Способ комбинированного лечения абсцессов в эксперименте

Способ комбинированного лечения абсцессов в эксперименте

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к хирургии, и может быть использовано для лечения абсцессов, нагноившихся остаточных полостей и кистозных образований.

Известно множество способов лечения абсцессов печени: санирование гнойного очага, антибактериальная терапия, противовоспалительная, десенсибилизирующая терапия (Ахаладзе Г.Г., Церетели И.Ю. Холангиогенные абсцессы в печени // Consilium medicum. - 2005. - Т.7, №2. Хирургия (прил.). - С.1-9. Пархисенко Ю.А., Глухов А.А. и соавт. Диагностика и лечение абсцессов печени // Хирургия. - 2000. - №8. - С. - 35-37. Шойхет Я.Н., Фокеев С.Д. и соавт. Влияние локальной непрерывной внутриартериальной антимикробной терапии на течение послеоперационного периода у больных с абсцессами печени // Анналы хирургии. - 2008. - №1. - С. - 50-53), а также способ пункционно-дренажного лечения абсцессов под контролем УЗИ (А.Ф.Черноусов, А.Д.Тимошин, В.Ю.Мишин, Ю.И.Яшков. «Пункционно-дренажные методы лечения в абдоминальной хирургии», Анналы хирургии. 1997, №2, с.42-47), заключающийся в пункции и дренировании гнойной полости одним или несколькими дренажами, в зависимости от ее объема, с промыванием антибиотиками и антисептиками. Наличие большого количества разнообразных средств и методик санации гнойных очагов говорит об их малой эффективности.

Представленные методы не дают возможности качественной обработки стенок полости, так как плотные фибриновые наложения, покрывающие изнутри полость абсцесса, препятствуют действию лекарственных препаратов, в то же время из-за образования антибиотико-устойчивых форм бактерий приходиться менять дозировку и группу лекарственных средств.

В комплексном лечении гнойных хирургических инфекций в последнее время достаточно широко применяют фаготерапию. Способ лечения послеоперационных интраабдоминальных абсцессов с местным введением бактериофага (Курбангалеев С.М. Гнойная инфекция в хирургии. - М.: Медицина, 1985 г., с.106-109). "Средство для лечения гнойно-воспалительных заболеваний" (патент РФ №2105544), "Препарат для лечения гнойно-воспалительных заболеваний" (патент РФ №2144368), "Способ лечения послеоперационных абсцессов брюшной полости" (патент РФ №2243780).

Однако несмотря на некоторое повышение эффективности медикаментозной терапии область применения указанных препаратов при лечении абсцессов ограничена, а лечение продолжительно, также применение бактериофага возможно лишь после определения вида возбудителя - минимальное время исследования 5-7 дней.

Методики и средства, применяемые для борьбы с внутриполостными инфекциями, не настолько эффективны, как это требуется. Существующие средства не способны стимулировать в достаточной степени процессы регенерации, так как в настоящее время изменилась структура возбудителей гнойных осложнений и обычно используемые препараты малоэффективны, также из-за образования полиантибиотико-резистентных штаммов бактерий приходится постоянно менять препарат.

Бактерицидные свойства меди и ее ионов известны человеку с древних времен. В 2008 году Федеральное Агентство по Охране Окружающей Среды США (US EPA) официально присвоило меди статус вещества с бактерицидной поверхностью. Было доказано бактерицидное и бактериостатическое действие меди на наиболее токсические виды бактерий, грибков и вирусов: Акинетобактерию бауманна, Черную плесень, Кампилобактер, Аэробактер, Хеликобактер пилори, Легионеллу, МРСЗ (в том числе Е-МРСЗ), Синегнойную палочку, Золотистый стафилококк, Энтерококк, устойчивый к ванкомицину, Аденовирус, Грибок кандида, Клостридиум диффициле, Кишечную палочку, Вирус гриппа типа А (Н1N1), Листерию моноцитогенную, Полиовирус, Сальмонеллу (Бацилла Гартнера), Туберкулезную бациллу.

