Антитело, направленное на белок siglec-15, связанный с остеокластами

Антитело, направленное на белок siglec-15, связанный с остеокластами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к веществу, применимому в качестве терапевтического и/или профилактического средства при аномальном метаболизме костной ткани, способу скрининга вещества, применимого в качестве терапевтического и/или профилактического средства при аномальном метаболизме костной ткани, способу выявления аномального метаболизма костной ткани и способу лечения и/или профилактики аномального метаболизма костной ткани.

Предпосылки к созданию изобретения

Известно, что кость является динамичным органом, который непрерывно реконструируется посредством многократного образования и резорбции, для того, чтобы менять свою собственную морфологию и поддерживать уровни кальция в крови. В здоровой кости поддерживается равновесие между образованием посредством остеобластов и резорбцией кости посредством остеокластов, и костная масса поддерживается постоянной. Напротив, в тех случаях, когда равновесие между формированием кости и резорбцией кости теряется, происходит аномальный метаболизм костной ткани, например остеопороз (Endocrinological Review, (1992) 13, pp. 66-80, Principles of Bone Biology, Academic Press, New York, (1996) pp. 87-102).

Сообщалось о многих системных гормонах и локальных цитокинах в качестве факторов, которые регулируют метаболизм костной ткани, и эти факторы взаимодействуют друг с другом для образования и поддержания костной ткани (Endocrinological Review, (1992) 13, pp. 66-80, Endocrinological Review, (1996) 17, pp. 308-332). Появление остеопороза как изменения костной ткани вследствие старения широко распространено, но механизм его появления охватывает различные факторы, такие как снижение секреции половых гормонов и аномалии рецепторов к этим гормонам, изменения экспрессии местных цитокинов в костной ткани, экспрессия генов старения и нарушения или дисфункции дифференцировки остеокластов или остеобластов, и, следовательно, трудно рассматривать это просто как связанный с возрастом физиологический феномен. Первичный остеопороз главным образом делится на постменопаузный остеопороз вследствие снижения секреции эстрогена и сенильный остеопороз вследствие старения, но успех фундаментальных исследований механизмов регуляции формирования костной ткани и резорбции костной ткани является необходимым для выяснения механизма его появления и для разработки для него терапевтического средства.

Остеокласты представляют собой многоядерные клетки, происходящие из гематопоэтических стволовых клеток, и посредством высвобождения хлорид-ионов и ионов водорода на поверхность кости, на которой адгезируются остеокласты, остеокласты повышают кислотность промежутка между поверхностью кости и остеокластами, а также секретируют катепсин К, который является кислой протеазой, или подобное (American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324). Это вызывает разрушение фосфата кальция, активацию кислых протеаз и разрушение белков костного матрикса, приводя в результате к резорбции костной ткани.

Было обнаружено, что клетки-предшественники остеокластов дифференцируются в остеокласты под действием стимуляции RANKL (рецептора активатора лиганда NF-кB), экспрессирующегося на клеточной мембране остеобластов/стромальных клеток, находящихся на поверхности кости (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, pp. 3597-3602, Cell, (1998) 93, pp. 165-176). Было обнаружено, что RANKL представляет собой мембранный белок, продуцируемый остеобластами/стромальными клетками, его экспрессия регулируется фактором резорбции кости, RANKL индуцирует дифференцировку клеток-предшественников остеокластов в многоядерные остеокласты, и подобное (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, pp. 3597-3602, Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23, S222). Далее, было обнаружено, что у мышей «нокаут», лишенных RANKL, развивается заболевание, подобное остеопорозу, и, таким образом, доказано, что RANKL является физиологическим фактором, индуцирующим дифференцировку остеокластов (Nature, (1999) 397, pp. 315-323).

В качестве лекарственных средств для лечения заболеваний метаболизма костной ткани или сокращения продолжительности лечения используют бисфосфонаты, активный витамин D₃, кальцитонин и его производные, гормональные препараты, такие как эстрадиол, SERM (селективные модуляторы рецепторов эстрогена), иприфлавон, витамин K₂ (менатетренон), препараты PTH (паратиреоидного гормона), препараты кальция и подобное. Однако эти лекарственные средства не всегда демонстрируют удовлетворительный терапевтический эффект, и требовалась разработка средства с более мощным терапевтическим действием.

