Гуманизированные антитела к -амилоидному пептиду

Гуманизированные антитела к -амилоидному пептиду

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области технологии антител, конкретнее к области гуманизированных антител к бета-амилоидному пептиду.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой нейродегенеративную болезнь, связанную с возрастом, которая в 2006 году поразила 26,6 миллионов человек. Прогноз предполагает, что распространенность увеличится в четыре раза к 2050, к этому времени 1 из 85 человек во всем мире будет жить с этой болезнью (Brookmeyer et al. (2007)). БА проявляется как прогрессирующие когнитивные расстройства, такие как потеря памяти и снижение умственных способностей.

Центральным в патогенезе БА является накопление бета-амилоидного пептида (Абета) в мозге. Абета представляет собой продукт расщепления белка-предшественника амилоида (АРР), который последовательно расщепляется в амилоидогенном пути сначала с помощью β-секретазы, а затем γ-секретазы. Получаются фрагменты Абета различного размера, при этом пептид из 40 аминокислот (Абета₄₀) является наиболее преобладающей формой, и, как полагают, пептид из 42 минокислот, так называемый Абета₄₂, является самой вредной формой. Абета может накапливаться во внеклеточном пространстве мозга, где он агрегирует в многоступенчатом процессе с образованием нейротоксических олигомеров и, в конечном счете, вместе с другими веществами приводит к образованию амилоидных бляшек, которые являются типичным признаком болезни Альцгеймера.

Перспективным клиническим иммунологическим подходом к лечению болезни Альцгеймера является пассивная иммунизация, при которой антитела к Абета вводят субъекту, для того чтобы удалить Абета из мозга. Предлагается три различных механизма для выведения Абета с помощью анти-Абета антител, которые не являются взаимно исключающими: (1) каталитическое превращение фибриллярного Абета в менее токсичные формы (Bard et al. (2000); Bacskai et al. (2001); Frenkel et al. (2000)); (2) опсонизация отложений Абета, приводящая к микроглиальному фагоцитозу (Bard et al. (2000); Bacskai et al. (2002); Frenkel et al. (2000); и (3) стимулирование выхода Абета из мозга в кровообращение (DeMattos et al. (2001)), так называемая гипотеза периферического стока.

Mohajera et al. (2004) и Gaugler et al. (2005) из Университета в Цюрихе сделали мышиные антитела к Абета и исследовали биоактивность моноклональных мышиных анти-Абета антител in vivo.

Однако при введении людям мышиные антитела часто приводят к иммуногенности. Вызванный антиглобулиновый ответ ограничивает клиническую пригодность мышиных антител (Miller et al. (1983); Schroff et al. (1985)).

Следовательно, существует необходимость в новых, неиммуногенных и эффективных антителах для лечения и/или диагностирования расстройств, связанных с Абета, в частности болезни Альцгеймера.

Раскрытие изобретения

Следовательно, главной целью изобретения является предоставление антитела, которое специфически связывается с Абета, в частности с С-концевой частью Абета, и которое хорошо переносится иммунной системой человека.

В первом аспекте изобретение предоставляет изолированное антитело, которое селективно связывается с Абета в его С-концевой области, в частности между аминокислотами с 30 по 40 (SEQ ID NO:26), и является гуманизированным или полностью человеческим. Данное антитело демонстрирует высокое сродство и к Абета₄₂ и к Абета₄₀ и, кроме того, в основном не распознает белок-предшественник амилоида (АРР) in vivo.

Преимущество так называемых гуманизированных антител заключается в их способности вызывать, как правило, минимальный ответ или не вызывать ответ иммунной системы человека, таким образом они могут рассматриваться, как являющиеся низкоиммуногенными или неиммуногенными при применении у человека. Поэтому, в противоположность мышиным антителам, гуманизированные антитела пригодны для терапевтических целей и клинического применения.

