Регуляторы ммр-9 и их применение

Регуляторы ммр-9 и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ И УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к регуляторам ММР-9, а именно к регуляторам, нацеленным на OG-домен ММР-9.

Матриксные металлопротеиназы (ММР) играют многообразную роль в физиологии и патологии. Установлено, что представители семейства ММР участвуют в многочисленных аспектах миграции клеток воспаления и раковых клеток в соединительной ткани, осуществляя данное участие не только посредством катаболизации компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), но и посредством обработки различных растворимых медиаторов, способствующих развитию многих заболеваний. Хотя все ММР обладают одинаковыми каталитическими участками, наблюдаются выраженные различия их субстратной специфичности, обусловленные, по крайней мере частично, присутствием дополнительных участков связывания субстратов в некаталитических доменах белка. Вследствие этого ММР различаются по выполняемым биологическим функциям. ММР-9, называемая также желатиназой В, является стандартной мишенью при воспалительных заболеваниях, так как оказывает повреждающее воздействие на ткани, а также осуществляет обработку растворимых белков, включая ингибиторы протеазы, хемокины и цитокины, способствующую развитию воспаления.

ММР-2 (или желатиназа А) в отличие от ММР-9 обладает в основном противовоспалительными и гомеостатическими функциями, осуществляемыми, предположительно, посредством инактивации воспалительных хемокинов и регуляции процессов обновления соединительной ткани. Таким образом, для проведения эффективной противовоспалительной терапии, не сопровождающейся возникновением побочных эффектов, требуется применение селективных ингибиторов, различающих эти ферменты, характеризующиеся высокой степенью сходства. С этой целью возможно использование селективных ингибиторов, различающих ММР-2 и ММР-9, нацеленных на другие, некаталитические участки фермента.

Представляет интерес тот факт, что основное структурное различие между ММР-9 и ММР-2 заключается в присутствии в ММР-9 домена, характеризующегося высокой степенью О-гликозилирования (OG) [Opdenakker, G.С соавт. (2001), Trends Immunol. 22, 571-579; Van den Steen, P.E. с соавт. (2006) J Biol Chem. 281, 18626-18637]. Другие домены, присутствующие в ММР-9, обнаруживаются и в ММР-2; они включают в себя пропептидный домен, ответственный за поддержание латентности; каталитический домен, содержащий три фибронектиновых повтора; и С-концевой домен, также называемый гемопексин-подобным доменом, который образует экзосайт для связывания с эндогенным ингибитором ММР-9 и ММР-2 - тканевым ингибитором металлопротеиназы-1 (TIMP-I). Несмотря на важную роль, которую ММР-9 играет в патогенезе многих заболеваний, имеющаяся информация о структуре ММР-9 (в отличие от аналогичной информации об ММР-2) ограничивается ее двумя концевыми доменами, а не распространяется на всю длину фермента. Рентгеноструктурное исследование N-концевой части, содержащей прокаталитический домен [Elkins с соавт. 2002 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58, 1182-1192], продемонстрировало наличие матриксинового складывания. С-концевой гемопексин-подобный домен имеет структуру четырехлопастного (?) пропеллера с ложной четырехкратной симметрией [Cha с соавт., 2002, J Mol Biol 320, 1065-1079]. На Фиг.IA представлена кристаллическая структура прокаталитического и гемопексин-подобного доменов про-ММР-9. Эти домены соединены пунктирной линией, обозначающей линкерное звено, состоящее из 64 аминокислотных остатков (содержащее 22 остатка пролина, 6 остатков глицина и приблизительно 12-14 О-связанных гликанов [Van den Steen с соавт., 2001, Biochim Biophys Acta 1528, 61-73]. Важное значение имеет тот факт, что данный линкерный домен про-ММР-9 в 2-3 раза длиннее линкерных областей коллагеназ, стромелизинов и желатиназы А семейства ММР, у которых типичная длина линкера составляет всего лишь от 21 до 27 аминокислотных остатков.