Клеточные мембраны иммунных клеток покрыты плотной оболочкой различных гликанов, таких как сиаловая кислота, которые распознаются различными гликан-связывающими белками. Иммуноглобулин-подобные лектины, связывающие сиаловые кислоты (далее называемые «siglec»), представляют собой семейство мембранных белков I типа, которые распознают сиалилированные гликаны и связываются с ними. Многие «siglec» экспрессируются на клеточных мембранах иммунных клеток и распознают сиаловую кислоту, так же находящуюся на клеточных мембранах иммунных клеток, и регулируют клеточное взаимодействие или функцию клетки, и предполагается, что они участвуют в иммунном ответе (Nature Reviews Immunology, (2007) 7, pp. 255-266). Однако также существует множество молекул «siglec», физиологические функции которых еще не выяснены. Siglec-15 (иммуноглобулин-подобный лектин 15, связывающий сиаловые кислоты) представляет собой молекулу, которая, как недавно было описано, принадлежит Siglec (Glycobiology, (2007) 17, pp. 838-846) и идентична молекуле, называемой CD33L3 (молекула 3, подобная CD33). Эта молекула эволюционно крайне консервативна от рыб до людей, и было обнаружено, что она сильно экспрессируется в дендритных клетках и/или макрофагах селезенки человека и лимфатических узлах. Далее, как результат теста связывания, в котором используется зонд сиаловой кислоты, было обнаружено, что Siglec-15 человека связывается с Neu5Acα2-6GalNAc и что Siglec-15 мыши помимо Neu5Acα2-6GalNAc связывается с Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc (Glycobiology, (2007) 17, pp. 838-846). До настоящего времени физиологическая роль Siglec-15 не была раскрыта, однако сообщалось о том, что экспрессия Siglec-15 повышается при дифференцировке и созревании остеокластов, и дифференцировка остеокластов ингибируется снижением экспрессии Siglec-15 посредством РНК интерференции (WO 2007/093042). Однако действие антитела против Siglec-15 на дифференцировку остеокластов пока не выяснено.

Описание изобретения

Проблемы, решаемые настоящим изобретением

Задачей настоящего изобретения является получение: гена, который специфично экспрессируется при различных формах аномального метаболизма костной ткани, например деструкции кости, которые наблюдаются при остеопорозе, ревматоидном артрите, злокачественных метастазах в костную ткань, или подобном; вещества, которое ингибирует дифференцировку и созревание остеокластов и их активность; нового способа скрининга терапевтического и/или профилактического средства для лечения аномального метаболизма костной ткани; вещества, которое ингибирует дифференцировку и созревание остеокластов и их активность; и терапевтического и/или профилактического средства для лечения аномального метаболизма костной ткани.

Способы решения этих проблем

Авторы настоящего изобретения проводили исследования для объяснения механизма дифференцировки остеокластов, созревания и активации с тем, чтобы найти вещество, обладающее терапевтическим и/или профилактическим действием в отношении аномального метаболизма костной ткани. В результате авторы изобретения обнаружили, что экспрессия гена Siglec-15 повышается при дифференцировке и созревании остеокластов, а также обнаружили, что дифференцировка остеокластов ингибируется под действием антитела, которое специфически связывается с Siglec-15, и, следовательно, было осуществлено настоящее изобретение.

То есть, настоящее изобретение включает следующие изобретения.

(1) Антитело, которое специфически распознает один или несколько полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, описанную в одном из следующих пунктов (a)-(i), и ингибирует образование остеокластов и/или остеокластную резорбцию кости, или функциональный фрагмент антитела:

(a) аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 в перечне последовательностей;

(b) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 21-328 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:2 в перечне последовательностей;

(c) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 1-260 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:2 в перечне последовательностей;

(d) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 21-260 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:2 в перечне последовательностей;

(e) аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4 в перечне последовательностей;

(f) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 21-341 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:4 в перечне последовательностей;

(g) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 1-258 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:4 в перечне последовательностей;

(h) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 21-258 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:4 в перечне последовательностей; и

(i) аминокислотную последовательность, включающую замены, делеции или добавления одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, описанной в (a)-(h).