Термин "гуманизация" относится к хорошо отработанным способам, которые уменьшают иммуногенность ксеногенных (чужеродных) антител. Гуманизированное антитело генетически разрабатывается так, что в нем присутствует как можно меньше структуры, не относящейся к человеку. Одна стратегия основана на прививке гипервариабельных участков (CDR) ксеногенного антитела на вариабельную легкую цепь VL и вариабельную тяжелую цепь VH человеческого акцепторного каркасного участка. По другой стратегии, каркасный участок ксеногенного антитела видоизменяют относительно каркасного участка человека. В обоих случаях, сохранение функциональности антигенсвязывающих частей является обязательным. Для указанной цели, анализируют трехмерные модели родительских последовательностей и различные концептуальные гуманизированные продукты, например с помощью использования компьютерных программ для молекулярного моделирования, которые хорошо известны специалистам. Данный анализ дает возможность, помимо прочего, установить остатки каркасного участка, вероятно вовлеченные прямо или косвенно в связывание антигена. Во многих случаях небольшое число остатков каркасного участка донора является важным для связывания антигена, так как они вступают в прямой контакт с антигеном, или они оказывают влияние на конформацию отдельных CDR (Davies et al (1990); Chothia et al (1987)). Поэтому, если (изменения) уже не присутствуют, желательно видоизменить соответствующие остатки акцепторного каркасного участка относительно тех остатков донорского каркасного участка, которые установлены как существенные для связывания антигена. Также возможно, что гуманизированные антитела содержат остатки, которые не обнаружены ни в репертуаре зародышевой линии человека in vivo, ни в CDR донора или даже каркасном участке донора.

Степень гуманизации антитела может быть установлена вычислением процента идентичности последовательности каркасного участка гуманизированного антитела относительно первичного человеческого акцепторного каркасного участка, который был использован для создания гуманизированного антитела и который доступен из человеческой библиотеки. Предпочтительно, антитело изобретения содержит каркасный участок с идентичностью, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно (в следующем порядке) по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% идентичностью в отношении к каркасному участку, полученному из человеческой библиотеки. В контексте настоящего изобретения термины "определяющие комплементарностъ участки (гипервариабельные участки)" или "CDR" относятся к определяющим комплементарность участкам антитела, которое состоит из антигенсвязывающих петель, как определено Kabat et al. (1991). CDR и остатки каркасного участка настоящего изобретения определены согласно формулировке Kabat (Kabat et al. (1987).

Термин "антитело" при использовании здесь относится к полноразмерным антителам, являющимся, например, моноклональными антителами, и любому антигенсвязывающему фрагменту или его одиночной цепи с достаточной связывающей способностью относительно выбранного антигена. Примеры антигенсвязывающих фрагментов, охваченных настоящим изобретением, включают Fab фрагменты, F(ab')2фрагменты, Fd фрагменты, Fv фрагменты; отдельные домены или dAb фрагменты, выделенные гипервариабельные участки (CDR); комбинацию из двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть соединены с помощью синтетического линкера, и одиночную цепь вариабельных фрагментов (scFv). "Полноразмерные антитела" включают химерные антитела, в которых антигенсвязывающий вариабельный домен одного происхождения соединен с константным доменом другого происхождения, например, вариабельный домен Fv мышиного антитела с константным доменом Fc человеческого антитела.

Вышеперечисленные фрагменты антител получают с помощью обычных методов, известных специалистам в данной области техники, причем фрагменты подвергают отбору на пригодность аналогичным образом, как интактные антитела.

В настоящем изобретении CDR происходят от моноклонального мышиного антитела 22С4 (Mohajeri et al. (2002), J. Biol. Chem. 277, pp.33012-33017 и Neurodegenerative Dis. 1 (2004), pp.160-167). Указанное мышиное антитело направлено к С-концевой части Абета, конкретнее к эпитопу в пределах аминокислот с 30 по 40 (SEQ ID NO:26).

В предпочтительном варианте осуществления антитело предотвращает олигомеризацию Абета, в частности Абета₄₀ и/или Абета₄₂, посредством связывания с его мишенью.

