Способ получения сиалилированных олигосахаридов
Патент 2473695
Авторы
Правообладатели
Классы МПК
Способ получения сиалилированных олигосахаридов
Иллюстрации
Изобретение относится к области микробиологии и молекулярной биологии. Предложен способ крупномасштабного синтеза in vivo сиалилированных олигосахаридов и микроорганизм, содержащий гетерологичные гены, кодирующие GlcNAc-синтетазу, синтазу сиаловой кислоты, GlcNAc-6-фосфат-2-эпимеразу и сиалилтрансферазу, при этом эндогенные гены, кодирующие альдолазу сиаловой кислоты (NanA) и ManNac-киназу (NanK) были делегированы или инактивированы. Изобретение может быть использовано в технологиях промышленного синтеза сиалилгалактозы. 4 н. и 50 з.п. ф-лы, 4 табл., 20 ил., 17 пр.
Реферат
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу крупномасштабного синтеза in vivo сиалилированных олигосахаридов, к культивированию микроорганизмов в культуральной среде, возможно содержащей экзогенный предшественник, такой как лактоза, причем указанный микроорганизм содержит гетерологичные гены, кодирующие CMP-Neu5Ac-синтетазу, синтазу сиаловой кислоты, GlcNAc-6-фосфат-2-эпимеразу и сиалилтрансферазу, и при этом эндогенные гены, кодирующие альдолазу сиаловой кислоты (NanA) и ManNac-киназу (NanK), были делегированы или инактивированы. Изобретение относится также к этому микроорганизму, который способен продуцировать внутренне активированную сиаловую кислоту.
Предшествующий уровень техники
N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac) - это наиболее типичный представитель аминосахаров семейства сиаловых кислот. Neu5Ac часто оказывается оконечным сахаром в комплексе углеводов клеточной поверхности и играет главную роль во многих биологических процессах, таких как адгезия клеток и связывание токсинов и вирусов (Varki, 1993). Neu5Ac является также главным компонентом углеводной части ганглиозидов, которые заметно избыточны в ткани мозга и участвуют в развитии нескольких патологических процессов (Zhang and Kiechle, 2004).
В связи с их важными биологическими функциями содержащие сиаловые кислоты олигосахариды вызывали значительный интерес, и для синтеза этих структур в целях фундаментальных исследований и возможных терапевтических применений были разработаны многие методы. Однако до сих пор крупномасштабное производство сиалилированных олигосахаридов не удавалось осуществить.
Методы химического синтеза нецелесообразны из-за необходимости вводить много этапов защиты и снятия защиты, поэтому много усилий было приложено к разработке ферментативных и биотехнологических методов. Сиалилтрансферазы в качестве активированных сахаро-нуклеотидов используют CMP-Neu5Ac, и разработка эффективных процессов ферментативного синтеза сиалилоолигосахаридов стала возможной благодаря идентификации бактериальных генов сиалилтрансферазы, которые хорошо экспрессируются в E. coli, и конструированию систем со многими ферментами, которые имитируют природный путь биосинтеза сахаро-нуклеотидов (Gilbert et al., 1998).
Позднее значительный успех был достигнут благодаря использованию живых бактериальных клеток для получения сиалилоолигосахаридов (Priem et al, 2002). В этом подходе сиалиллактоза непосредственно продуцировалась растущими клетками метаболически сконструированных штаммов Escherichia coli, сверхэкспрессирующими гены для α-2,3-сиалилтрансферазы Neisseria meningitidis и CMP-Neu5Ac-синтазы. Бактерии выращивали до высокой плотности клеток с глицерином в качестве источника углерода и энергии, тогда как в качестве предшественников в синтезе сиалиллактозы добавляли экзогенные лактозу и Neu5Ac. В ходе роста лактоза и Neu5Ac активно интернализались клетками с помощью пермеаз β-галактозида и Neu5Ac Е. coli. Чтобы предотвратить катаболизм лактозы и Neu5Ac, использовали мутантные штаммы, лишенные активности β-галактозидазы и Neu5Ac-aльдoлaзы. Лактоза и Neu5Ac накапливались в цитоплазме, где Neu5Ac затем превращалась в CMP-Neu5Ac, чтобы быть далее перенесенной на лактозу с образованием сиалиллактозы (Европейский патент заявителей ЕР 1194584). Эта система была применена для продукции углеводной части ганглиозидов GM2 и GM1 путем дополнительной экспрессии соответствующих генов гликозилтрансферазы (Antoine et al., 2003). Полисиалилированные олигосахариды (сахара GD3 и GT3) также были получены этим методом и с использованием гена Campylobacter cstll, кодирующего бифункциональную α-2,3- и α-2,8-сиалилтрансферазу (заявка авторов US 60/690 837 и Antoine et al., 2005).