(2) Антитело, которое специфически распознает один или несколько полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, описанной в любом из следующих пунктов (j)-(n), и ингибирует образование остеокластов и/или остеокластную резорбцию кости, или функциональный фрагмент этого антитела:

(j) нуклеотидной последовательностью, представленной последовательностью SEQ ID NO:1;

(k) нуклеотидной последовательностью, представленной последовательностью SEQ ID NO:3;

(l) нуклеотидной последовательностью, представленной последовательностью SEQ ID NO:19;

(m) нуклеотидной последовательностью, представленной последовательностью SEQ ID NO:43; и

(n) нуклеотидной последовательностью полинуклеотида, который гибридизируется с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, описанной в пунктах (j)-(m) в строгих условиях.

(3) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (1) или (2), которое ингибирует процесс клеточного слияния остеокластов.

(4) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(3), которое ингибирует образование остеокластов, индуцированное под действием TNF-α.

(5) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(4), которое ингибирует образование остеокластов in vitro в концентрации 30 мкг/мл или менее.

(6) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (5), которое ингибирует образование остеокластов in vitro в концентрации 3 мкг/мл или менее.

(7) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (6), которое ингибирует образование остеокластов in vitro в концентрации 1 мкг/мл или менее.

(8) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (7), которое ингибирует образование остеокластов in vitro в концентрации от 63 нг/мл до 1 мкг/мл.

(9) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(4), которое ингибирует остеокластную резорбцию кости.

(10) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (9), которое ингибирует остеокластную резорбцию кости in vitro в концентрации 3 мкг/мл или менее.

(11) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (10), которое ингибирует остеокластную резорбцию кости in vitro в концентрации от 0,3 мкг/мл до 3 мкг/мл.

(12) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(11), которое получено способом, включающим следующие стадии 1) и 2):

1) стадию получения антитела, которое специфически распознает один или несколько полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, описанную в любом из следующих пунктов (a)-(i):

(a) аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2 в перечне последовательностей;

(b) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 21-328 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:2 в перечне последовательностей;

(c) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 1-260 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:2 в перечне последовательностей;

(d) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 21-260 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:2 в перечне последовательностей;

(e) аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:4 в перечне последовательностей;

(f) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 21-341 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:4 в перечне последовательностей;

(g) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 1-258 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:4 в перечне последовательностей;

(h) аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 21-258 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:4 в перечне последовательностей; и

(i) аминокислотную последовательность, включающую замены, делеции или добавления одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, описанной в пунктах (a)-(h); и

2) стадию скрининга антитела, которое проявляет ингибирующую активность в отношении образования остеокластов и/или ингибирующую активность в отношении резорбции кости.

(13) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(11), которое получено способом, включающим следующие стадии 1) и 2):

1) стадию получения антитела, которое специфически распознает один или несколько полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, описанной в любом из следующих пунктов (j)-(n):

(j) нуклеотидной последовательностью, представленной последовательностью SEQ ID NO:1;

(k) нуклеотидной последовательностью, представленной последовательностью SEQ ID NO:3;

(l) нуклеотидной последовательностью, представленной последовательностью SEQ ID NO:19;

(m) нуклеотидной последовательностью, представленной последовательностью SEQ ID NO:43; и

(n) нуклеотидной последовательностью полинуклеотида, который гибридизуется с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, описанной в пунктах (j)-(m) в строгих условиях; и

2) стадию скрининга антитела, которое проявляет ингибирующую активность в отношении образования остеокластов и/или ингибирующую активность в отношении резорбции кости.

(14) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(13), отличающееся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.