Настоящее изобретение предоставляет антитело, которое содержит одну или более последовательностей гипервариабельных участков (CDR) с идентичностью, по меньшей мере, 80% относительно последовательности из числа группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6.

Как уже упоминалось, CDR настоящего изобретения, а именно SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, могут быть привиты на подходящие акцепторные каркасные участки. Термин "каркасные участки" относится к принятым в данной области техники частям вариабельной области антитела, которые находятся между более дивергентными CDR участками. Такие каркасные участки обычно называются каркасными участками с 1 по 4 (FR1, FR2, FR3 и FR4) и обеспечивают каркас для удерживания в трехмерном пространстве; три CDR обнаружены в тяжелой или легкой цепи вариабельной области антитела, так что CDR могут образовывать антигенсвязывающую поверхность. Подходящими акцепторными каркасными участками являются предпочтительно участки происходящих из иммуноглобулинов антигенсвязывающих полипептидов, которые хорошо известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются этим, VhH домены, V-NAR домены, Vh домены. Fab, scFv, Bis-scFv, IG верблюда, IfNAR, IgG, Fab2, Fab3, миниантитела, диантитела, триантитела и тетраантитела (см. Holliger, P. и Hudson, P. (2005), Nat. Biotechnol. 23(9), pp.1126-1136). Каркасная последовательность также может быть консенсусной последовательностью последовательности каркасного участка человека.

Антитело выбирают из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, причем антитело может содержать последовательности более чем одного класса или изотипа.

Предпочтительно, антитело содержит каркасный участок с идентичностью, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно (в следующем порядке) по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно 95% или даже идентичностью 100% относительно каркасного участка, доступного из человеческой библиотеки.

Антитело настоящего изобретения представляет собой рекомбинантную молекулу, так как CDR могут быть привиты на человеческий каркасный участок, причем полученное антитело содержит нечеловеческие CDR и человеческий или в основном человеческий каркасный участок. Альтернативно, антитело получают из нечеловеческого антитела и его каркасный участок видоизменяют в сторону человеческого антитела. Обе альтернативы включены с помощью термина "доступный из человеческой библиотеки".

В одном варианте настоящего изобретения антитело представляет собой scFv антитело. Антитело scFv может быть или полноразмерным scFv, содержащим VL и VH домены, которые соединены коротким линкерным пептидом, например, линкером, содержащим от 1 до 4 повторов последовательности GGGGS, предпочтительно (GGGGS)₄ пептидом (SEQ ID NO:25), или линкером, как раскрыто в работе Alfthan et al. (1995) Protein Eng. 8:725-731, или просто VL или VH домен, который обладает достаточной связывающей способностью для выбранного антигена. Соединение VL и VH может быть в любой ориентации, VL-линкер-VH или VН-линкер-VL.

В одном варианте каркасный участок scFv является стабильным и растворимым в восстановительной среде. Эти характеристики можно установить с помощью так называемой Системы контроля качества, как раскрыто в WO 01/48017. Стабильность указанных антител предпочтительно составляет, по меньшей мере, фактически половину особенно стабильного лямбда-графта (lambda graft), более предпочтительно, по меньшей мере, почти лямбда-графта и наиболее предпочтительно лучше, чем лямбда-графта. Wörn et al. (2000) описывают начало денатурации лямбда-графта, происходящей около 2,0М GdnHCl. Было показано, что scFv, которые выполнены правильно в Системе контроля качества, также являются стабильными и растворимыми в окислительных условиях. В предпочтительном варианте, растворимость антитела изобретения, как измерено по способу Atha и Ingham (1981), составляет, по меньшей мере, 5 мг/мл, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 мг/мл и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 20 мг/мл.

В дополнительном предпочтительном варианте антитело содержит каркасный участок фрагмента вариабельной легкой цепи (V_L), который является идентичным или происходит от последовательностей каркасного участка, включенных в группу, состоящую из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16. В случае полученной (derived) последовательности, указанная последовательность показывает идентичность, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно (в следующем порядке) по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% идентичность относительно последовательности из числа группы, состоящей из SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16.

