Клостридиальный токсин netb

Клостридиальный токсин netb

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к новому токсину. Настоящее изобретение относится также к иммуногенным композициям, содержащим данный токсин, и способам вакцинации животных, например, кур, таким образом, что они становятся менее чувствительными к клостридиальным заболеваниям.

Предшествующий уровень техники

Род Clostridium состоит из грамположительных, анаэробных, спорообразующих бацилл. Природным местообитанием данных организмов является окружающая среда и кишечник людей и других животных. Несмотря на идентификацию приблизительно 100 видов Clostridium, только небольшое количество было признано в качестве этиологических агентов медицинской или ветеринарной важности. Тем не менее, эти виды ассоциированы с серьезными заболеваниями, включающими ботулизм, столбняк, анаэробный целлюлит, газовую гангрену, бактериемию, псевдомембранозный колит и клостридиальный гастроэнтерит.

Clostridium perfringens является этиологическим агентом для многочисленных клостридиальных заболеваний, обнаруживаемых у экономически ценных домашних животных. Некротический энтерит (NE) является одним из примеров клостридиального кишечного заболевания, вызываемого C. perfringens. Некротический энтерит приводит к развитию некротических повреждений в кишечной стенке, приводя в результате к заболеваемости и смертности домашней птицы. Он является также многофакторным заболеванием со сложными и частично неизвестными эпидемиологией и патогенезом (Kaldhusdal, 1999). Бактерия C. perfringens обычно обнаруживается в желудочно-кишечном тракте домашней птицы (Tschirdewahn et al., 1991), однако, встречаемость некротического энтерита является спорадической (Cowen et al., 1987). Тем не менее, корм, зараженный C. perfringens, считался причастным к вспышкам некротического энтерита у кур (Kaldhusdal, 1999). Исследования также показали, что здоровые куры имеют относительно низкое количество C. perfringens в их желудочно-кишечных трактах, хотя увеличение концентрации этих бактерий может приводить к состоянию некротического энтерита (Craven et al., 1999).

Считается, что клинический некротический энтерит появляется, когда C. perfringens пролиферирует до высоких количеств в тонкой кишке и продуцирует внеклеточные токсины, которые разрушает эту кишку. Считается, что основным участвующим токсином является альфа-токсин, но его точная роль в процессе заболевания еще полностью не выяснена. Альфа-токсин является секретированным цинк-металлоферментом, который обладает как активностью фосфолипазы С, так и активностью сфингомиелиназы и является основным токсином, участвующим в патогенезе газовой гангрены человека (Awad, et al., 1995; Songer, 1997). Все пять типов токсина C. perfringens (A-E) несут и экспрессируют структурный ген альфа-токсина, plc.

До настоящего времени ни один другой токсин не был идентифицирован в качестве идиопатического фактора вирулентности при некротическом энтерите.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения идентифицировали новый клостридиальный токсин. Авторы настоящего изобретения назвали данный полипептид NetB.

Таким образом, настоящее изобретение относится к по существу очищенному или рекомбинантному полипептиду, где данный полипептид содержит:

i) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3,

ii) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, или

iii) биологически активный и/или антигенный фрагмент i) или ii).

В одном варианте осуществления данный полипептид обладает токсинной активностью.

В другом варианте осуществления данный полипептид обладает уменьшенной токсинной активностью в сравнении с полипептидом, кодируемым SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3.

В предпочтительном варианте осуществления данный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3.

В одном варианте осуществления данный полипептид может быть очищен из бактерии рода Clostridium. Предпочтительно, данный полипептид может быть очищен из Clostridium perfringens.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, данный полипептид является анатоксином.

Еще в одном варианте осуществления данный полипептид является слитым белком, содержащим по меньшей мере одну другую полипептидную последовательность.

По меньшей мере один другой полипептид может быть, например, полипептидом, который усиливает стабильность полипептида по настоящему изобретению, или полипептидом, который способствует очистке данного слитого белка, или полипептидом, который усиливает иммунологические свойства полипептида по настоящему изобретению.

Еще в одном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению является синтетическим полипептидом.

Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенному и/или рекомбинантному полинуклеотиду, содержащему:

i) последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO:1,

ii) последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид по любому из п.п.1-8,

iii) последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:1, и/или

iv) последовательность, которая гибридизуется с любой из i)-iii) в строгих условиях, или ее обращенный комплемент.

В одном варианте осуществления выделенный или рекомбинантный полинуклеотид содержит последовательность нуклеотидов, по меньшей мере на 40% идентичную нуклеотидам 226-1194 SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вектору, содержащему полинуклеотид по настоящему изобретению.

Предпочтительно, полинуклеотид в векторе функционально связан с промотором.

В одном варианте осуществления вектор является вирусным вектором или плазмидным вектором.

Настоящее изобретение дополнительно относится к клетке-хозяина, содержащей полипептид по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению и/или вектор по настоящему изобретению.

Клетки-хозяева по настоящему изобретению могут являться любой клеткой, способной продуцировать по меньшей мере один полипептид по настоящему изобретению, и включают клетки животного, растения, бактериальные, грибковые (в том числе дрожжевые) клетки, клетки паразитов и членистоногих.

Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой бактерию.

В одном варианте осуществления бактерией является E. coli. В более предпочтительном варианте осуществления данной бактерией является E. coli, выбранная из CCEC22, CCEC31 и CCEC59.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения полипептида по настоящему изобретению, предусматривающему культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению, или вектора по настоящему изобретению, кодирующего указанный полипептид, в условиях, которые допускают экспрессию полинуклеотида, кодирующего данный полипептид.

Предпочтительно, данный способ дополнительно предусматривает выделение указанного полипептида.

Настоящее изобретение дополнительно относится к по существу очищенному антителу или его фрагменту, которое специфически связывается с полипептидом по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей полипептид по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению, вектор по настоящему изобретению, клетку-хозяина по настоящему изобретению и/или антитело по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления данная композиция является иммуногенной композицией.

В одном варианте осуществления иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант и/или фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вакцине, содержащей антиген, где данный антиген содержит полипептид по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления данная вакцина содержит адъювант и/или фармацевтически приемлемый носитель.

В одном варианте осуществления данная вакцина дополнительно содержит один или несколько дополнительных антигенов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к ДНК-вакцине, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению, причем после введения субъекту данный полипептид экспрессируется, и возникает иммунная реакция на данный полипептид.

Настоящее изобретение дополнительно относится к аттенуированной бактерии, которая продуцирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, где данная бактерия продуцирует уменьшенное количество полипептида в сравнении с бактерией дикого типа и/или обладает уменьшенной токсинной активностью в сравнении с полипептидом в бактерии дикого типа.

В одном варианте осуществления данная аттенуированная бактерия не экспрессирует полипептид.

В другом варианте осуществления данная аттенуированная бактерия дополнительно модифицирована для экспрессии гетерологичного полипептида. Гетерологичный полипептид может являться, например, биологически активным полипептидом или антигеном. Примеры биологически активных полипептидов включают цитокины, факторы роста и ферменты. Данный антиген может являться, например, агентом бактериального, грибного, паразитарного или вирусного заболевания.

Предпочтительно, аттенуированная бактерия принадлежит к роду Clostridium. В наиболее предпочтительном варианте осуществления данной бактерией является Clostridium perfringens.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу аттенуирования вирулентности бактерии, которая экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 40% идентичную SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, предусматривающему мутирование полинуклеотидной последовательности для уменьшения экспрессии и/или токсинной активности данного полипептида, в результате чего аттенуированная бактерия обладает уменьшенной токсинной активностью в сравнении с неаттенуированной бактерией.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу увеличения иммунной реакции у субъекта, предусматривающему введение данному субъекту полипептида по настоящему изобретению, полинуклеотида по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, композиции по настоящему изобретению, вакцины по настоящему изобретению, клетки-хозяина по настоящему изобретению и/или бактерии по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления клетка-хозяина или бактерия являются живыми.