(15) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (14), отличающееся тем, что имеет такую же эпитопную специфичность, что и антитело, продуцируемое гибридомой #32A1 (FERM BP-10999).

(16) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (14), отличающийся тем, что конкурирует с антителом, продуцируемым гибридомой #32A1 (FERM BP-10999).

(17) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (14), отличающееся тем, что это антитело представляет собой антитело, продуцируемое гибридомой #32A1 (FERM BP-10999).

(18) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (14), отличающееся наличием той же эпитопной специфичности, что и антитело, продуцируемое гибридомой #41B1 (FERM BP-11000).

(19) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (14), отличающееся тем, что конкурирует с антителом, продуцируемым гибридомой #41B1 (FERM BP-11000).

(20) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по пункту (14), отличающееся тем, что это антитело представляет собой антитело, продуцируемое гибридомой #41B1 (FERM BP-11000).

(21) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(20), отличающееся тем, что это антитело представляет собой химерное антитело.

(22) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(21), отличающееся тем, что это антитело является гуманизированным.

(23) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(16), (18) и (19), отличающееся тем, что это антитело представляет собой антитело человека.

(24) Антитело или функциональный фрагмент этого антитела по любому из пунктов (1)-(23), отличающееся тем, что это антитело представляет собой антитело IgG.

(25) Функциональный фрагмент антитела по любому из пунктов (1)-(24), который выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab')2, Fab' и Fv.

(26) Антитело по любому из пунктов (1)-(16), (18) и (19), отличающееся тем, что представляет собой scFv.

(27) Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит по меньшей мере одно из антител или функциональных фрагментов антител по пунктам (1)-(26).

(28) Фармацевтическая композиция по пункту (27), отличающаяся тем, что представляет собой терапевтическое и/или профилактическое средство для лечения аномального метаболизма костной ткани.

(29) Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики аномального метаболизма костной ткани, отличающаяся тем, что содержит по меньшей мере одно из антител или функциональных фрагментов антител по пунктам (1)-(26) и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из бисфосфонатов, активного витамина D₃, кальцитонина и его производных, гормональных препаратов, таких как эстрадиол, SERM (селективных модуляторов рецепторов эстрогена), иприфлавона, витамина K₂ (менатетренона), препаратов кальция, препаратов PTH (паратиреоидного гормона), нестероидных противовоспалительных средств, препаратов растворимого TNF рецептора, анти-TNF-α антител или функциональных фрагментов антител, анти-PTHrP (белок, родственный паратиреоидному гормону) антител или функциональных фрагментов этих антител, антагонистов рецептора IL-1, антител против рецептора IL-6 или функциональных фрагментов этих антител, анти-RANKL антител или функциональных фрагментов таких антител и OCIF (фактора, ингибирующего остеокластогенез).

(30) Фармацевтическая композиция по пунктам (28) или (29), где аномальный метаболизм костной ткани выбран из группы, состоящей из остеопороза, деструкции кости, сопровождающей ревматоидный артрит, злокачественной гиперкальциемии, деструкции кости, сопровождающий множественную миелому или злокачественное метастазирование в костную ткань, гигантоклеточной остеобластомы, потери зубов вследствие периодонтита, остеолизиса вокруг протезированного сустава, деструкции кости при хроническом остеомиелите, деформирующей остеодистрофии, почечной остеодистрофии и несовершенного остеогенеза.

(31) Фармацевтическая композиция по пункту (30), отличающаяся тем, что аномальным метаболизмом костной ткани является остеопороз, деструкция кости, сопровождающая ревматоидный артрит или деструкция кости, сопровождающая злокачественное метастазирование в костную ткань.

(32) Фармацевтическая композиция по пункту (31), отличающаяся тем, что остеопороз представляет собой постменопаузный остеопороз, сенильный остеопороз, вторичный остеопороз, вследствие применения таких терапевтических средств, как стероиды или иммунодепрессанты, или остеопороз, сопровождающий ревматоидный артрит.

(33) Способ лечения и/или профилактики аномального метаболизма костной ткани, характеризующийся введением по меньшей мере одного из антител или функциональных фрагментов антител по пунктам (1)-(26).