Для крупномасштабной продукции сиалилоолигосахаридов с помощью этого микробиологического метода требуются большие количества сиаловой кислоты в качестве предшественника. Сиаловую кислоту можно очистить из природных источников, таких как молоко и яичный желток, но ее выходы низки и процедура непригодна для крупномасштабного производства. Сиаловую кислоту в основном получают ферментативным синтезом с помощью альдолазы сиаловой кислоты, используя N-ацетилманнозамин (ManNAc) и пируват в качестве субстрата. Чтобы снизить стоимость, ManNAc обычно получают химической или ферментативной эпимеризацией N-ацетилманнозамина, который является более дешевым субстратом, чем ManNAc (Lee et al., 2004; Maru et al., 1998). Несмотря на эти усовершенствования, стоимость сиаловой кислоты остается относительно высокой, и эта стоимость тормозит разработку экономичной системы для продукции сиалоолигосахаридов.
Кроме того, штаммы, подобные Е. coli K1 и N. meningitidis, способны продуцировать CMP-Neu5Ac, но являются патогенными и не могут использоваться в биотехнологических процессах из соображений безопасности. Большинство других бактерий, в том числе Е. coli К12, не имеют ферментативного аппарата для биосинтеза CMP-Neu5Ac, и целью настоящего изобретения является генно-инженерное конструирование непатогенных штаммов, которые были бы способны продуцировать CMP-Neu5Ac из эндогенного UDP-GlcNAc.
В соответствии с настоящим изобретением авторы сконструировали новую микробиологическую систему для экономичного крупномасштабного производства сиалоолигосахаридов без необходимости внесения экзогенной сиаловой кислоты. Метаболически сконструированные микроорганизмы согласно настоящему изобретению жизнеспособны, непатогенны и могут быть использованы в крупномасштабных и промышленных процессах культивирования. Они имеют оптимизированные модифицированные пути биосинтеза и делецию бесполезных метаболических циклов, и это приводит к биосинтезу активированной CMP-Neu5Ac, которая работает как in situ донор сиаловой кислоты с образованием сиалилированных олигосахаридов.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение предоставляет способ продукции сиалилированных олигосахаридов в ходе ферментационного роста микроорганизмов. В частности, изобретение относится к способу синтеза олигосахаридов, содержащих один или несколько остатков сиаловой кислоты, без какого-либо добавления в культуральную среду экзогенной сиаловой кислоты, включающему (но не ограниченному ими):
- олигосахаридные части молекул ганглиозидов, выбранные из GM3 (3'-сиалиллактоза, Neu5Acα-3Galβ-4Glc) и олигосахариды, содержащие мотив GM3
GD3 (Neu5Acα-8Neu5Acα-3Galβ-4Glc)
GT3 (Neu5Acα-8Neu5Acα-8Neu5Acα-3Galβ-4Glc)
GM2 (GalNAcβ-4(Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GM1 (Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GD1a (Neu5Acα-3Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GT1a (Neu5Acα-8Neu5Acα-3Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GD2 (GalNAcβ-4(Neu5Acα-8Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GT2 (GalNAcβ-4(Neu5Acα-8Neu5Acα-8Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GD1b (Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-8Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GT1b (Neu5Acα-3Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-8Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GQ1b (Neu5Acα-8Neu5Acα-3Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-8Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GT1с (Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-8Neu5Acα-8Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GQ1c (Neu5Acα-3Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-8Neu5Acα-8Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GP1c(Neu5Acα-8Neu5Acα-3Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-8Neu5Acα-8Neu5Acα-3)Galβ-4Glc)
GD1a (Neu5Acα-3Galβ-3(Neu5Acα-6)GalNAcβ-4Galβ-4Glc)
Фукозил-GM1 (Fuca-2Galβ-3GalNAcβ-4(Neu5Acα-3)Galβ-4Glc), все из которых могут быть распространены на продукцию соответствующих ганглиозидов путем проведения реакции указанных выше олигосахаридных группировок с церамидом;
- другие сиалилированные сахара, в том числе:
6'-сиалиллактозу (Neu5Acα-6Galβ-4Glc) и олигосахариды, содержащие 6'-сиалиллактозу
гексасахарид SGG (Neu5Acα-3Galβ-3GalNAcβ-3Galα-4Galβ-4Gal)
сиалилированный тетрасахарид (Neu5Acα-3Galβ-4GlcNAcβ-4GlcNAc)
пентасахарид LSTD (Neu5Acα-3Galβ-4GlcNAcβ-3Galβ-4Glc).
В одном конкретном аспекте процесс согласно настоящему изобретению основан на активном захвате экзогенного предшественника, такого как, например, моно-, ди- или трисахарид, более конкретно экзогенного предшественника, выбранного из лактозы, галактозы, β-галактозида и α-галактозида, такого как глоботриоза (Galα-4Galβ-4Glc), в процессе роста клеток на альтернативном углеродном субстрате, таком как глицерин или глюкоза. Подразумевается, что выражение «экзогенный предшественник» обозначает соединение, вовлеченное в путь биосинтеза олигосахарида согласно настоящему изобретению, которое интернализуется клетками (включается внутрь клеток).
Предлагается также метаболически сконструированный микроорганизм, который может специфически продуцировать указанные выше сиалилированные олигосахариды без побочных продуктов, таких как GA1, GA2, СА3, GA4 и GA5, и в котором для специфической продукции GM1 используется ген cstlll, выделенный из штаммов С.jejuni, экспрессирующих липоолигосахаридные структуры, имитирующие ганглиозид GM1, таких как штамм С.jejuni (NCTC, №доступа 11168).