Имеющиеся в литературе сообщения о применении наночастиц меди in vitro наиболее близки к данной работе (Бабушкина И.В. Изучение антибактериального действия наночастиц меди и железа на клинические штаммы Staphylococcus aureus / И.В.Бабушкина, В.Б.Бородулин, Г.В.Коршунов, Д.М.Пучиньян // Саратовский научно-медицинский журнал. - 2010. - Т.6. - №1. - С.011-014.). При изучении антимикробного влияния наночастиц меди на грамотрицательные микроорганизмы установлено, что наибольшими свойствами обладает суспензия наночастиц меди при концентрации 1 мг/мл (В.А.Мартьянова и соавт., 2010). В ряде экспериментальных работ продемонстрировано, что при введении наночастиц меди в рану стимулируются механизмы регуляции микроэлементного состава и активность антиоксидантных ферментов, отмечается ранозаживляющий эффект (Н.Н.Глущенко и др., 2010), что является перспективой создания нового класса антибактериальных препаратов. Наночастицы меди за счет многостороннего действия на бактериальную клетку в отличие от антибиотиков не вызывают селекции резистентных штаммов, что позволяет в дальнейшем рекомендовать для использования при лечении гнойных заболеваний, вызванных штаммами, устойчивыми к используемым в настоящее время антибиотикам.

Известны негативные изменения биохимических показателей сыворотки крови при пероральном введении наночастиц меди. При оценке биологического действия нанопорошка меди на активность трансаминаз (АсАТ и АлАТ), используемых как тест на изменение проницаемости мембран и выраженность цитолитического синдрома гепатоцитов, установлено увеличение их активности, возрастающей пропорционально увеличению концентрации (0,05-5 мг/кг). Увеличение концентрации наночастиц меди вызывает повышение активности ЛДГ, важнейшего биохимического показателя углеводного обмена, отражающего степень выраженности внутритканевой гипоксии, и КФК, который является митохондриально-цитоплазматическим ферментом (Исследование биологической активности нанопорошка меди. / Ю.С.Дудакова, Т.А.Будунова. // Материалы 70 научно-практической конференции студентов и молодых ученых СГМУ: «Молодые ученые - здравоохранению региона». - 2009. - С.76-77).

В литературе имеются сведения о проведении серии токсикологических исследований наночастиц меди. У большинства животных, получавших наночастицы меди, наблюдали выраженные симптомы поражения желудочно-кишечного тракта - снижение аппетита, диарею, рвоту. У животных, получавших наночастицы меди, наблюдали вялость, олигопноэ, тремор, опистотонус. У экспериментальных животных при некропсии отмечено изменение цвета почечной ткани на бронзовый, а также гибель клеток проксимальных канальцев, гломерулонефроз, массивный некробиоз, в селезенке - атрофия и изменения цвета. Кроме перечисленных выше сдвигов отмечены изменения биохимических показателей крови - азота мочевины, креатинина, общих желчных кислот и щелочной фосфатазы, свидетельствующие о почечной и печеночной дисфункции (Chen Z., Meng H., Xing G. et al. Acute toxicological affects of copper nanoparticles in vivo // The journal of physical chemistry. Toxicology letters, 2006. - 163. - 109-120).

Органами-мишенями токсического воздействия наночастиц меди оказались печень, селезенка, почки (Г.Г. Онищенко, Б.Г.Бикотько, В.И.Покровский, А.И.Потапов. «Концепция токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов», 2007 год).

По значению максимально переносимой дозы (МПД) (Изучение безопасности введения наночастиц меди с различными физико-химическими характеристиками в организм животных / О.А.Богословская, Е.А.Сизова, В.С.Полякова и др. // Вестник огу. - 2009. - №2. - С.124-127) различия лежат в пределах 2,5-10 мг/кг массы животного, по ЛД50 - 7-15 мг/кг массы животного и по ЛД100 - 20-30 мг/кг массы животного.

Широкое распространение в лечении гнойных заболеваний получили лазерные технологии. Основой механизма взаимодействия низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) с биообъектом являются фотофизические и фотохимические реакции, связанные с резонансным поглощением тканями света и нарушением слабых межмолекулярных связей, а также восприятие и перенос эффекта лазерного облучения жидкими средами организма (Илларионов В.Е. Основы лазерной терапии. - М.: Издательство "РЕСПЕКТ" Объединения ИНОТЕХ-Прогресс, 1992, с.42-43).