(34) Способ лечения и/или профилактики аномального метаболизма костной ткани, отличающийся одновременным или последовательным введением по меньшей мере одного из антител или функциональных фрагментов антител по пунктам (1)-(26) и по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из бисфосфонатов, активного витамина D₃, кальцитонина и его производных, гормональных препаратов, таких как эстрадиол, SERM (селективных модуляторов рецепторов эстрогена), иприфлавона, витамина K₂ (менатетренона), препаратов кальция, препаратов PTH (паратиреоидного гормона), нестероидных противовоспалительных средств, препаратов растворимого рецептора TNF, антител против TNF-α или функциональных фрагментов этих антител, анти-PTHrP (белка, родственного паратиреоидному гормону) антител или функциональных фрагментов этих антител, антагонистов рецептора IL-1, антител против рецептора IL-6 или функциональных фрагментов таких антител, антител против RANKL или функциональных фрагментов таких антител и OCIF (фактора, ингибирующего остеокластогенез).

(35) Способ лечения и/или профилактики по пункту (33) или (34), отличающийся тем, что аномальный метаболизм костной ткани представляет собой остеопороз, деструкцию кости, сопровождающую ревматоидный артрит или деструкцию кости, сопровождающую злокачественное метастазирование в костную ткань.

(36) Способ лечения и/или профилактики по пункту (35), отличающийся тем, что остеопороз представляет собой постменопаузный остеопороз, сенильный остеопороз, вторичный остеопороз вследствие применения таких терапевтических средств, как стероиды или иммунодепрессанты, или остеопороз, сопровождающий ревматоидный артрит.

(37) Гибридома #32A1 (FERM BP-10999).

(38) Гибридома #41B1 (FERM BP-11000).

Преимущество изобретения

В соответствии с настоящим изобретением может быть получено терапевтическое и/или профилактическое средство для лечения аномального метаболизма костной ткани, механизмом действия которого является ингибирование дифференцировки и созревания остеокластов и их активности.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показаны графики, демонстрирующие анализ профиля экспрессии для генов RANK, RANKL, катепсина K и TRAP в тканях гигантоклеточной остеобластомы у людей.

На фиг. 2 показан график, демонстрирующий анализ профиля экспрессии для гена Siglec-15 в тканях гигантоклеточной остеобластомы у людей.

На фиг. 3 показан график, демонстрирующий изменение уровня экспрессии гена Siglec-15 в тех случаях, когда дифференцировка остеокластов была индуцирована из клеток RAW 264.7 или клеток костного мозга мышей.

На фиг. 4 показаны графики, демонстрирующие экспрессию генов катепсина K и TRAP, сопровождающую остеокластную дифференцировку клеток RAW 264.7.

На фиг. 5 показан график, демонстрирующий экспрессию гена Siglec-15, сопровождающую остеокластную дифференцировку клеток RAW 264.7.

На фиг. 6 показаны результаты определения изменения экспрессии мышиного Siglec-15-His в клетках 293F в зависимости от времени культивирования с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинга, с использованием антитела против 6-His-HRP.

На фиг. 7 показаны результаты определения изменения экспрессии мышиного Siglec-15-Fc в клетках 293F в зависимости от времени культивирования с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинга, с использованием антитела против IgG-Fc-HRP человека.

На фиг. 8 показаны результаты оценки чистоты мышиного Siglec-15-His, очищенного с помощью колоночной хроматографии HisTrap HP и хроматографии на колонке Resource Q, посредством электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и окрашивания серебром.

На фиг. 9 показаны результаты определения поведения мышиного Siglec-15-His, очищенного с помощью колоночной хроматографии HisTrap HP и колоночной хроматографии Resource Q, посредством электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинга, с использованием антитела против V5-HRP.

На фиг. 10 показаны результаты оценки чистоты мышиного Siglec-15-Fc, очищенного с помощью хроматографии на колонке HiTrap с Белком A, посредством электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и окрашивания серебром.