Описание фигур
Фиг.1 показывает продукцию сиалиллактозы метаболически сконструированным штаммом E. coli.
Фиг.2 показывает образование побочных продуктов в ходе продукции сахара GM1 метаболически сконструированными штаммами Е. coli.
Фиг.3 показывает образование побочных продуктов в ходе биосинтеза сахара GM2.
Фиг.4 показывает путь биосинтеза UDP-Gal.
Фиг.5 показывает образование побочных продуктов в ходе биосинтеза сахара GD2.
Фиг.6 показывает стратегию продукции GT1a с использованием сиалилтрансферазы.
Фиг.7 показывает метаболически сконструированный путь продукции сахара LSTD (Neu5Acα-3Galβ-4GlcNacβ-3Galβ-4Glc) из экзогенной лактозы.
Фиг.8 показывает метаболически сконструированный путь продукции гексасахарида SGG (Neu5Acα-3Galβ-3GalNAcβ-3Galα-4Galβ-4Gal) из экзогенной глоботриозы.
Фиг.9 показывает метаболически сконструированный путь продукции сиалилированного тетрасахарида (Neu5Acα-3Galβ-4GlcNAcβ-4GlcNAc).
Фиг.10 представляет результаты анализа с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) внутриклеточной и внеклеточной фракций клеточной культуры с высокой плотностью клеток штамма DC7 с постоянной подпиткой лактозой. Дорожка 1: стандартный раствор лактозы, лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-неогексаозы (LNnH) (2 мг/мл каждой). Дорожки 2, 3, 4, 5, 6 и 7: внутриклеточные фракции, отобранные через 0, 7, 23, 31, 47 и 54 ч после добавления лактозы. Дорожки 8, 9, 10, 11, 12 и 13: внеклеточные фракции, отобранные через 0, 7, 23, 31, 47 и 54 ч после добавления лактозы. Ранее было показано, что сиалиллактоза (2) движется так же, как тетрасахарид LNnT.
Фиг.11 показывает продукцию сиалиллактозы в клеточной культуре высокой плотности штамма DC7 с постоянной подпиткой лактозой. суммарное количество добавленной лактозы; (□) внутриклеточная сиалиллактоза; (■) внеклеточная сиалиллактоза; (-) рост бактерий.
Фиг.12 представляет результаты анализа с помощью ТСХ олигосахаридов, продуцируемых клеточной культурой с высокой плотностью клеток штамма NF03, содержащего плазмиды pUC18-cstll и pBBR3-SS. Начальная концентрация лактозы была равна 3 г/л. Дорожка 1: стандартный раствор лактозы, лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-неогексаозы (LNnH) (2 мг/мл каждой). Дорожки 2 и 3: внутриклеточные фракции, отобранные через 7 и 24 ч после добавления лактозы. Дорожки 4 и 5: внеклеточные фракции, отобранные через 7 и 24 ч после добавления лактозы.
Фиг.13 представляет результаты анализа с помощью ТСХ олигосахаридов, продуцируемых клеточной культурой с высокой плотностью клеток штамма DC15 (pBS-cgtAll-nst, pBBR3-SS-wbpP, pSU-cgtB). Начальная концентрация лактозы составляла 5 г/л. Дорожка 1: стандартный раствор лактозы, лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-неогексаозы (LNnH) (2 мг/мл каждой). Дорожки 2, 3, 4, 5: внутриклеточные фракции, отобранные через 7, 20, 30 и 44 ч после добавления лактозы. Дорожки 6, 7, 8, 9: внеклеточные фракции, отобранные через 7, 20, 30 и 44 ч после добавления лактозы. Сиалиллактоза (1) и сахар GM1 (3) движутся как соответственно LNnT и LNnH.
Фиг.14 представляет результаты анализа с помощью ТСХ олигосахаридов, продуцируемых клеточной культурой с высокой плотностью клеток штамма DC21 (pBS-cgtAll-nst, pBBR3-SS-gne, pSU-cgtB). Начальная концентрация лактозы составляла 5 г/л. Дорожки 1 и 10: стандартный раствор лактозы, лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-неогексаозы (LNnH) (2 мг/мл каждой). Дорожки 2, 3, 4, 5: внутриклеточные фракции, отобранные через 5, 20, 28 и 44 ч после добавления лактозы. Дорожки 6, 7, 8, 9: внеклеточные фракции, отобранные через 5, 20, 28 и 44 ч после добавления лактозы. Сиалиллактоза (1) и сахар GM1 (3) движутся как соответственно LNnT и LNnH.
Фиг.15 представляет результаты анализа с помощью ТСХ олигосахаридов, продуцируемых клеточной культурой с высокой плотностью клеток штамма DC22 (pBS-cstlll-cgtAll, pBBR3-SS-gne, pSU-cgtB). Начальная концентрация лактозы составляла 5 г/л. Дорожки 1 и 10: стандартный раствор лактозы, лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-неогексаозы (LNnH) (2 мг/мл каждой). Дорожки 2, 3, 4, 5: внутриклеточные фракции, отобранные через 7, 20, 30 и 44 ч после добавления лактозы. Дорожки 6, 7, 8, 9: внеклеточные фракции, отобранные через 7, 20, 30 и 44 ч после добавления лактозы. Сиалиллактоза (1) и сахар GM1 (3) движутся как соответственно LNnT и LNnH.