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного комбинированного способа лечения абсцессов, позволяющего сократить сроки лечения, снизить токсическое действие наночастиц.

Техническим результатом является полное подавление патогенных микроорганизмов и успешное стимулирование репаративных процессов. Технический результат достигается сочетанием обработки полости абсцессов суспензией наночастиц меди и облучением НИЛИ.

Выраженность антимикробного действия наночастиц меди и лазерного излучения в отношении клинического штамма Staphylococcus aureus оценивали in vitro бактериологическими методами в несколько этапов:

1) оценка влияния лазерного излучения на рост колоний микроорганизмов;

2) оценка влияния различных концентраций наночастиц меди на рост колоний микроорганизмов;

3) изучение возможности усиления антимикробного действия наночастиц меди в комбинации с воздействием НИЛИ.

Использовали стандартизированную по оптическому стандарту мутности МакФарланда суспензию Staphylococcus aureus. Микробная нагрузка составляла 3×10⁴ микробных тел/мл. В первой серии экспериментов культуру микроорганизмов облучали три минуты аппаратом лазерным терапевтическим «Матрикс ВЛОК», тип МЛО1КР, длина волны - 630 нм, мощность излучения 35 мВт в постоянном режиме с рассеивающей насадкой (сферическая диаграмма рассеивания). Во второй серии в культуру микроорганизмов вносили по 0,2 мл суспензии нанопорошков меди (средний размер частиц меди 60-80 нм) с конечными концентрациями 1000, 100, 10, 1 мкг/мл. В третьей серии сочетали облучение лазером (длина волны - 630 нм, мощность излучения 35 мВт в постоянном режиме с рассеивающей насадкой) и внесение наночастиц меди. Контролем служила культура микроорганизмов без лазерного воздействия и добавления наночастиц. Сразу и через 1, 2, 3 часа культивирования производили мерный высев (по 0,1 мл) на чашки с мясо-пептонным агаром и через 24 часа инкубации при 37°C в условиях постоянного перемешивания со скоростью 50 оборотов в минуту подсчитывали количество выросших колоний. При проведении статистической обработки руководствовались методикой определения среднего квадратичного отклонения найденных в опыте значений, предложенной И.П.Ашмариным и А.А.Воробьевым.

Количество колоний штамма S. aureus в зависимости от времени высева и условий культивирования.
Этапыработы	Условиякультивирования	Время высева, ч
0	1	2	3
	К*	3153±5,2	газон	газон	газон
I	Лазерное облучение	3086±2,0	99±2,3	1212±4,2	5416±8,2
II	Наночастицы меди 1 мкг/мл	3123±2,2	газон	газон	газон
Наночастицы меди 10 мкг/мл	3163±3,1	3550±4,6	1094±5,2	0
Наночастицы меди 100 мкг/мл	3140±4,3	42±1,1	0	0
Наночастицы меди 1000 мкг/мл	3128±3,7	0	0	0
III	Лазер + наномедь 1 мкг/мл	152±3,6	0	0	0
Лазер + наномедь 10 мкг/мл	141±4,5	0	0	0
Лазер + наномедь 100 мкг/мл	103±5,0	0	0	0
Лазер + наномедь 1000 мкг/мл	98±6,8	0	0	0
*К - контрольный вариант штамма (физиологический раствор хлорида натрия без ультрадисперсного порошка меди и лазерного облучения)

В ходе исследования установлено, что на первом и втором этапах полученные количества выросших колоний сразу после посева существенно не отличались от контроля (см. таблицу).

На 1 и 2 часах культивирования после лазерного облучения отмечалось снижение количества колоний опытного штамма до 99±2,3 и 1212±4,2 соответственно, однако на третьем часе рост Staphylococcus aureus возобновлялся. Антибактериальные свойства НИЛИ недостаточно эффективны.