Кристаллизация линкерного домена про-ММР-9 - как в отдельности, так и вместе с другими доменами белка - затруднена. Отсутствие большой боковой цепи у глицина и наличие собственного изгиба молекулы пролина препятствуют формированию вторичной структуры и часто приводят к образованию петель или неструктурированных областей. Кроме того, присутствие кластеров остатков серина и треонина, являющихся точками прикрепления О-гликанов, может приводить к стерическим эффектам, способным препятствовать кристаллографической упаковке. Этот домен, в связи со сходством его аминокислотной последовательности с последовательностью коллагена V, был также назван "коллаген V-подобным доменом"; недавно данный домен получил новое название "О-гликозилированный (OG) домен". OG-домен принимает активное участие в ориентировании гемопексиновых доменов, обеспечивающем возможность взаимодействий экзосайта. Вместе с тем, какая-либо информация о влиянии OG-домена на общую трехмерную структуру ММР-9 и ее биофизическую природу отсутствует.

В патенте США №20040175817 предлагается идентификация модуляторов ММР-9 на основании оценки кристаллической структуры ее каталитической субъединицы. Вместе с тем, учитывая наличие, в целом, высокой степени гомологии аминокислотных последовательностей каталитических участков матриксных металлопротеиназ, модуляторы, рассчитанные на нацеливание на каталитический участок, не могут быть селективными в отношении ММР-9.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует потребность в специфических регуляторах ММР-9.

Один из признаков настоящего изобретения связан со способом регулирования активности металлопротеиназы 9 (ММР-9); данный способ заключается в осуществлении контакта ММР-9 с агентом, специфически взаимодействующим с OG-доменом ММР-9 и, таким образом, регулирующим активность ММР-9.

Другой признак настоящего изобретения связан со способом идентификации агента, способного специфически регулировать ММР-9; данный способ заключается в определении способности агента, являющегося предполагаемым специфическим регулятором ММР-9, взаимодействовать с OG-доменом ММР-9.

Другой признак настоящего изобретения связан со способом лечения заболеваний, в патогенезе которых участвует ММР-9; данный способ заключается во введении пациенту, нуждающемуся в данном лечении, терапевтически эффективного количества агента, специфически взаимодействующего с OG-доменом ММР-9 и, таким образом, осуществляющего лечение заболевания или патологического состояния, в патогенезе которого участвует ММР-9.

Другой признак настоящего изобретения связан с молекулой, способной специфически регулировать активность ММР-9, отличающейся тем, что она взаимодействует с OG-доменом ММР-9, при условии, что эта молекула не является антителом, не относящимся к гуманизированным антителам.

Другой признак настоящего изобретения связан с гуманизированным антителом, содержащим антиген-распознающий домен, специфически взаимодействующий с OG-доменом ММР-9.

Другой признак настоящего изобретения связан с фармацевтическим составом, содержащим, в качестве активного ингредиента, молекулу, способную специфически регулировать активность ММР-9, отличающимся тем, что данная молекула взаимодействует с OG-доменом ММР-9, при условии, что эта молекула не является антителом, не относящимся к гуманизированным антителам, и используется фармацевтически приемлемый носитель.

Вариант осуществления: данный ММР-9 является нативным ММР-9.

Другой вариант осуществления: данная активность является коллагенолитической активностью.

Другой вариант осуществления: данная активность является желатинолитической активностью.

Другой вариант осуществления: данная регуляция является повышающей регуляцией.

Другой вариант осуществления: данная регуляция является понижающей регуляцией.

Другой вариант осуществления: данный агент включает в себя полипептидный агент.

Другой вариант осуществления: данный полипептидный агент включает в себя антитело.

Другой вариант осуществления: данный агент включает в себя небольшую молекулу.

Другой вариант осуществления: данное определение осуществляется путем сравнения структуры данного агента со структурой OG-домена ММР-9.

Другой вариант осуществления: данное определение осуществляется путем обеспечения контакта указанного агента с выделенным OG-доменом ММР-9.

Другой вариант осуществления: данный агент включает в себя полипептид.

Другой вариант осуществления: данный полипептид включает в себя антитело.

Другой вариант осуществления: данный агент включает в себя небольшую молекулу.

Другой вариант осуществления: данный агент идентифицируют в соответствии с описанием, представленным в настоящем изобретении.

Другой вариант осуществления: данный агент включает в себя небольшую молекулу или полипептидный агент.

Другой вариант осуществления: данный полипептидный агент включает в себя антитело.

Другой вариант осуществления: данная молекула включает в себя гуманизированное антитело, включающее в себя антиген-распознающий домен, специфически взаимодействующий с OG-доменом ММР-9.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Данное изобретение описано ниже с помощью примеров, иллюстрируемых чертежами. В отношении этих детальных чертежей следует подчеркнуть, что представленные на них подробности являются всего лишь примерами, предназначенными для иллюстрации обсуждения предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения; эти чертежи представлены с целью обеспечения предполагаемого наиболее удобного и понятного описания принципов и концептуальных признаков данного изобретения. В связи с этим не было предпринято каких-либо попыток представить структурные детали данного изобретения более подробно, чем это необходимо для понимания основ изобретения; для специалистов в данной области это описание в сочетании с данными чертежами дает четкое представление о том, каким образом различные формы этого изобретения могут быть осуществлены на практике.