В дополнительном предпочтительном варианте антитело настоящего изобретения содержит каркасный участок фрагмента вариабельной тяжелой цепи (V_H), который является идентичным или происходит от последовательностей каркасного участка, включенных в группу, состоящую из SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:23. В случае полученной последовательности, указанная последовательность показывает идентичность, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно (в следующем порядке) по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, и наиболее предпочтительно 95% или даже 100% идентичность с последовательностью из числа группы, состоящей из SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:23.

Последовательности SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22 и SEQ ID NO:23 раскрыты в WO 03/097697. Эти последовательности каркасных участков, происходящие из человеческих иммуноглобулинов, и их характеристики растворимости и стабильности при восстановительных условиях были доказаны в так называемой Системе контроля качества, как раскрыто в WO 01/48017.

Более предпочтительно антитело содержит VH фрагмент SEQ ID NO:7 и VL последовательность SEQ ID NO:17.

Наиболее предпочтительно антитело имеет последовательность, являющуюся идентичной, по меньшей мере, на 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 75%, 80%, 90%, 95% идентичную SEQ ID NO:24. В наиболее предпочтительном варианте антитело настоящего изобретения структурно определяется SEQ ID NO:24. В указанном антителе SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:17 связаны через (GGGGS)4 линкер. Полученное scFv антитело было названо ESBA212.

Специалистам в данной области техники будет понятно, что последовательности изобретения можно изменить так, что они будут отличаться в аминокислотной последовательности от раскрытых здесь последовательностей, несмотря на сохранение способности селективного связывания с С-концевой частью Абета. Следовательно, ни каркасный участок, ни CDR участки гуманизированного антитела не нуждаются в точном соответствии донорному CDR или акцепторному каркасному участку. Изменения в этом отношении могут быть созданы введением одной или более нуклеотидных замен, вставок или делеций в нуклеотидную последовательность антитела с помощью стандартных методов, таких как сайт-направленный мутагенез и PCR-опосредованный мутагенез. Такие мутации могут быть введены с разными целями, например, для улучшения характеристик связывания, растворимости или стабильности антитела. Антитела изобретения также могут содержать консервативные аминокислотные замены в одном или более несущественных аминокислотных остатках. В другом варианте осуществления мутации могут быть введены случайно по всей или части кодирующей последовательности, например с помощью насыщающего мутагенеза, и получающиеся в результате мутанты могут быть отобраны по их способности связываться с желательной мишенью.

Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, общих (перекрывающихся) для последовательностей, принимая во внимание число пропусков, и длину каждого пропуска, которые нужно ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществить с помощью математического алгоритма, который хорошо известен специалистам в данной области техники. Упоминаемые в данном описании идентичные последовательности были определены с помощью программ BLAST (Basic Local Alignment Search Tools; see Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J Mol. Biol. 215: 403-410), доступных в Интернете. Поиск белков BLAST может быть осуществлен с помощью программы XBLAST (счет =50, длина слова =3) для сравнения аминокислотных последовательностей с белковыми молекулами изобретения. Чтобы получить выравнивания, содержащие разрывы, для сравнительных целей, можно использовать программу Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. При применении программ BLAST и Gapped BLAST могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).

Белковые последовательности настоящего изобретения могут дополнительно использоваться как "запросная последовательность" для проведения поиска в общедоступных базах данных, например, для установления родственных последовательностей. Такие поиски можно выполнить с помощью вышеупомянутых программ XBLAST (версия 2.0).

