, в предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения теломеразная каталитическая активность антигена теломеразы инактивирована (в настоящем документе обозначено "TERT(AI)"), так что кодируемый слитый белок TERT для целей вакцинации является более безопасным, чем TERT дикого типа. Ферментативную активность слитого белка TERT можно инактивировать путем введения мутаций/делеций в кодирующую нуклеотидную последовательность TERT. Таким образом