На фиг. 11 показаны результаты подтверждения того, что очищенное поликлональное антитело против мышиного Siglec-15 связывается не только с Siglec-15-Fc, а также с Siglec-15-His с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и Вестерн блоттинга, с использованием поликлонального антитела против мышиного Siglec-15 и антитела против кроличьего IgG-HRP.

На фиг. 12 показана хроматограмма поликлонального антитела против Siglec-15 мыши, очищенного с помощью аффинной колонки, с иммобилизованным на ней мышиным Siglec-15-Fc.

На фиг. 13 показаны результаты оценки чистоты мышиного Siglec-15-Fc, очищенного с помощью хроматографии, с использованием аффинной колонки с иммобилизованным на ней Siglec-15-Fc мыши.

На фиг. 14 показаны хроматограммы поликлональных антител против Siglec-15 мыши, очищенных с помощью гель-фильтрационной колонки на Сефарозе 6.

На фиг. 15 показаны результаты тестирования действия аффинно-очищенного поликлонального антитела против Siglec-15 мыши на остеокластную дифференцировку (стимуляция действием RANKL) мышиных неадгезивных клеток костного мозга (N=3).

На фиг. 16 показаны результаты тестирования действия добавления очищенного гель-фильтрацией поликлонального антитела против мышиного Siglec-15 на остеокластную дифференцировку (стимуляция действием RANKL) неадгезивных клеток костного мозга мыши, исходя из ферментативной активности TRAP (N=3).

На фиг. 17 показаны результаты тестирования нейтрализации антигеном ингибирования остеокластной дифференцировки (стимуляция действием RANKL) неадгезивных клеток костного мозга мыши путем добавления поликлонального антитела против Siglec-15 мыши, исходя из ферментативной активности TRAP (N=3).

На фиг. 18 показаны результаты тестирования действия добавления поликлонального антитела против Siglec-15 мыши на остеокластную дифференцировку (стимуляция действием TNF-α) неадгезивных клеток костного мозга мыши, исходя из ферментативной активности TRAP (N=3).

На фиг. 19 показаны микрофотографии, используемые для оценки действия добавления поликлонального антитела против Siglec-15 мыши на остеокластную дифференцировку (стимуляция действием TNF-α) мышиных неадгезивных клеток костного мозга путем окрашивания TRAP.

На фиг. 20 показаны графики, демонстрирующие, исходя из ферментативной активности TRAP, ингибирование остеокластной дифференцировки (стимуляция активным витамином D₃) из мышиных клеток костного мозга путем добавления поликлонального антитела против Siglec-15 мыши (N=6).

На фиг. 21 показаны микрофотографии, демонстрирующие посредством окрашивания TRAP, ингибирование образования гигантских остеокластов (стимуляция активным витамином D₃) из мышиных клеток костного мозга путем добавления поликлонального антитела против Siglec-15 мыши.

На фиг. 22 показаны микрофотографии, демонстрирующие посредством окрашивания TRAP ингибирование образования гигантских остеокластов (стимуляция под действием RANKL человека) из мышиных клеток костного мозга путем добавления поликлонального антитела против Siglec-15 мыши.

На фиг. 23 показаны микрофотографии, демонстрирующие посредством окрашивания TRAP ингибирование образования гигантских остеокластов (стимуляция под действием RANKL человека) из клеток RAW 264.7, путем добавления поликлонального антитела против Siglec-15 мыши и отмену ингибирующего действия под действием растворимого Siglec-15.

На фиг. 24 показаны результаты тестирования связывания крысиного моноклонального антитела против Siglec-15 мыши на планшете с иммобилизованным на нем мышиным Siglec-15-Fc с помощью ELISA. Знак (◆) означает антитело #1A1, знак (■) означает антитело #3A1, знак (▲) означает антитело #8A1, знак (×) означает антитело #24A1, знак (●) означает антитело #32A1, знак (○) означает антитело #34A1, знак (+) означает антитело #39A1, знак (-) означает антитело #40A1, знак (―) означает антитело #41B1, знак (◇) означает антитело #61A1 и знак (□) означает контрольный IgG.