В другом варианте осуществления данные полипептид, полинуклеотид, композиция, вектор, клетка-хозяина или бактерия доставляются in ovo.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения, подвергался ли субъект воздействию патогена, который экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, предусматривающему определение присутствия или отсутствия данного полипептида в образце, полученном от данного субъекта, где присутствие данного полипептида является показателем воздействия данного патогена.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения, подвергался ли субъект воздействию патогена, который экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3, предусматривающему определение присутствия или отсутствия антител в данном образце, которые специфически связываются с полипептидом по настоящему изобретению, где присутствие антител является показателем воздействия данного патогена.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу определения, подвергался ли субъект воздействию патогена, который экспрессирует полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:1, предусматривающему определение присутствия или отсутствия данного полинуклеотида в образце, полученном у данного субъекта, где присутствие данного полинуклеотида полипептида является показателем воздействия данного патогена.

Может быть использован любой подходящий способ определения присутствия или отсутствия полинуклеотида. Например, присутствие или отсутствие полинуклеотида может быть детектировано гибридизацией, например, блоттингом по Саузерну или амплификацией данного полинуклеотида, например, при помощи ПЦР.

В одном варианте осуществления данный патоген относится к роду Clostridium. В предпочтительном варианте осуществления патогеном является Clostridium perfringens.

В одном варианте осуществления способов по настоящему изобретению субъектом является птица.

Предпочтительно, субъектом является домашняя птица. Например, субъектом является курица, индейка, фазан, перепел, утка, страус или другая домашняя птица, обычно разводимая в коммерческих количествах.

В наиболее предпочтительных вариантах осуществления субъектом является курица.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу скрининга на агонист или антагонист, который модулирует активность полипептида по настоящему изобретению, предусматривающему контактирование полипептида по настоящему изобретению с соединением-кандитатом и определение, увеличивает или уменьшает указанное соединение токсинную активность полипептида по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления данное соединение является антагонистом. Предпочтительно, данное соединение является антителом.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу тестирования образца на токсинную активность, предусматривающему:

(a) разделение образца, в котором подозревают присутствие полипептида по любому из п.п.1-8, по меньшей мере на первую и вторую части образца,

(b) контактирование первой части образца с антагонистом полипептида по любому из п.п.1-8, и

(c) определение, обладают ли первая и вторая части образца токсинной активностью,

где отсутствие токсинной активности в первой части образца и присутствие токсинной активности во второй части образца является показателем присутствия полипептида, который по меньшей мере на 40% идентичен SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3.

В одном варианте осуществления стадия (с) предусматривает независимо инкубирование первой и второй частей образца с клетками животного в условиях и в течение периода времени, достаточных для проявления цитопатического действия, и определение присутствия или отсутствия цитопатического действия на данные клетки.

В предпочтительном варианте осуществления данным антагонистом является антитело.

Настоящее изобретение дополнительно относится к пище (корму) и напитку, содержащим антагонист полипептида по настоящему изобретению.

Предпочтительно, данным антагонистом является антитело по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению пищи и/или напитка по настоящему изобретению для уменьшения инфицирования и/или колонизации животного бактерией, которая экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3.

Настоящее изобретение дополнительно относится к трансгенному организму, не являющемуся человеком, содержащему экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид по настоящему изобретению. Предпочтительно, данным трансгенным, не являющимся человеком организмом является растение.

Настоящее изобретение также относится к пище и/или напитку, содержащим полипептид по настоящему изобретению.

Предпочтительно, данный полипептид индуцирует иммунную реакцию против бактериального патогена, когда трансгенный организм (не являющийся человеком) вводят перорально субъекту. Бактериальный патоген может являться патогеном рода Clostridium, например, Clostridium perfringens. Предпочтительно, субъектом является птица, например, курица, индейка или утка.