Фиг.16 представляет результаты анализа с помощью ТСХ олигосахаридов, продуцируемых клеточной культурой с высокой плотностью клеток штамма ZWT (ZLKA, pBS-nst, pBBRS-SS-gne, pWKS-cgtAll). Начальная концентрация лактозы составляла 5 г/л. Дорожка 1: стандартный раствор лактозы, лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-неогексаозы (LNnH) (2 мг/мл каждой). Дорожки 2, 3, 4: внутриклеточные фракции, отобранные через 0, 7 и 22 ч после добавления лактозы. Дорожки 5, 6, 7: внеклеточные фракции, отобранные через 0, 7 и 22 ч после добавления лактозы.
Фиг.17 представляет результаты анализа с помощью ТСХ олигосахаридов, продуцируемых клеточной культурой высокой плотности штамма ZWU2 (ZWU, pBS-nst, pBBRS-SS-gne, pWKS-cgtAll). Начальная концентрация лактозы составляла 5 г/л. Дорожка 1: стандартный раствор лактозы, лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-неотетраозы (LNnH) (2 мг/мл каждой). Дорожки 2, 3, 4 и 5:
внутриклеточные фракции, отобранные через 0, 7, 22 и 30 ч после добавления лактозы. Дорожки 6, 7, 8 и 9: внеклеточные фракции, отобранные через 0, 7, 22 и 30 ч после добавления лактозы.
Фиг.18 показывает спектр масс (масс-спектрометрия с электрораспылением) компонента фракции (2), очищенного из внутриклеточной фракции контрольного штамма ZWT (А) и мутантного по galU штамма ZWU2 (Б). Пик при m/z=835 соответствует сахару GM2, а пик при m/z=794 соответствует галактозилированному аналогу (сахар GA2).
Фиг.19 представляет результаты анализа с помощью ТСХ фракций, полученных после разделения внутриклеточной фракции из культуры объемом 1 л штамма ZWU1. Разделение проводили на смоле Dowex 1 (в форме HCO3 -) при градиенте NaHCO3 0-1 М. Объем каждой пробирки составлял 10 мл. Выход фракций А, Б, В и Г был равен соответственно 0,5 г, 0,85 г, 0,6 г и 1,2 г.
Фиг.20 представляет результаты анализа с помощью ТСХ олигосахаридов, продуцируемых клеточной культурой высокой плотности штамма NF17 (ZLKA, pBS-cgtA-cstll, pSU-cgtB, pBBR-SS-gne). Начальная концентрация лактозы составляла 5 г/л. Дорожки 1 и 10: стандартный раствор лактозы, лакто-N-неотетраозы (LNnT), лакто-N-неогексаозы (LNnH) (2 мг/мл каждой). Дорожки 2, 3, 4 и 5: внутриклеточные фракции, отобранные через 7, 22, 30 и 46 ч после добавления лактозы. Дорожки 6, 7, 8 и 9: внеклеточные фракции, отобранные через 7, 22, 30 и 46 ч после добавления лактозы.
Описание происхождения генетического материала
| Таблица 1 | ||
| Использованные в настоящем изобретении гены, плазмиды и штаммы Escherichia coli | ||
| Описание | Ссылка или источник | |
| Гены | ||
| nst | α-2,3-сиалилтрансфераза из штамма МС58 N. meningitidis L3 | U60660 |
| neuА | CMP-NeU5Aс-синтетаза из C.jejuni, штамм АТСС 43438 | AF400048 |
| neuВ | Синтаза сиаловой кислоты из C.jejuni, штамм АТСС 43438 | AF400048 |
| neuС | Glc-6-фосфат-2-эпимераза из C.jejuni, штамм АТСС 43438 | AF400048 |
| ctgA | β-4-GlcNАс-трансфераза из С.jejuni O:19, штамм ОН4384 | AF130984 |
| wbpP | UDP-GlcNAc-C4-эпимераза из Р. aeruginosa | AF035937 |
| gne(Cj1131c) | UDP-GlcNAc-С4-эпимераза из С.jejuni O:2, штамм NCTC11168 | AL139077 |
| cstlll (Cj1140) | α-2,3-сиалилтрансфераза из С.jejuni O:2, штамм NCTC11168 | AL139077 |
| cgtAll | β-4-GlcNAc-трансфераза из С.jejuni O:36, штамм АТСС 43456 | AF401528 |
| cgtB (Cj1139c) | β-3-Gal-трансфераза из С.jejuni O:2, штамм NCTC 11168 | AL139077 |
| cstll | α-2,3-, α-2,8-сиалилтрансфераза из С.jejuni, штамм АТСС 43438 | AF400048 |
| nodC | N-ацетилглюкозаминилтрансфераза из Azorhizobium caulinodans | ААВ51164 |
| IgtB | β-1,4-галактозилтрансфераза из Neisseria meningitidis | ААС44085 |
| chtA | хитиназа из Bacillus circulans | ААА81528 |
| Плазмиды | ||
| pWKS130 | Клонирующий вектор, Kmr, промотор Plac, низкое число копий, репликон р8С101 | (Wang and Kushner, 1991) |
| PSU27-18 | Полученный из pACYC184 клонирующий вектор, Cm', промотор Plac | (Martinez et al., 1988) |