На данных чертежах представлено следующее.

На Фиг.1A-D представлены компьютерно сгенерированные модели и графики, характеризующие про-ММР-9. На Фиг.1А представлена иллюстрация кристаллических структур концевых доменов. N-концевой домен про-ММР-9 (код PDB: 1L6J) состоит из пропептида (зеленый), трех фибронектиновых (тип II) повторов (синие) и каталитического домена (красный) с активным участком, содержащим цинк (серый шар). OG-домен (пунктирная линия) содержит фрагмент неизвестной структуры, состоящий из 64 остатков аминокислот, и соединяет N-концевой домен с С-концевым гемопексин-подобным доменом (код PDB: HTV), состоящим из четырех пропеллерных лопастей (циан). На Фиг.1В представлен график, иллюстрирующий эксклюзионную хроматографию, показывающую профиль элюирования олигомерных (пик 1, 15,8 минут и пик 2, 22,7 минут) и мономерных (пик 3, 25,1 минут) форм про-ММР-9. Вставка: График Пората [57] для стандартов белков с известными радиусами Стокса; эти стандарты были использованы с целью калибрования колонки Superdex 200 (слева направо: тиреоглобулин 85 Å, ферритин 61 Å, каталаза 52,2 Å, альдолаза 48,1 Å, альбумин 35,5 Å). Представлена зависимость кубического корня Kd от радиуса Стокса каждого белка, а также показана подгонка методом наименьших квадратов. На Фиг.1С представлена фотография желатиновой зимограммы. С целью отделения мономеров от более высокомолекулярных олигомерных структур в препаративных количествах была применена глицериновая седиментация. Был проведен анализ аликвотных количеств каждой фракции на желатиновых зимограммах. Высокомолекулярные олигомерные структуры присутствовали во фракциях 1-3. Фракция 3 содержала смесь всех олигомерных форм. Фракции 4-7 содержали преимущественно мономерную форму. На Фиг.1D представлен анализ скорости седиментации при аналитическом ультрацентрифугировании, осуществленный с целью расчета распределения коэффициента седиментации. Вставка: моделирование профилей седиментации (линий) на основании экспериментальных данных (точек) как функции времени и расстояния от оси вращения. Вверху представлен график остатков. В целях упрощения восприятия данных показан только каждый десятый профиль, использованный в данном анализе.

На Фиг.2А-Е представлены компьютерно сгенерированные модели и графики, иллюстрирующие структурный анализ про-ММР-9. На Фиг.2А представлен график, иллюстрирующий данные малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) про-ММР-9 в растворе. Экспериментальные данные интенсивности рентгеновского излучения (черные точки) были сопоставлены с наиболее вероятной моделью (серая линия) с помощью CHADD. Вставка: парная функция распределения экспериментальных данных МУРР. На Фиг.2В представлены модели про-ММР-9, реконструированные с помощью CHADD. Модели, полученные на основании данных МУРР, представлены в виде белых шаров, имеющих радиус 5 Å. Каждая модель была повернута на 0° и 90° вокруг вертикальной оси. Пристыкованные кристаллические структуры N-концевого и С-концевого доменов [22, 24] представлены соответственно в виде синей и красной лент. На Фиг.2С представлена область долгого разупорядочения, спрогнозированная с помощью PONDR (толстая черная линия) [37] в последовательности про-ММР-9, и соответствующая организация домена (верхняя полоса: PRO-пропептид, CAT+FN - каталитический домен и три фибронектиновых (тип II) повтора, OG - О-гликозилированный домен, РЕХ - гемопексин-подобный домен). На Фиг.2D продемонстрировано соответствие экспериментальным данным расчетной кривой рассеяния про-ММР-9 полной длины с реконструированным OG-доменом. Эти расчетные кривые трех лучших моделей представлены в виде зеленой, зеленовато-голубой и желтой линий. Экспериментальные данные представлены в виде черных точек. Три лучшие модели OG-домена были рассчитаны с помощью RAPPER [38, 39] в рамках модели CHADD. На Фиг.2Е представлена реконструкция структуры OG-домена. Три лучшие модели представлены в виде зеленой, зеленовато-голубой и желтой лент.