Как будет понятно специалисту в данной области, данный трансгенный, не являющийся человеком организм и/или пища или напиток по настоящему изобретению могут быть использованы для введения полипептида по настоящему изобретению субъекту, таким образом, что у данного субъекта индуцируется иммунная реакция против данного полипептида.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунной реакции против полипептида по настоящему изобретению, предусматривающему пероральное введение субъекту трансгенного, не являющегося человеком организма по настоящему изобретению и/или пищи и/или напитка по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу обеспечения пассивного иммунитета у потомства птиц-самок, предусматривающему введение полипептида по настоящему изобретению, полинуклеотида по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, клетки-хозяина по настоящему изобретению, композиции по настоящему изобретению, вакцины по настоящему изобретению, аттенуированной бактерии по настоящему изобретению, трансгенного, не являющегося человеком организма по настоящему изобретению и/или пищи и/или напитка по настоящему изобретению птице-самке перед откладыванием яиц данной птицей-самкой, содержащих потомство, в результате чего это потомство обеспечивается пассивным иммунитетом в отношении бактерии, которая экспрессирует полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению полипептида по настоящему изобретению, полинуклеотида по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, композиции по настоящему изобретению, вакцины по настоящему изобретению, клетки-хозяина по настоящему изобретению, бактерии по настоящему изобретению, трансгенного, не являющегося человеком животного по настоящему изобретению и/или пищи и/или напитка по настоящему изобретению в производстве лекарственного средства для индуцирования иммунной реакции у субъекта.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению полипептида по настоящему изобретению, полинуклеотида по настоящему изобретению, вектора по настоящему изобретению, композиции по настоящему изобретению, вакцины по настоящему изобретению, клетки-хозяина по настоящему изобретению, бактерии по настоящему изобретению, трансгенного, не являющегося человеком животного по настоящему изобретению и/или корма и/или напитка по настоящему изобретению в качестве лекарственного средства для индуцирования иммунной реакции у субъекта.

Как будет очевидно, предпочтительные признаки и характеристики одного аспекта по настоящему изобретению применимы ко многим другим аспектам по настоящему изобретению.

Во всем описании слово "содержат" или вариации, такие как "содержит" или "содержащий", будут пониматься как включение указанного элемента, целого числа или стадии или групп элементов, целых чисел или стадий, но не как исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или групп элементов, целых чисел или стадий.

Далее настоящее изобретение описано с использованием следующих не ограничивающих изобретение примеров и со ссылкой на сопутствующие фигуры.

Краткое описание сопутствующих фигур

Фиг.1. ClustalW-выравнивание NetB и бета-токсина из C. perfringens; "*" означает, что остатки или нуклеотиды в данной колонке идентичны во всех последовательностях в данном выравнивании; ":" означает, что наблюдались консервативные замены; "." означает, что наблюдаются полуконсервативные замены.

Фиг.2. Схематическая диаграмма области хромосомы NE18-ΔnetB. Мутанты netB конструировали аллельным изменением с использованием суицидной плазмиды, содержащей инсерционно инактивированный ген netB приблизительно с 2 т.п.н. гомологичной ДНК на каждой стороне данного гена, и вводили в EHE-NE18.

Фиг.3. Анализ цитотоксичности культурального супернатанта C. perfringens EHE-NE18 на клетках LMH. a. Культуральная среда TPG (неразведенная); b. культуральный супернатант C. perfringens EHE-NE18 (разведение 1:16); c. культуральный супернатант C. perfringens JIR325 (штамм 13 - штамм ненекротического энтерита) (разведение 1:2); d. культуральный супернатант C. perfringens NE18-M1 (мутант plc) (разведение 1:16).

Фиг.4. Анализ цитотоксичности netB-отрицательных производных культурального супернатанта EHE-NE18 на клетках LMH. a. Культуральный супернатант ЕНЕ-NE18 (разведение 1:16); b. культуральный супернатант NE18-делетированный netB1 (разведение 1:2); c. культуральный супернатант NE18-делетированный netBλ+pJIR.1457 (челночная плазмида) (разведение 1:2); d. культуральный супернатант NE18-делетированный netBX+pALK20 (комплементационная плазмида netB) (разведение 1:16); e. культуральная среда TPG (неразведенная); f. Очищенный на колонке рекомбинантный NetB (разведение 1:8).

Фиг.5. Анализ цитотоксичности лактатдегидрогеназы клеток LMH, обработанных NetB. LDH, высвобождаемую в супернатант, измеряли в качестве индикатора цитолиза с набором Cyto-Tox (Promega) и представляли в виде процента цитотоксичности. Каждое разведение анализировали в трех повторах и для каждого разведения рассчитывали SEM.