| pBAD33 | Полученный из pACYC184 клонирующий вектор, Cmr, промотор Para | (Guzman et al., 1995) |
| pBS-nst | Производная плазмиды pBluescript II SK, несущая nst (первоначально называвшаяся NST-01) | (Priem et al., 2002) |
| pBBR-IMCS-3 | Клонирующий вектор, Tcr, промотор Plac, низкое число копий | (Kovach et al., 1995) |
| pBBR3-SS | Производная pBBR1MCS-3, несущая neuАВС | данное изобретение |
| pBBR3-SS-wbpP | Производная pBBR1MCS-3, несущая neuАВС и wbpP | данное изобретение |
| pBBR3-SS-gne | Производная pBBR1MCS-3, несущая neuАВС и gne | данное изобретение |
| pUC-cstll | Производная pUC18, несущая cstll | данное изобретение |
| pBS-cgtAll-nst | Производная pBluescript II SK, несущая cgtAll и nst | данное изобретение |
| pBS-cgtA-cstll | Производная pBluescript II KS, несущая cgtA и cstll | данное изобретение |
| pSU18-cgtB | Производная pSU27 18, несущая cgtB | данное изобретение |
| pBS-cstlll-cgtAll | Производная pBluescript II KS, несущая cstlll и cgtAll | данное изобретение |
| pWKS-cgtAll | Производная pWKS130, несущая cgtAll | данное изобретение |
| pBAD33-cgtAll | Производная pBAD33, несущая cgtAll | данное изобретение |
| pWKS-lgtB-chiA | Производная pWKS130, несущая nst и ген хитиназы chiA | (Dumon et al., 2005) |
| pBS-nst-nodC | Производная pBluescript II SK, несущая nodC и nst из A. caulinodans | данное изобретение |
| pBS-cstll-cgtB | Производная pBluescript II SK, несущая cstll и cgtB | данное изобретение |
| Штаммы | ||
| DC | DH1 lacZ lacA | (Dumon et al., 2005) |
| GLK | DH1 lacZ lacA galK | (Dumon et al., 2005) |
| ZLKA | DC ΔnanKETA | данное изобретение |
| AZL | DC nanA | данное изобретение |
| AZK | DC ΔnanK nanA | данное изобретение |
| ZWU | ZLKA galU | данное изобретение |
| GLKA | GLK ΔnanKETA | данное изобретение |
| ZW | ZLKA melA wcaJ | данное изобретение |
| DC6 | DC (pBS-nst, pBBR3-SS) | данное изобретение |
| AW1 | AZL (pBS-nst, pBBR3-SS) | данное изобретение |
| DC7 | ZLKA (pBS-nst, pBBR3-SS) | данное изобретение |
| DC7 | ZLKA (pBS-nst, pBBR3-SS) | данное изобретение |
| DC0 | ZLKA (pBS-nst) | данное изобретение |
| AZK1 | AZK (pBS-nst, pBBR3-SS) | данное изобретение |
| NFS | ZLKA (pUC-cstll, pBBR3-SS) | данное изобретение |
| DC15 | ZLKA (pBS-cgtAll-nst, pBBR3-SS-wbpP, pSU-cgtB) | данное изобретение |
| DC21 | ZLKA (pBS-cgtAll-nst, pBBR3-SS-gne, pSU-cgtB) | данное изобретение |
| DC22 | ZLKA (pBS-cstlll-cgtAll, pBBR3-SS-gne, pSU-cgtB) | данное изобретение |
| ZWT | ZLKA (pBS-nst, pBBR-SS-gne, pWKS-cgtAll) | данное изобретение |
| ZWU2 | ZWU (pBS-nst, pBBR-SS-gne, pWKS-cgtAll) | данное изобретение |
| NF08 | ZLKA(pUC18-cstll, pBBR3-SS-gne, pWKS-cgtAll) | данное изобретение |
| NF09 | ZLKA(pUC18-cstll, pBBR3-SS-gne, pBAD33-cgtAll) | данное изобретение |
| ZWU1 | ZWU (pUC18-cstll, pBBR3-SS-gne, pBAD33-cgtAll) | данное изобретение |
| NF17 | ZLKA(pBS-cgtA-cstll, pSU-cgtB, pBBR-SS-gne) | данное изобретение |
| GLK7 | GLKA (pBS-nst, pBBR3-SS) | данное изобретение |
| SN4 | ZLKA (pBS-nst-nodC, pBBR3-SS, pWKS-lgtB-chiA) | данное изобретение |
| NF21 | ZLKA(pBS-cstll-cgtB, pBBR3-SS-gne, pBAD33-cgtAll) | данное изобретение |
Детальное описание изобретения
В первом варианте осуществления изобретение относится к способу продукции олигосахаридов, содержащих по меньшей мере один остаток сиаловой кислоты, которые здесь названы сиалилированными олигосахаридами, при этом способ включает этап, состоящий в культивировании микроорганизма в культуральной среде, возможно содержащей экзогенный предшественник, причем указанный микроорганизм способен продуцировать внутренне активированную сиаловую кислоту и содержит гетерологичные гены, кодирующие CMP-Neu5Ac-синтетазу, синтазу сиаловой кислоты, GlcNAc-6-фосфат-2-эпимеразу и сиалилтрансферазу, и при этом эндогенные гены, кодирующие альдолазу сиаловой кислоты (NanA) и ManNac-киназу (NanK), были делегированы или инактивированы.