На фиг. 25 показаны результаты тестирования эффекта добавления моноклонального антитела (#3A1, #8A1 или #32A1) против Siglec-15 мыши на остеокластную дифференцировку (стимуляцию под действием RANKL) мышиных неадгезивных клеток костного мозга. Контрольный IgG крысы на этой фигуре является отрицательным контролем, общим для фиг.25 и 26.

На фиг. 26 показаны результаты тестирования эффекта добавления моноклонального антитела (#34A1, #39A1 или #40A1) против Siglec-15 мыши на остеокластную дифференцировку (стимуляция под действием RANKL) мышиных неадгезивных клеток костного мозга. Кроличье поликлональное антитело № 3 против Siglec-15 мыши на этой фигуре является положительным контролем, общим для фиг.25 и 26.

На фиг. 27 показаны графики, демонстрирующие изменение в экспрессии генов катепсина К, TRAP или Siglec-15 в тех случаях, когда остеокластная дифференцировка была индуцирована из нормальных клеток-предшественников остеокластов человека.

На фиг. 28 показаны результаты проверки чистоты белка человека Siglec-15-His, очищенного колоночной хроматографией HisTrap HP и хроматографией на колонке Resource Q, посредством электрофореза в SDS-полиакриламидном геле.

На фиг. 29 показаны результаты проверки чистоты белка человека Siglec-15-Fc, очищенного с помощью колоночной хроматографии на Белке А, посредством электрофореза в SDS-полиакриламидном геле.

На фиг. 30 показаны хроматограммы поликлональных антител против Siglec-15 человека, очищенных с помощью аффинной колонки с иммобилизованным на ней белком человека Siglec-15-Fc.

На фиг. 31 показаны микрофотографии, демонстрирующие посредством окрашивания TRAP ингибирование образования гигантских остеокластов из нормальных клеток-предшественников остеокластов человека путем добавления поликлонального антитела против Siglec-15 человека.

На фиг. 32 показаны результаты оценки действия добавления поликлонального антитела против Siglec-15 человека на формирование многоядерных остеокластов из нормальных клеток-предшественников остеокластов человека путем подсчитывания числа TRAP-позитивных клеток, имеющих 5 или более ядер, с помощью инвертированного микроскопа.

На фиг. 33 показаны результаты тестирования связывания крысиного моноклонального антитела против Siglec-15 мыши на планшете с иммобилизованными на нем белком человека Siglec-15-Fc с помощью ELISA. Знак (◆) означает антитело #1A1, знак (■) означает антитело #3A1, знак (▲) означает антитело #8A1, знак (×) означает антитело #24A1, знак (●) означает антитело #32A1, знак (○) означает антитело #34A1, знак (+) означает антитело #39A1, знак (-) означает антитело #40A1, знак (―) означает антитело #41B1, знак (◇) означает антитело #61A1 и знак (□) означает контрольный IgG.

На фиг. 34 показаны микрофотографии, демонстрирующие путем окрашивания TRAP ингибирование образования гигантских остеокластов из нормальных клеток-предшественников остеокластов человека путем добавления крысиного моноклонального антитела против Siglec-15 мыши.

На фиг. 35 показаны микрофотографии, демонстрирующие посредством окрашивания TRAP ингибирование образования гигантских остеокластов из нормальных клеток-предшественников остеокластов человека путем добавления крысиного моноклонального антитела против Siglec-15 мыши (антитело #32A1).

На фиг. 36 показан график, демонстрирующий ингибирование активности нормальных остеокластов человека в отношении резорбции костной ткани путем добавления крысиного моноклонального антитела против Siglec-15 мыши (антитело #32A1) (N=6).

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Термин «ген», используемый в контексте настоящего изобретения, включает не только ДНК, а также мРНК, кДНК и кРНК.

Термин «полинуклеотид», используемый в контексте настоящего изобретения, используется в том же значении, что и нуклеиновая кислота, а также включает ДНК, РНК, зонды, олигонуклеотиды и праймеры.