Нанопорошок меди (второй этап) в концентрации 1 мкг/мл не оказывал влияния на рост опытной культуры. Отмечено снижение количества колоний микроорганизмов при увеличении концентрации ультрадисперсного порошка меди и времени культивирования по сравнению с контролем, где наблюдался рост в виде газона. Концентрация нанопорошка меди 10 мкг/мл вызывает сокращение количества колоний Staphylococcus aureus в первые часы контакта с культурой при полном подавлении роста через 3 часа воздействия. Концентрации наномеди 100 и 1000 мкг/мл подавляли рост опытной культуры на 2 и 1 часе соответственно.

На третьем этапе работы сразу после воздействия отмечается резкое подавление роста S. aureus. Концентрации нанопорошка меди 1, 10, 100 и 1000 мкг/мл в сочетании с НИЛИ полностью подавляли жизнедеятельность Staphylococcus aureus на 1, 2 и 3 часах культивирования.

Впервые выявлен эффект усиления антимикробного действия наночастиц меди в комбинации с воздействием НИЛИ на культуру Staphylococcus aureus, что позволяет получать необходимый антибактериальный эффект при более низких концентрациях наночастиц меди, снижая тем самым токсическое действие данного вещества на организм в условиях in vivo.

Для создания абсцесса печени лабораторным животным (кролики-самцы) моделировали фиброзную кисту диаметром 1,5 см по методике, изложенной в патенте РФ 2394278 (выполняли чрескожную пункцию печени с лазерной поддержкой под ультразвуковым контролем, через иглу вводили двухканальный катетер с баллоном, который раздували до нужного размера моделируемой полости в ткани печени, через второй канал катетера вводили в полость кисты склерозирующие растворы, на 5 сутки баллон опорожняли, осуществляли рентгенологический и ультразвуковой контроль кисты), на 6 сутки через санирующий канал катетера в сформированную кисту вводили 2×10⁹ КОЕ в 1,0 мл клинического штамма золотистого стафилококка. Анализ полученных данных показывал, что на 3-и сутки после инфицирования штаммом S. aureus среднее количество бактериальных клеток в аспирируемом отделяемом из полости кисты животных составляло 5,12×10⁵ КОЕ/мл - констатирован абсцесс печени.

Лабораторных животных с моделированными абсцессами по варианту местного лечения разделили на 4 группы: 1 - стандартная санация (фурацилин, диоксидин), 2 - применение лазер-терапии, 3 - применение суспензии наночастиц меди, 4 - наночастиц меди в комбинации с воздействием НИЛИ.

Во всех группах лечение начинали с аспирации содержимого абсцесса. В первой группе проводили ежедневную санацию полости раствором фурацилина 1:5000 с последующим введением 0,5 мл 1% раствора диоксидина. Во второй группе лечение лазером проводили аппаратом АЛТ «Матрикс», тип МЛO1КР (длина волны - 630 нм, постоянный режим, мощность излучения - 35 мВт, рассеивающая головка со сферической диаграммой рассеивания; плотность потока мощности (ППМ) для полости диаметром 1,5 см составляла 5 мВт/см²). Сеансы проводили ежедневно по 3 минуты в течение 14 дней. В третьей группе один раз в сутки полость заполняли суспензией наночастиц меди в физиологическом растворе хлорида натрия концентрацией 100 мкг/мл. В четвертой ежедневно в течение десяти дней заполняли полость абсцесса суспензией наночастиц меди в физиологическом растворе хлорида натрия концентрацией 1 мкг/мл, помещали в центр полости световод лазера, снабженный рассеивателем, через санирующий канал катетера и проводили лазерное облучение (режим воздействия аналогичен второй группе опыта).

Для комплексной оценки воспалительного процесса использовали ультразвуковое исследование (УЗИ), которое осуществляли на 3-и, 5-е, 7-е, 10-е, 14-е, 30-е сутки, ежедневно проводили микробиологическое исследование содержимого абсцессов и оценивали общее состояние животных. С помощью УЗИ определялись диаметр полости и толщина капсулы. Бактериологическое исследование содержимого абсцессов печени включало изучение качественного состава и количественный учет микроорганизмов.