Фиг.6. ПЦР-скрининг штаммов NE и non-NE C. perfringens на присутствие netB. a. штаммы NE; b. штаммы non-NE.

Фиг.7. Обследование Вестерн-блота на присутствие белка в различных штаммах C. perfringens (NE и non-NE). Вестерн-блот-анализ скрининга штаммов NE и штаммов non-NE на экспрессию NetB. Штаммы C. perfringens выращивали в среде TPG, пока они не достигали OD600 нм 0,6, и культуральные супернатанты разделяли электрофорезом на ДСН-ПААГ. Разделенные белки переносили на мембрану PDVF и зондировали антисывороткой rNetB от кроликов. Скобки показывают штаммы NE и non-NE C. perfringens.

Фиг.8. Вестерн-блот-анализ сывороток из кур, вакцинированных NetB. Дорожка 1: маркер молекулярной массы (предварительно окрашенный Invitrogen SeeBlue^® Plus2 стандарт); Дорожки 2-14: сыворотка из вакцинированных птиц #1-#13.

Ключ к списку последовательностей

SEQ ID NO:1 - нуклеотидная последовательность, кодирующая токсин NetB Clostridium perfringens.

SEQ ID NO:2 - Зрелая аминокислотная последовательность токсина NetB Clostridium perfringens.

SEQ ID NO:3 - Аминокислотная последовательность токсина NetB Clostridium perfringens, содержащая последовательность сигнального пептида.

SEQ ID NO:4 - Аминокислотная последовательность бета-токсина Clostridium perfringens.

SEQ ID No:5-10 - Олигонуклеотидные праймеры.

Подробное описание изобретения

Общие способы и определения

Если конкретно не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании, должны пониматься как имеющие значение, обычно понимаемое специалистом в данной области (например, в микробиологии, культуре клеток, молекулярной генетике, иммунологии, иммуногистохимии, химии белков и биохимии).

Если не указано иное, способы получения рекомбинантного белка, культуры клеток, микробиологические и иммунологические способы, используемые в данном изобретении, являются стандартными методиками, хорошо известными специалистам в данной области. Такие способы описаны и объяснены в литературных источниках, как у J.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J.Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A.Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M.Glover and B.D.Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), и F.M.Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все обновленные издания до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), и J.E.Coligan et al., (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons (включая все обновленные издания до настоящего времени), которые включены в данное описание посредством ссылки.

Как использовано в данном описании, термин "субъект" относится к животному, например, птице или млекопитающему. В предпочтительном варианте осуществления субъектом является птица, например, курица. В другом варианте осуществления субъектом является человек. Другие предпочтительные варианты осуществления включают животных-любимцев, таких как кошки и собаки, а также относящихся к скоту животных, таких как лошади, крупный рогатый скот, овцы и козы.

Как использовано в данном описании, термин "птичьи" относится к любому виду, подвиду или расе организма таксономического класса Aves (птицы), таким как, но без ограничения, курица, индейка, утка, гусь, перепел, фазаны, попугаи, мелкие птицы (вьюрки, амадины), небольшие хищные птицы, вороны и бескилевые птицы, включающие страуса (африканского), эму и казуара. Данный термин включает различные известные Gallus gallus, или куры (например, белый леггорн, бурый леггорн, полосатый плимутрок, Суссекс, нью-гемпшир, Род-Айленд, австралорп, корниш, минорка, амрокс, California Gray, Italian Partidge-colored), а также расы индеек, фазанов, перепелов, утки, страусов и другой домашней птицы, обычно разводимой в коммерческих количествах.

Как использовано в данном описании, "токсинная активность" относится к способности полипептида или пептида (например, токсина NetB) убивать клетки животных или вызывать цитопатический эффект в клетках животных. В некоторых случаях может быть желательно, чтобы полипептид обладал уменьшенной токсинной активностью в сравнении с токсином NetB. Уменьшение токсинной активности составляет предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95 или 99%. Уменьшение токсинной активности может быть измерено, например, в виде уменьшения цитопатического эффекта.