На Фиг.3A-F представлены графики и изображения про-ММР-9 дикого типа и мутировавшего про-ММР-9, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). С целью ковалентного соединения аминных групп на поверхности белка был использован глютаральдегид. Все скенограммы были получены с использованием зонда с острым наконечником. На Фиг.3А-С представлены скенограммы про-ММР-9 дикого типа, полученные в полусухом режиме. На Фиг.3D-F представлены скенограммы мутанта npo-MMP-9ΔOG, полученные в полусухом режиме. На Фиг.3А и 3D представлены двухмерные изображения. На Фиг.3В и 3Е представлены трехмерные изображения. На Фиг.3С и 3F представлены поперечные сечения XZ вдоль пунктирной линии, показанной на Фиг.3А и Фиг.3D. Подготовка пробы и условия получения изображений описаны в тексте. Шкала высоты обозначена столбиком, расположенным с правой стороны: диапазон оси Z составляет от 0 до 50 Å (от темного к светлому).

На Фиг.4A-F представлены гистограммы распределения размеров про-ММР-9 дикого типа (слева) и про-MMP-9ΔOG (справа) согласно результатам измерений с помощью АСМ. На оси "у" всех гистограмм отложена нормализованная частота, полученная с помощью деления подсчитанного количества импульсов на общую популяцию. На Фиг.4А и 4В представлено распределение по высоте. На Фиг.4С и 4D представлено распределение по ширине. Величины ширины были скорректированы в соответствии с описанием, представленным в разделе, посвященном методикам проведения экспериментов. На Фиг.4Е представлено распределение межлопастных расстояний про-ММР-9 дикого типа. Разделение лопастей про-MMP-9ΔOG отсутствовало. На Фиг.4F показано моделирование конформационных состояний про-ММР-9. Стандартное отклонение, равное 9,5 Å, рассчитанное на основании данных АСМ в отношении межлопастных расстояний, было вычтено (слева) из междоменного разделения усредненной структуры (посередине), полученной с помощью структурной реконструкции на основе МУРР, или добавлено (справа) к данному междоменному разделению. N- и С-концевой домены [22, 24] обозначены соответственно синим и красным цветом. OG-домен был реконструирован с помощью RAPPER [38, 39]; он обозначен зеленой С?-линией.

На Фиг.5А-В представлены реконструированные модели про-ММР-9, полученные с помощью МУРР. На Фиг.5А представлена модель GASBOR. На Фиг.5В представлена модель CHADD. Белые шары радиусом 5 Å представляют полученные модели. Пристыкованные кристаллические структуры N- и С-концевых доменов обозначены соответственно синим и красным цветом. Каждая модель была повернута на 0° и 90° вокруг вертикальной оси.

На Фиг.6А-С представлены АСМ-изображения про-ММР-9. С целью ковалентного соединения аминных групп на поверхности белка был использован глютаральдегид. Все скенограммы были получены с использованием зонда с острым наконечником, за исключением скенограммы, представленной на Фиг.6А, которая была получена с использованием зонда с кремниево-нитридным наконечником, заостренным оксидом. На Фиг.6А представлен про-ММР-9 дикого типа под буферным раствором. На Фиг.6В представлен обезвоженный образец фермента дикого типа, просканированный в условиях окружающей среды. На Фиг.6С представлена пустая проба, подвергнутая той же процедуре иммобилизации, но без нанесения фермента. Стрелкой показана одиночная частица, наблюдаемая на скенограмме 1×1? м². Шкала высоты обозначена столбиком, расположенным с правой стороны: диапазон оси Z составляет от 0 до 50 Å (от темного к светлому).

Фиг.7А-В: На Фиг.7А представлена зимография in situ клеток линии НТ1080, экспрессирующих секретируемую ММР-9. Наличие зеленой флюоресценции свидетельствует о протеолитической активности в отношении коллагена IV типа. Синим цветом окрашивается ядро (Hoehst). На Фиг.7В проиллюстрировано инкубирование клеток линии НТ1080 с антителами против ММР (9 часов) с последующим нанесением слоя коллагена IV типа, конъюгированного с Орегонским зеленым. Отсутствие выраженной зеленой флюоресценции вокруг клеток свидетельствует об ингибировании перицеллюлярного протеолиза, обеспечиваемого ММР-9.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к регуляторам ММР-9, а более конкретно к регуляторам, нацеленным на OG-домен ММР-9.