В указанном выше способе и в зависимости от конечного пункта, гетерологичный ген сиалилтрансферазы может быть выбран из генов для α-2,3-сиалилтрансферазы (например, кодируемой nst), α-2,3-, α-2,8-сиалилтрансферазы (cstll) и α-2,3-сиалилтрансферазы (cstlll) или α-2,6-сиалилтрансферазы. Геном для гетерологичной CMP-Neu5F-синтетазы может быть neuА, геном гетерологичной синтазы сиаловой кислоты может быть neuВ, а геном гетерологичной GlcNAc-6-фосфат-2-эпимеразы может быть neuС. Гены neuА, neuВ и neuС могут быть выделены из бактериальных штаммов, имеющих в своей клеточной оболочке сиалилированную структуру, таких как С.jejuni из коллекции АТСС, № доступа 43438.
Гены лап Т, nanА, nanК и nanЕ являются частями одного и того же оперона, который регулируется связывающимся с ДНК белком NanR и индуцируется Neu5Ac (Kalivoda et al., 2003). Поэтому микроорганизмы согласно настоящему изобретению могут быть также nanКЕАT-. Таким образом, продукция Neu5Ac как промежуточного соединения в ходе синтеза CMP-Neu5Ac генетически сконструированным штаммом, сверхэкспрессирующим гены neuВСА, может индуцировать путь катаболизма сиаловой кислоты и создать два ненужных цикла, которые будут снижать продуктивность биосинтеза бактерией CMP-Neu5Ac. Первый бесполезный цикл может быть результатом объединения активностей синтазы сиаловой кислоты NeuB и альдолазы сиаловой кислоты NanA. Второй бесполезный цикл может быть результатом совместного действия UDP-GlcNAc-2-эпимеразы NeuC, 4 ферментов: NanK, NanE, NanA и GlmM, - и GlmU, который катализирует образование UDP-GlcNAc из ManNAc. Согласно предлагаемому здесь способу предотвращается разрушение Neu5Ac и ManNAc. Это может быть сделано выгодным образом путем разрушения генов nanА и nanК в штаммах, которые будут использованы в продукции сиалилоолигосахаридов. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения гены nanТ, nanА, nanК и nanЕ делегированы или инактивированы. Это можно осуществить, например, удалением всего оперона.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный выше микроорганизм кодирует белок, который способствует захвату клетками лактозы, и не содержит ферментов, метаболизирующих лактозу. Например, у Е. coli клетки предпочтительно являются LacZ- (β-галактозид-пермеаза), LacZ- (β-галактозидаза) и, возможно, NelA- (α-галактозидаза).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения среда содержит экзогенный предшественник, который выбран, например, из лактозы, галактозы, β-галактозида и α-галактозида, такого как глоботриоза (Galα-4Galβ-4Glc).
Изобретение относится также к указанному выше микроорганизму и к культуральной среде для клеток, содержащей указанный выше микрорганизм, и к экзогенному предшественнику, выбранному из лактозы, галактозы, β-галактозида и α-галактозида, такого как глоботриоза (Galα-4Galβ-4Glc).
Определения
Термин «сиаловая кислота» относится к любому представителю семейства содержащих 9 атомов углерода карбоксилированных Сахаров. Наиболее типичным представителем семейства сиаловых кислот является N-ацетил-нейраминовая кислота (2-кето-5-ацетамидо-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галактононулопираноз-1-оновая кислота (часто используемые аббревиатуры NeuAc, Neu5Ac или NANA). Вторым представителем семейства является N-гликолил-нейраминовая кислота (Neu5Gc или NeuGc), в которой N-ацетильная группа Neu5Ac гидроксилирована. Третьим представителем семейства сиаловых кислот является 2-кето-3-дезоксинонулосоновая кислота (KDN) (Nadano et al. II J. Biol. Chem. 1986. Т. 261. С.11550-11557; Kanamori et al. II J. Biol. Chem. 1990. Т. 265. С.21811-21819). Сюда входят также 9-замещенные сиаловые кислоты, такие как 9-O-С1-С6-ацил-Neu5Ac (подобные 9-О-лактил-Neu5Ac или 9-О-ацетил-Neu5Ac, 9-дезокси-9-фтор-Neu5Ac и 9-азидо-9-дезокси-Neu5Ac). Обзоры, касающиеся семейства сиаловых кислот, представлены, например, в Varki // Glycobilogy. 1992. Т. 2. С.25-40; «Sialic Acids:
Chemistry, Metabolism and Function». Под ред. R. Schauer. Springer-Verlag, New York, 1992). Синтез и использование соединений сиаловых кислот в процессе сиалилирования раскрыт в международной патентной заявке WO 92/16640, опубликованной 1 октября 1992 г.