Термины «полипептид» и «белок», используемые в контексте настоящего изобретения, используются без различия.

Термин «фракция РНК», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к фракции, содержащей РНК.

Термин «клетка», используемый в контексте настоящего изобретения, также включает клетки отдельных животных и культивированные клетки.

Термин «Siglec-15», используемый в контексте настоящего изобретения, используется в том же значении, что и белок Siglec-15.

Термин «образование остеокластов», используемый в контексте настоящего изобретения, используется в том же значении, что и «остеокластная дифференцировка» или «созревание остеокластов».

Термин «функциональный фрагмент антитела», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к неполному фрагменту антитела, обладающему антиген-связывающей активностью, и включает Fab, F(ab')2, scFv и подобные. Этот термин также охватывает Fab', который является одновалентным фрагментом в вариабельной области антитела, полученного путем обработки F(ab')2 в редуцирующих условиях. Однако этот термин не ограничивается этими молекулами, при условии, что этот фрагмент обладает аффинностью связывания в отношении антигена. Далее, эти функциональные фрагменты включают не только фрагмент, полученный обработкой полноразмерной молекулы белка антитела соответствующим ферментом, а также белок, полученный в соответствующей клетке-хозяине, с использованием генетически модифицированного гена антитела.

Термин «эпитоп», используемый в контексте настоящего изобретения, относится к части пептида Siglec-15, с которым связывается специфичное антитело против Siglec-15. Упомянутый выше эпитоп, который представляет собой часть пептида Siglec-15, может быть определен способами, хорошо известными специалистам в данной области, например иммуноанализом. Альтернативно, например, может быть использован следующий способ. Получают различные отдельные структуры Siglec-15. В получении отдельных структур может быть использована известная методика олигопептидного синтеза. Например, серии полипептидов, имеющих соответствующим образом уменьшенную длину, полученных последовательным укорочением Siglec-15 с С-конца или N-конца, получают, используя метод генной рекомбинации, известный специалистам в данной области. После этого проверяют реакционную способность антитела в отношении этих полипептидов и приблизительно определяют сайт узнавания. Затем синтезируют полипептиды более короткой длины и проверяют реакционную способность этих пептидов, тем самым можно выявить эпитоп. В случаях, если второе антитело против Siglec-15 связывается с частью пептида, с которой связывается первое антитело против Siglec-15, можно определить, что первое антитело и второе антитело делят между собой один и тот же эпитоп. Далее, путем подтверждения того, что второе антитело против Siglec-15 конкурирует с первым антителом против Siglec-15 за связывание с Siglec-15 (то есть второе антитело ингибирует связывание между Siglec-15 и первым антителом), можно определить, что первое антитело и второе антитело делят один и тот же эпитоп, даже если специфическая последовательность эпитопа не была определена. Далее, в тех случаях, когда первое антитело и второе антитело связываются с одним и тем же эпитопом, а также первое антитело обладает специфическим действием, например антиген-нейтрализующей активностью, можно предположить, что второе антитело обладает такой же активностью.

Выражение «гибридизацию проводят в строгих условиях», используемое в контексте настоящего изобретения, относится к гибридизации, проводимой в условиях, при которых идентификация может быть выполнена путем проведения гибридизации при 68°C в коммерчески доступном гибридизационном растворе, гибридизационном растворе ExpressHyb Hybridization (производство Clontech, Inc.) или проведения гибридизации при 68°C в присутствии 0,7-1,0 M NaCl с использованием фильтра с иммобилизованной на нем ДНК, с последующим промыванием при 68°C, используя 0,1-2×SSC раствор (1×SSC раствор состоит из 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия), или в условиях, эквивалентных этим.

1. Siglec-15

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ген Siglec-15 специфично экспрессируется в гигантоклеточных остеобластомах, а также обнаружили, что уровень экспрессии гена Siglec-15 повышается в тех случаях, когда моноцитарная клеточная линия дифференцируется в остеокласты.

Что касается Siglec-15, используемого в настоя