Чертежи и сопровождающие их описания способствуют лучшему пониманию принципов и осуществления настоящего изобретения.

Перед началом подробного рассмотрения вариантов осуществления настоящего изобретения необходимо уточнить, что применение данного изобретения не ограничивается деталями, представленными ниже в описании или в разделе "Примеры". Возможны и другие варианты осуществления данного изобретения, а также различные пути его реализации или выполнения. Кроме того, следует иметь в виду, что используемые в данном документе фразы и термины используются лишь в целях описания и не должны рассматриваться как ограничители объема данного изобретения.

Установлено, что представители семейства металлопротеиназ (ММР) участвуют в многочисленных аспектах миграции клеток воспаления и раковых клеток в соединительной ткани, способствуя развитию многих заболеваний. Хотя все ММР имеют одинаковые каталитические участки, их участки связывания субстрата различны. Вследствие этого ММР различаются по своим биологическим функциям. Так, например, ММР-9 способствует повреждению ткани и развитию воспаления, тогда как ММР-2 выполняет в основном противовоспалительные функции и функцию поддержания гомеостаза. Таким образом, селективные ингибиторы, различающие эти ферменты, обладающие высокой степенью сходства, имеют очень важное значение как средство эффективной противовоспалительной терапии, не вызывающее побочных эффектов.

На предварительном этапе разработки данного изобретения его авторы пришли к пониманию того, что основное структурное различие между ММР-9 и ММР-2 заключается в присутствии в ММР-9 домена, характеризующегося высокой степенью О-гликозилирования (OG). Вместе с тем, имеющаяся информация о структуре ММР-9 ограничивается ее двумя концевыми доменами и не захватывает этот OG-домен. Таким образом, какая-либо информация, имеющая отношение к влиянию OG-домена на общую трехмерную структуру ММР-9 и ее биофизическую природу, отсутствует.

В процессе практического осуществления настоящего изобретения данные изобретатели выполнили новый структурный анализ, применив сочетание малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) и мономолекулярной атомно-силовой микроскопии (АСМ) для того, чтобы впервые выяснить характеристики структуры полной длины про-ММР-9 и молекулярные характеристики ее О-гликозилированного линкерного домена. В результате МУРР с последующим анализом изображений и структурной реконструкции была установлена молекулярная форма полной длины про-ММР-9, представляющая ее усредненную конформацию в растворе (Фиг.2А-Е). Согласно полученным структурным данным, подтвержденным АСМ высокого разрешения (Фиг.3A-F и 4А-Е) и биофизическими измерениями, про-ММР-9 представляет собой белок вытянутой формы, в котором OG-домен действует как гибкое соединительное звено (линкер) длиной 30 Å, расположенное между двумя концевыми доменами (Фиг.5А-В). Степень гибкости OG-домена была оценена статистически на основании данных о разных конформациях белка, выявленных с помощью мономолекулярных изображений (Фиг.4F). Структурно-динамическая модель полной длины про-ММР-9 дает возможность получить новые представления о роли гибкости данного домена белка в регулировании распознавания, связывания и обработки субстратов, лигандов и рецепторов, необходимом для обеспечения эффектов ММР-9.

В процессе дальнейшего практического осуществления настоящего изобретения данными изобретателями с помощью зимографии in situ было показано, что антитело, способное специфически взаимодействовать с OG-доменом ММР-9, блокирует коллагенолитическую активность ММР-9, но не блокирует ее желатинолитическую активность (Фиг.7А-В). Таким образом, данные изобретатели предлагают использование агентов, регулирующих гибкость OG-домена, с целью препятствования эффектам этого фермента, способствующим возникновению патологических изменений.

Таким образом, один из признаков данного изобретения связан со способом регулирования активности металлопротеиназы 9 (ММР-9), заключающимся в осуществлении контакта ММР-9 с агентом, специфически взаимодействующим с OG-доменом ММР-9 и, таким образом, регулирующим активность ММР-9.