Термин «бифункциональная сиалилтрансфераза Cstll из Campylobacter jejuni» относится к сиалилтрансферазе, которая обладает и α-2,3-, и α-2,8-сиалилтрансферазной активностью. В некоторых вариантах осуществления используют сиалилтрансферазу Cstll из коллекции АТСС, № доступа 43438.
«Акцепторный субстрат» или «акцепторный сахарид» для гликозилтрансферазы - это олигосахаридная группировка (часть молекулы), которая может служить акцептором для конкретной гликозилтрансферазы. Когда акцепторный субстрат контактирует с соответствующей гликозилтрансферазой и сахар-донорным субстратом, а также с другими необходимыми компонентами реакционной смеси, а реакционную смесь инкубируют в течение необходимого периода времени, гликозилтрансфераза переносит остаток сахара с сахар-донорного субстрата на акцепторный субстрат. Например, акцепторным субстратом для сиалилтрансфераз, используемых в способах согласно настоящему изобретению, является лактоза Galβ-1,4-Glc.
«Донорный субстрат» для гликозилтрансфераз - это активированный нуклеотидный сахар. Такие активированные сахара, как правило, представляют собой уридин-, гуанозин- и цитидин-монофосфатные (соответственно UMP, GMP и CMP) производные Сахаров или дифосфатные (соответственно UDP, GDP и CDP) производные Сахаров, в которых нуклеозид-монофосфат или нуклеозид-дифосфат является отщепляемой группой. Например, донорным субстратом для сиалилтрансфераз, используемых в способах согласно настоящему изобретению, является CMP-Neu5Ac.
«Культуральная среда» относится к любой жидкой, полужидкой или твердой среде, которую можно использовать для поддержания роста микроорганизма, используемого в способах согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения микроорганизмом является бактерия, например Е. coli. Среды для роста микроорганизмов хорошо известны (см., например, Sambrook et al. и «Current Protocols in Molecular Biology). Под ред. F.M.Ausubel et al. Current Protocols, совместный проект Greene Publishing Associates, Inc. и John Wiley and Sons, Inc., (1998 Supplement) (Ausubel). Средами могут быть богатые среды, например: бульоны Luria broth или terrific broth, или синтетическая или полусинтетическая среда, например среда М9. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения ростовая среда содержит лактозу и сиаловую кислоту.
«Коммерческий масштаб» относится к продукции граммовых количеств продукта - сиалилированного сахарида в одной реакции. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения коммерческий масштаб относится к продукции количеств, больших чем приблизительно 50, 75, 80, 90 или 100, 125, 150, 175 или 200 г.
Термин «действенно соединенный» относится к функциональной связи между контрольной последовательностью для экспрессии ДНК (такой, как промотор, сигнальная последовательность или набор сайтов связывания фактора транскрипции) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, причем контрольная последовательность для экспрессии влияет на транскрипцию и/или трансляцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.
Термины «гетерологичный полинуклеотид» или «гетерологичный ген», как они использованы здесь, обозначают полинуклеотид или ген, происходящий из источника, чужеродного по отношению к конкретной хозяйской клетке, или, если он происходит из того же самого источника, полученного путем модификации его исходной формы. Так, гетерологичный ген сиалилтрансферазы в клетке включает ген, эндогенный по отношению к конкретной клетке-хозяину, но модифицированный. Модификация гетерологичной последовательности может быть осуществлена, например, путем обработки ДНК рестрикционным ферментом, чтобы получить фрагмент ДНК, который можно действенно соединить с промотором. Такая техника, как сайт-специфический мутагенез, также может быть применена для модификации гетерологичной последовательности.
«Рекомбинантная экспрессионная кассета» или просто «экспрессионная кассета» - это конструкция из нуклеиновой кислоты, созданная рекомбинантным методом или синтетически, с элементами нуклеиновой кислоты, которые способны экспрессировать или влияют на экспрессию структурного гена в хозяевах, совместимых с такими последовательностями. Экспрессионные кассеты включают по меньшей мере промоторы и, возможно, сигналы терминации транскрипции. Обычно рекомбинантная экспрессионная кассета включает подлежащую транскрипции нуклеиновую кислоту (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую требуемый полипептид) и промотор. Могут быть также использованы дополнительные факторы, необходимые или полезные для воздействия на экспрессию. В экспрессионную кассету могут быть также введены сигналы терминации транскрипции, энхансеры и другие нуклеотидные последовательности, которые влияют на экспрессию гена. Если в микроорганизме экспрессируют более одного гетерологичного белка, кодирующие белки гены могут экспрессироваться в одной экспрессионной кассете или в нескольких экспрессионных кассетах, которые совместимы и могут поддерживаться в одной и той же клетке. Термин «экспрессионная кассета», как он использован здесь, охватывает также конструкции нуклеиновой кислоты, которые внедрены в хромосому микроорганизма-хозяина. Имеющие опыт в данной области знают, что внедрение нуклеиновой кислоты в хромосому может происходить, например, путем гомологичной рекомбинации. Экспрессионная кассета может быть сконструирована для продукции более чем одного белка. Экспрессия белков может регулироваться одной промоторной последовательностью, как, например, в опероне, или же несколько белков могут кодироваться нуклеиновыми кислотами с индивидуальными промоторами и сайтами связывания с рибосомами.