Как использовано в данном описании, термины "цитопатический эффект" или "CPE" описывают изменения структуры клеток в результате активности клеточного токсина (т.е. патологический эффект). Обычные цитопатические эффекты включают деструкцию клетки, округление клетки, образование синцитиев (т.е. слитых гигантских клеток), образование вакуолей и образование телец включения. CPE происходит из воздействий токсина на клетки, которые отрицательно влияют на способность данных клеток выполнять их функции, необходимые для того, чтобы клетки остались жизнеспособными. В системах культур клеток in vitro CPE является очевидным, когда клетки, как часть конфлюэнтного монослоя, обнаруживают области отсутствия конфлюэнтности после контакта с образцом, который содержит токсин. Цитопатические эффекты легко распознаваемы и различаемы специалистами в данной области.

Как использовано в данном описании, термин "анатоксин" относится к любому по меньшей мере частично инактивированному токсину, но не предназначен для ограничения каким бы то ни было образом конкретных способов инактивации токсина для получения анатоксина. Такие инактивирующие технологии включают: (i) химические способы, которые модифицируют интактный токсин, например, обработку формальдегидом или глутаровым альдегидом; (ii) физические способы, такие как нагревание; (iii) ферментативные способы, которые изменяют токсин, такие как протеазный, при котором токсин расщепляется на фрагменты; (iv) рекомбинантные способы, такие как генная инженерия гена токсина для удаления или изменения ферментативных участков токсина, но сохранения одного или нескольких антигенных эпитопов.

Термин "дикий тип", как использовано в данном описании в отношении бактерий, относится к природным бактериям, которые продуцируют полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 40% идентичную, более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, которая обладает токсинной активностью.

Как использовано в данном описании, термины "лечение", "лечить" или "обработка" включают введение терапевтически эффективного количества полипептида, полинуклеотида, вектора, клетки-хозяина, композиции, вакцины и/или аттенуированной бактерии по настоящему изобретению, достаточного для уменьшения или удаления по меньшей мере одного симптома заболевания, обусловленного инфекцией бактерией, экспрессирующей полипептид, обладающий токсинной активностью.

Термин "предупреждение" («профилактика») относится к защите субъекта, который может находиться в контакте с бактериями, от развития по меньшей мере одного симптома, вызванного инфекцией, и/или колонизации данной бактерией, или уменьшения тяжести симптома инфекции и/или колонизации у субъекта, подвергшегося воздействию данной бактерии.

Полипептиды/пептиды

Термины "полипептид" и "белок" используются обычно взаимозаменяемо и относятся к единственной полипептидной цепи, которая может быть или не быть модифицирована добавлением неаминокислотных групп. Следует понимать, что такие полипептидные цепи могут быть ассоциированы с другими полипептидами или белками или другими молекулами, такими как кофакторы. Как использовано в данном описании, термины "белки" и "полипептиды" включают варианты, мутанты, биологически активные фрагменты, модификации, аналоги и/или производные описанных в данном описании полипептидов. Под термином "по существу очищенный полипептид" или "выделенный полипептид" авторы имеют в виду полипептид, который был обычно отделен от липидов, нуклеиновых кислот, других пептидов и других загрязняющих молекул, с которыми он ассоциирован в его нативном состоянии. Предпочтительно, по существу очищенный полипептид по меньшей мере на 60% свободен, более предпочтительно по меньшей мере на 75% свободен и более предпочтительно по меньшей мере на 90% свободен от других компонентов, с которыми он природно ассоциирован.

Термин "рекомбинантный" в контексте полипептида относится к полипептиду, когда он продуцируется клеткой или в бесклеточной системе экспрессии, в измененном количестве или при измененной скорости в сравнении с его нативным состоянием. В одном варианте осуществления данная клетка может являться клеткой, которая природно не продуцирует данного полипептида. Однако данная клетка может являться клеткой, которая содержит не-эндогенный ген, который вызывает измененное, предпочтительно увеличенное, количество полипептида, который должен быть продуцирован. Рекомбинантный полипептид по настоящему изобретению включает полипептиды, которые не были отделены от других компонентов трансгенной (рекомбинантной) клетки, или бесклеточной системы экспрессии, в которой он продуцируется, и полипептиды, продуцируемые в таких клетках или бесклеточных системах, которые затем очищают по меньшей мере от некоторых других компонентов.