В рамках данного документа термин "ММР-9" (мультидоменная цинковая эндопептидаза матриксная металлопротеиназа-9, также называемая желатиназой В) относится к предшественнику и активным формам полипептида ММР-9 млекопитающих (например, человека) (ЕС 3.4.24.35; Swiss Prot №Р 14780), включая их гомологи, ортологи и изоформы. Как правило, ММР-9 включает в себя три домена -каталитический домен; домен, связывающий субстрат; и расположенный между ними линкерный домен. Этот линкерный домен, который в этом документе также называется "коллаген V-подобным доменом" или "О-гликозилированным (OG) доменом", включает в себя 64 аминокислоты, 22 из которых представляют собой остаток пролина, 6 являются остатком глицина и приблизительно 12-14 - О-связанными гликанами.

Вариант осуществления этого признака изобретения: ММР-9 является нативным (то есть не денатурированным) ферментом. Другой вариант осуществления этого признака изобретения: ММР-9 является активным (предпочтительно полностью активным) ферментом.

Виды активности ММР-9 включают в себя, помимо прочего, желатинолитическую активность, разложение нативных коллагенов I, III и XI типов (коллагенолитическую активность), а также разложение эластина, агрекана, цепи А ламинина и основного белка миелина.

В рамках данного документа термин "регулирующий" означает понижающую регуляцию или повышающую регуляцию. Следует иметь в виду, что агенты, подавляющие гибкость OG-домена, снижают функцию ММР-9, для осуществления которой требуется гибкость OG-домена (например, коллагенолитическую активность ММР-9). В отличие от этого активность, требующая наличия особой трехмерной структуры ММР-9 и не требующая наличия гибкости OG-домена, может повышаться под действием агентов, взаимодействующих с OG-доменом. Примером такой активности является желатинолитическая активность ММР-9 или ее способность взаимодействовать с рецепторами и/или факторами роста.

Как было отмечено выше, способ данного изобретения осуществляется путем обеспечения контакта ММР-9 с агентом, способным специфически взаимодействовать с OG-доменом ММР-9.

В рамках данного документа термин "обеспечение контакта" означает обеспечение возможности ММР-9 вступать в контакт с соответствующим агентом в условиях (то есть в определенное время, при определенной температуре и при наличии определенного буфера), позволяющих агенту взаимодействовать с OG-доменом ММР-9 (например, связываться с OG-доменом) и воздействовать на жесткость OG-домена. Следует иметь в виду, что контакт может обеспечиваться в условиях in vivo, ex vivo или in vitro.

В рамках данного документа фраза "специфически взаимодействующий" означает как повышенное сродство с OG-доменом ММР-9 по сравнению с другим доменом ММР-9 (например, каталитическим доменом или доменом, связывающим субстрат), так и повышенное сродство с OG-доменом ММР-9 по сравнению с OG-доменом другой металлопротеиназы (например, ММР-2). Примером минимального сродства, вероятно, является величина сродства, равная 10^-5 М. Предпочтительно агент взаимодействует с OG-доменом ММР-9 с уровнем сродства, не менее чем в 3 раза превышающим сродство, указанное выше; более предпочтительно, если это взаимодействие осуществляется с уровнем сродства, не менее чем в 5 раз превышающим вышеуказанное сродство, а еще более предпочтительно не менее чем в 10 раз превышающим это сродство. Следует иметь в виду, что агенты, способные специфически взаимодействовать с OG-доменом ММР-9, способны и специфически регулировать ММР-9, так как аминокислотная последовательность OG-домена ММР-9 специфична для ММР-9 (в отличие от аминокислотной последовательности каталитического домена, который характеризуется высокой степенью гомологии между ММР-9 и ММР-2).

Агенты (то есть молекулы), рассматриваемые в настоящем изобретении как способные к взаимодействию с OG-доменом ММР-9, включают в себя, помимо прочего, полипептидные агенты (например, антитела, содержащие антиген-распознающий домен, специфически взаимодействующий с OG-доменом ММР-9), пептиды и небольшие молекулы. Следует иметь в виду, что данные агенты могут взаимодействовать с OG-доменом на основе распознавания специфической последовательности аминокислот и/или на основе конформационного распознавания. Агенты-антитела, распознающие OG-домен ММР-9, имеются в продаже (например, антитела, выпускаемые компаниями Сигма, Кемикон и Абкам).

В данном изобретении термин "антитело" охватывает интактные молекулы, а также их функциональные фрагменты (например, Fab, F(ab')2 и Fv), способные связываться со специфическими митохондриальными белками. Фрагменты антител, имеющие меньшие размеры, могут иметь преимущество над целыми антителами, поскольку они способны более активно проникать в ткани и быстрее выводятся из организма. Особенно важное значение эти преимущества имеют при использовании ММР-9-специфичных антител in vivo. Кроме того, дополнительным преимуществом фрагментов антител является то, что они могут быть продуцированы бактериями или дрожжами.