Результаты лечения

На Фиг.1 - фотография контрольных высевов отделяемого из полостей абсцессов на седьмые сутки лечения, где у животных четвертой группы рост колоний возбудителя отсутствовал при микробиологическом исследовании, у животных третьей группы отмечалось более выраженное подавление роста S. aureus (104±2,6) по сравнению с первой группой (1936±4,2), у животных второй группы подавления роста колоний микроорганизмов не было (газон).

Очищение полостей абсцессов от возбудителя у животных первой группы отмечали к четырнадцатым суткам. При лечении изолированным НИЛИ (вторая группа) из полостей абсцессов животных продолжалось отделение гноя на протяжении всего наблюдения. У животных третей группы полости очищались к двенадцатым суткам лечения.

На Фиг.2 - фото ультразвукового исследования на 14 сутки лечения, где у животных первой группы диаметр полости сократился до 1,1 см, у второй оставался прежним (1,5 см), у животных третей группы - 0,9 см, у четвертой - до 0,5 см.

В результате применения стандартной санации абсцессов печени в эксперименте (животные первой группы) полости очищались от возбудителя лишь к четырнадцатым суткам, при этом размер уменьшался до 1,1 см, а к тридцатым суткам размер полостей составлял 0,7 см. Лечение НИЛИ (вторая группа) не приводило к очищению полости абсцесса даже к тридцатым суткам эксперимента, при УЗИ диаметр полости оставался прежним на протяжении всего наблюдения. При обработке наночастицами меди (третья группа) к четырнадцатым суткам размеры остаточных полостей уменьшались до 0,9 см, от возбудителя полости очищались только к двенадцатым суткам, а к тридцатым суткам диаметр абсцессов составлял 0,5 см.

Впервые выявленный эффект усиления антимикробного действия наночастиц меди под действием НИЛИ позволяет начать лечение без определения вида возбудителя, значительно снизить концентрацию наночастиц, полностью подавляющую рост патогенных микроорганизмов, и уменьшить ее токсическое действие на макроорганизм.

При сочетании наномеди и НИЛИ в кратчайшие сроки очищаются инфицированные полости от возбудителя, о чем свидетельствует отсутствие роста колоний микроорганизма уже к седьмым суткам. По данным УЗИ к четырнадцатым суткам комбинированного лечения абсцессов печени размеры полостей сокращались в три раза, к тридцатым не определялись.

Способ иллюстрируется следующим примером.

ПРИМЕР

Кролику-самцу породы шиншилла возрастом 1 год массой 3,5 кг с моделированным абсцессом печени диаметром 1,5 см ежедневно аспирировали содержимое из полости через катетер, затем заполняли полость абсцесса суспензией наночастиц меди в 0,9% физиологическом растворе хлорида натрия концентрацией 1 мкг/мл, помещали в центр полости световод лазера, снабженный рассеивателем, через санирующий канал катетера и проводили лазерное облучение длиной волны 630 нм в постоянном режиме выходной мощностью 35 мВт в течение 3 минут. На седьмые сутки отмечали отсутствие роста колоний Staphylococcus aureus при контрольных высевах из полости абсцесса. На десятые сутки лечения удаляли катетер. По данным УЗИ к четырнадцатым суткам диаметр остаточной полости составлял 0,5 см. Контрольное УЗИ проводили на тридцатые сутки, при этом полость абсцесса не определялась.

Таким образом, эффект усиления антимикробного действия наночастиц меди под действием НИЛИ позволяет начать лечение без определения вида возбудителя, в кратчайшие сроки полностью подавить патогенных микроорганизмов, успешно стимулировать репаративные процессы, снизить токсическое действие наночастиц на макроорганизм, значительно сократить длительность лечения гнойных полостей.

Способ комбинированного лечения абсцессов в эксперименте, включающий аспирацию содержимого из полости через катетер и воздействие суспензией наночастиц меди в физиологическом растворе хлорида натрия, отличающийся тем, что полость абсцесса заполняют суспензией наночастиц меди в физиологическом растворе хлорида натрия концентрацией 1 мкг/мл и одновременно проводят внутриполостное лазерное облучение длиной волны 630 нм в постоянном режиме выходной мощностью 35 мВт ежедневно по 3 минуты в течение десяти суток.