Процент (%) идентичности полипептида определяют при помощи GAP-анализа (Needleman and Wunsch, 1970) (программы GCG) с пенальти (штрафом) создания гэпа=5 и пенальти (штрафом) удлинения гэпа=0,3. Запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 15 аминокислот, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 15 аминокислот. Более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 50 аминокислот, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 50 аминокислот. Более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 100 аминокислот, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 100 аминокислот. Даже еще более предпочтительно, запрашиваемая последовательность имеет длину по меньшей мере 250 аминокислот, и данный GAP-анализ выравнивает две последовательности по области по меньшей мере 250 аминокислот. Более предпочтительно, две последовательности выравнивают по всей их полной длине.

Что касается определяемого полипептида, будет понятно, что цифры % идентичности, более высокие, чем приведенные выше, будут включать предпочтительные варианты осуществления. Таким образом, когда это допустимо, в свете минимальных цифр % идентичности, предпочтительно данный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 45%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 76%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,8% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична релевантной указанной SEQ ID NO.

Мутанты аминокислотных последовательностей полипептидов по настоящему изобретению могут быть получены введением подходящих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению или синтезом in vitro желаемого полипептида. Такие мутанты включают, например, делеции, инсерции или замены остатков в аминокислотной последовательности. Комбинация делеции, инсерции и замены может быть произведена для получения конечной конструкции, при условии, что данный конечный пептидный продукт имеет желаемые характеристики.

Мутантные (измененные) полипептиды могут быть получены с использованием любого подходящего способа, известного в данной области. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению может быть подвергнут мутагенезу in vitro. Такие способы мутагенеза in vitro включают субклонирование полинуклеотида в подходящий вектор, трансформацию данного вектора в штамм “мутатор”, такой как E. coli XL-I красный (Stratagene) и размножение трансформированных бактерий в течение подходящего числа генераций. В другом примере, полинуклеотиды по настоящему изобретению подвергают способам перетасовки ДНК, широко описанной Harayama (1998). Такие способы перетасовки ДНК могут включать кодирующие токсины гены, родственные генам по настоящему изобретению, такие как гены из бактерий, отличных от Closrtidium perfringens. Продукты, полученные из мутированной/измененной ДНК, могут быть легко подвергнуты скринингу с использованием описанных в данном описании способов определения, обладают ли они токсинной активностью.

В конструировании мутантов аминокислотной последовательности, местоположение сайта мутации и характер мутации будут зависеть от свойства (свойств), которые подлежат мутированию. Сайты мутации могут быть модифицированы индивидуально или последовательно, например, (1) заменой сначала предпочтительными консервативными аминокислотами и затем более радикальным выбором в зависимости от полученных результатов, (2) делетированием остатка-мишени или (3) инсертированием других остатков, смежных с найденным сайтом.

Делеции аминокислотных последовательностей обычно находятся в диапазоне приблизительно 1-15 остатков, более предпочтительно приблизительно 1-10 и обычно приблизительно 1-5 смежных остатков.

Мутанты замены имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток в молекуле полипептида и другой остаток, инсертированный на его место. Представляющие наибольший интерес сайты для заменяющего мутагенеза включают сайты, идентифицированные как активный сайт (активные сайты). Другими представляющими интерес сайтами являются сайты, в которых конкретные остатки, полученные из разных штаммов или видов, являются идентичными. Эти положения могут быть важными для биологической активности. Сайты, особенно сайты, попадающие в последовательность из по меньшей мере трех других идентично консервативных сайтов, заменяют предпочтительно относительно консервативным образом. Такие консервативные замены показаны в таблице 1 под заголовком “примеры замен”.

Таблица 1 Примеры замен
Первоначальный остаток	Примеры заместителей
Ala (A)	val; leu; ile; gly
Arg(R)	lys
Asn(N)	gln; his
Asp (D)	glu
Cys (C)	ser
Gin (Q)	asn; his