Выработка антител против OG-домена ММР-9 может быть индуцирована пептидом, включающим в себя OG-домен. Селекция данных антител может быть осуществлена с использованием других доменов ММР-9 в качестве отрицательных контролей.

К фрагментам антител, подходящим для практического применения настоящего изобретения, относятся область, определяющая комплементарность (ООК; CDR), легкая цепь иммуноглобулина (далее называемая "легкой цепью"); область, определяющая комплементарность, тяжелой цепи иммуноглобулина (далее называемая "тяжелой цепью"); вариабильная область легкой цепи; вариабильная область тяжелой цепи; легкая цепь, тяжелая цепь; фрагмент Fd; и фрагменты антител, содержащие практически целые вариабильные области легкой и тяжелой цепей - такие как Fv, одноцепочечный Fv, Fab, Fab' и F(ab')2.

Функциональными фрагментами антител, содержащими целые или практически целые вариабильные области легкой и тяжелой цепей, являются:

(i) фрагмент Fv, созданный с помощью методов генной инженерии, состоящий из вариабильной области легкой цепи и вариабильной области тяжелой цепи и экспрессируемый в виде двух цепей;

(ii) одноцепочечный фрагмент Fv ("scFv"), представляющий собой одноцепочечную молекулу, созданную с помощью методов генной инженерии; эта молекула включает в себя вариабильную область легкой цепи и вариабильную область тяжелой цепи, соединенные с помощью подходящего полипептидного линкера;

(iii) фрагмент Fab, представляющий собой фрагмент молекулы антитела, содержащий моновалентную антиген-связывающую часть молекулы антитела, которая может быть получена путем обработки целого антитела ферментом папаином, в результате которой получают интактную легкую цепь и фрагмент Fd тяжелой цепи, который состоит из ее вариабильного домента и СНl-домена;

(iv) фрагмент Fab', представляющий собой фрагмент молекулы антитела, содержащий моновалентную антиген-связывающую часть молекулы антитела, которая может быть получена путем обработки целого антитела ферментом пепсином с последующим восстановлением (на одну молекулу антитела приходятся два получаемых фрагмента Fab'); и

(v) фрагмент F(ab')2, представляющий собой фрагмент молекулы антитела, содержащий моновалентную антиген-связывающую часть молекулы антитела, которая может быть получена путем обработки целого антитела ферментом пепсином (то есть димер фрагментов Fab', удерживаемых вместе двумя дисульфидными связями).

Способы выработки антител (моноклональных и поликлональных) хорошо известны в данной отрасли знаний. Выработка антител может осуществляться любым из нескольких известных способов; эти способы могут включать в себя индукцию выработки молекул антител in vivo, скрининг библиотек иммуноглобулинов (Orlandi D.R. с соавт., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter G. с соавт., 1991. Nature 349:293-299) или выработку молекул моноклональных антител непрерывными клеточными линиями в культуре. Эти способы включают в себя, помимо прочего, гибридомную методику; методику гибридомных В-клеток человека и методику вируса Эпштейна-Барр (ЕВV)-гибридомы (Kohler G. с соавт., 1975. Nature 256:495-497; Kozbor D. с соавт., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote RJ. с соавт., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030; Cole SP. с соавт., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120).

В тех случаях, когда целевые антигены слишком малы для того, чтобы вызвать адекватный иммунный ответ при выработке антител in vivo, данные антигены (гаптены) могут быть спарены с антигенно нейтральными носителями, такими как гемоцианин моллюска рода фиссурелла (KLH) или сывороточный альбумин [например, бычий сывороточный альбумин (BSA)] (см., например, патенты США №5,189,178 и №5,239,078]. Спаривание гаптена с носителем может быть осуществлено с помощью способов, хорошо известных в данной отрасли знаний. Так, например, может быть осуществлено прямое присоединение к аминогруппам и, по выбору, последующее восстановление образовавшейся иминосвязи. Как альтернативный вариант, носитель может быть присоединен с помощью конденсирующих агентов, например дициклогексилкарбодиимида или других карбодиимидных дегидратирующих агентов. Кроме того, с целью обеспечения данного спаривания могут быть использованы соединяющие вещества (линкеры); как гомобифункциональные, так и гетеробифункциональные линкеры могут быть приобретены у Пирс Кемикал Компани, Рокфорд, 111. Иммуногенный комплекс, полученный в результате спаривания, можно вводить подходящим млекопитающим, например мышам, кроликам и т.д. Подходят протоколы, предусматривающие повторные инъекции иммуногена в присутствии адъювантов в соответствии со схемой, ускоряющей продукцию антител и, соответственно, повышение их уровня в сыворотке. Титры антител в иммунной сыворотке легко определяются с помощью методик иммунологического анализа, хорошо известных в данной отрасли знаний.