Термин «изолированный» относится к материалу, который в основном или по существу не содержит компонентов, наносящих вред активности биологической молекулы. Для клеток, сахаридов, нуклеиновых кислот и полипептидов настоящего изобретения термин «изолированный» относится к материалу, который в основном или по существу не содержит компонентов, которые в норме сопровождают материал, когда он находится в своем нативном состоянии. Как правило, изолированные сахариды, олигосахариды, белки или нуклеиновые кислоты являются чистыми по меньшей мере приблизительно на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% или 85%, обычно по меньшей мере приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, как измерено по интенсивности линий в окрашенном серебром геле или другим методом определения чистоты. Чистоту или гомогенность можно указать различными способами, хорошо известными в данной области, - такими как электрофорез образца белка или нуклеиновой кислоты в полиакриламидном геле с последующей визуализацией окрашиванием. Для некоторых целей требуется высокое разрешение, и для очистки используют ВЭЖХ или подобные приемы. Для олигосахаридов (например, сиалилированных продуктов) чистоту можно определять, используя, например, тонкослойную хроматографию, ВЭЖХ или масс-спектроскопию.
Термины «идентичный» или «процент идентичности», относящиеся к двум или более последовательностям нуклеиновых кислот или белков, относятся к двум или более последовательностям или фрагментам последовательностей, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми, когда они сопоставляются и выравниваются для максимального соответствия, что измеряют с использованием одного из указанных далее алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального обследования.
Термин «в основном (существенно) идентичные» в отношении двух нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям или фрагментам последовательностей, которые имеют степень идентичности нуклеотидов или аминокислот по меньшей мере 60%, предпочтительно 80% или 85%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, когда они сопоставляются и выравниваются для максимального соответствия, что измеряют с использованием одного из указанных далее алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального обследования. Предпочтительно, чтобы существенная идентичность распространялась на участок последовательностей, имеющий длину по меньшей мере приблизительно 50 остатков, более предпочтительно на участок длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и наиболее предпочтительно, чтобы последовательности были существенно (в основном) идентичны на протяжении по меньшей мере приблизительно 150 остатков. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательности существенно идентичны на протяжении всей длины кодирующих областей.
При сравнении последовательностей обычно одна последовательность служит референсной последовательностью, с которой сравнивают испытуемые последовательности. Если используют алгоритм сравнения последовательностей, испытуемую и референсную последовательности вводят в компьютер, при необходимости определяя координаты последовательностей, и задают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. 3атем с помощью алгоритма сравнения последовательностей на основании заданных параметров программы вычисляют процент идентичности последовательности для испытуемой последовательности (испытуемых последовательностей) по отношению к референсной последовательности.
Оптимальное выравнивание последовательностей для из сравнения может быть осуществлено, например, с помощью алгоритма локальной гомологии (Smith and Waterman // Adv. Appl. Math. 1981. Т.2. С.482), алгоритма выравнивания гомологии (Needleman and Wunsch // J. Mol. Biol. 1970. Т.48. С.443), метода поиска подобий (Pearson and Lipman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. Т.85. С.2444), компьютеризованных реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакетах программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, W1), или путем визуального обследования (см. общий обзор в «Current Protocols in Molecular Biology». Под ред. F.M.Ausubel et al. «Current Protocols», совместный проект Greene Publishing Associates, Inc. и John Wiley and Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)).
Примерами алгоритмов, пригодных для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные соответственно в работах Altschul et al. II J. Mol. Biol. 1990. Т.215. С.403-410; и Altschuel et al. II Nucleic Acids Res. 1977. Т.25. С.3389-3402. Программное обеспечение для проведения анализов с алгоритмом BLAST можно свободно получить в National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм включает первоначальную идентификацию дающих высокий отсчет пар последовательностей (HSP) путем идентификации коротких слов длиной W в опрашиваемой последовательности, которые при выравнивании со словом такой же длины в последовательности из банка данных либо полностью соответствуют ему, либо удовлетворяют некоторому пороговому отсчету с положительным значением Т. Т называют порогом регистрации соседствующего слова (Altschul et al, см. выше). Эти начальные фиксации соседствующих слов служат затравками для инициирования поиска содержащих их более длинных HSP. 3атем фиксированные слова продлевают в обе стороны вдоль каждой последовательности, пока увеличивается кумулятивный отсчет выравнивания. Для нуклеотидных последовательностей кумулятивные отсчеты рассчитывают с использованием параметров М (поощрительный отсчет для пары совпадающих остатков, всегда >0) и N (штрафной отсчет для несовпадающих остатков, всегда <0). Для аминокислотных последовательностей для вычисления кумулятивного отсчета применяют регистрирующую матрицу. Продление фиксированных слов в каждом направлении прекращается, когда кумулятивный отсчет выравнивания падает ниже своего максимального достигнутого значения на величину X, когда кумулятивный отсчет падает до нуля или ниже (из-за накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательным значением) или когда достигнут конец какой-либо из последовательностей. Параметры W, Т и Х алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) используют в качестве предела штрафа для длины слов (W) значение 11, ожидание (Е), равное 10, М=5, М=-4 и сравнивают обе нити. Для аминокислотных п