Возможно непосредственное использование полученных антисывороток, либо могут быть получены моноклональные антитела, как описано выше.

С помощью способов, хорошо известных в данной отрасли знаний, могут быть получены фрагменты антител [(см., например, работу Harlow и Lane, "Antibodies: А Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1988)]. Так, например, фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть получены с помощью протеолитического гидролиза антитела или с помощью экспрессии E. coli или клетками млекопитающих (например, культурой клеток яичника китайского хомячка или другими системами экспрессии белка) ДНК, кодирующей данный фрагмент.

Как альтернативный вариант, фрагменты антител могут быть получены с помощью переваривания целых антител пепсином или папаином в соответствии с общепринятыми способами. Как описано выше, фрагмент антитела (Fab')2 может быть получен путем ферментного расщепления антитела пепсином с получением 5S фрагмента. Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с помощью тиолового восстанавливающего агента и, необязательно, блокирующей группы для сульфгидрильных групп, образующихся в результате разрыва дисульфидных связей, с получением моновалентных 3,5S Fab' фрагментов. Как альтернативный вариант, применяется ферментное расщепление с помощью пепсина, в результате которого непосредственно получают два моновалентных Fab' фрагмента и один Fc фрагмент. В научной литературе присутствуют полные руководства по применению данных способов (например, Goldenberg, патенты США №4,036,945 и 4,331,647; Porter, RR., 1959. Biochem. J. 73:119-126). Кроме того, могут быть использованы и другие способы расщепления антител, например отделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легкой-тяжелой цепи, дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментные, химические или генетические методики, при условии, что получаемые фрагменты связываются с антигеном, распознаваемым интактным антителом.

Как было описано выше, Fv состоит из спаренных вариабильного домена тяжелой цепи и вариабильного домена легкой цепи. Эта связь может быть нековалентной (см., например, работу Inbar с соавт., 1972. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69:2659-62). Как альтернативный вариант (см. выше), данные вариабильные домены могут быть соединены с помощью межмолекулярной дисульфидной связи с образованием одноцепочечного Fv; в качестве другого альтернативного варианта, эти цепи могут быть соединены поперечными связями с помощью химических веществ, например глютаральдегида.

Предпочтительно Fv является одноцепочечным Fv.

Одноцепочечные Fv получают путем конструирования структурного гена, содержащего последовательности ДНК, кодирующие вариабильный домен тяжелой цепи и вариабильный домен легкой цепи, соединенные олигонуклеотидом, кодирующим пептидный линкер. Этот структурный ген внедряют в экспрессионный вектор, который затем вводят в клетку-хозяина (например, клетку Е. coli). Рекомбинантные клетки-хозяева синтезируют одиночную полипептидную цепь с линкерным пептидом, связывающим два вариабильных домена. В научной литературе присутствуют полные руководства по получению одноцепочечных Fv (см., например, Whitlow и Filpula, 1991. Methods 2:97-105; Bird с соавт., 1988. Science 242:423-426; Pack с соавт., 1993. Bio/Technology 11:1271-77; и Ladner с соавт., патент США №4,946,778).

Изолированные пептиды области, определяющей комплементарность, могут быть получены путем конструирования генов, кодирующих область, определяющую комплементарность, интересующего антитела. Такие гены могут быть получены, например, с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) мРНК антителопродуцирующей клетки. В научной литературе присутствуют полные руководства по применению данных способов (см., например, Larrick и Fry, 1991. Methods 2:106-10).

Следует иметь в виду, что при лечении людей предпочтение отдается гуманизированным антителам. Гуманизированные формы антител, вырабатываемых животными (например, мышами), представляют собой химерные антитела или фрагменты антител, полученные методами генной инженерии и содержащие участки (предпочтительно очень небольшие), происходящие от антитела животного. К гуманизированным антителам относятся антитела, в которых области, определяющие комплементарность, человеческого антитела (антитела-реципиента) замещены остатками, обладающими желаемыми функциональными с