Гуманизированные или полностью человеческие антитела, включенные в настоящее изобретение, показывают следующие характеристики:

(i) связывание с С-концом Абета, таким образом, связывание и с Абета₄₀, и с Абета₄₂ с высокой и, по существу, одинаковой аффинностью;

(ii) проявление высокой аффинности к олигомерным или мономерным формам Абета;

(iii) в основном отсутствие распознавания белка-предшественника амилоида (АРР) in vivo;

(iv) обладание растворимостью, по меньшей мере, 5 мг/мл, предпочтительно, по меньшей мере, 10 мг/мл и более предпочтительно, по меньшей мере, 20 мг/мл; и

(v) проявление низкой иммуногенности или отсутствие иммуногенности при применении у человека.

Кроме того, антитело предпочтительно показывает, по меньшей мере, одну, более предпочтительно больше, чем одну, наиболее предпочтительно все из следующих характеристик:

(vi) опосредование поглощения фибриллярного Абета микроглией;

(vi) связывание бета-амилоидных бляшек;

(vii) удаление бета-амилоидных бляшек в мозге и/или предотвращение образования амилоидных бляшек в мозге;

(viii) уменьшение токсичности Абета и связанной с этим уязвимости нейронов к эксайтотоксическим событиям, вызванным судорожными припадками;

(ix) проникновение через гематоэнцефалический барьер; и/или

(х) по существу восстановление нормального поведения;

(xi) удаление бета-амилоидных фибрилл в мозге и/или предотвращение образования амилоидных фибрилл в мозге.

Антитело настоящего изобретения по существу не распознает белок-предшественник амилоида (АРР) in vivo. Предпочтительно, аффинность связывания с Абета представляет собой фактор, по меньшей мере, в два, более предпочтительно, по меньшей мере, в 5, даже более предпочтительно, по меньшей мере, в 10, особенно предпочтительно, по меньшей мере, в 50, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз больше по сравнению с аффинностью связывания для АРР.

Таким образом, при введении антитела субъекту, АРР не конкурирует с Абета за связывание, и антитело не препятствует биологии нерасщепленного АРР. Эта особенность является интересной, например, в частности, для диагностических целей и/или медицинского лечения неврологических расстройств, связанных с ненормальным накоплением и/или отложением Абета в центральной нервной системе.

Термин "неврологическое расстройство" при использовании здесь включает, но не ограничивается этим, болезнь Альцгеймера, умеренное когнитивное нарушение, афазию, лобно-височную деменцию, болезнь телец Леви, болезнь Паркинсона, болезнь Пика, болезнь Бинсвангера, церебральную амилоидную ангиопатию, синдром Дауна, мультиинфарктную деменцию, болезнь Хантингтона, болезнь Крейтцфельда-Якоба, комплексное умственное расстройство при СПИДе, депрессию, тревожное расстройство, фобию, неврит лицевого нерва, эпилепсию, энцефалит, рассеянный склероз; нервно-мышечные расстройства, нейроонкологические расстройства, опухоли мозга, нервно-сосудистые расстройства, включая инсульт, нейро-иммунологические расстройства, нейроотологическую болезнь, травму нервной системы, включая повреждение спинного мозга, боль, включая нейропатическую боль, педиатрические неврологические и нейропсихиатрические расстройства, нарушения сна, синдром Туретта, умеренное когнитивное нарушение, сосудистую деменцию, мультиинфарктную деменцию, кистозный фиброз, болезнь Гоше, другие нарушения движения, глаукому и болезнь центральной нервной системы (ЦНС) в общем. Более предпочтительно антитело настоящего изобретения используют при лечении, предотвращении, замедлении прогрессирования или при диагностировании болезни Альцгеймера, инсульта, травмы нервной системы и глаукомы.

В другом аспекте антитело настоящего изобретения является химически модифицированным. Химические модификации могут изменять такие свойства антитела, как стабильность, растворимость, антигенсвязывающая специфичность или аффинность, время полужизни in vivo, цитотоксичность и способность проникновения в ткани. Химические модификации хорошо известны специалистам в данной области. Предпочтительной химической модификацией антитела настоящего изобретения является пегилирование (присоединение полиэтиленгликоля, ПЭГ).

В одном варианте осуществления антитело конъюгировано с терапевтическим средством, например, токсином или химиотерапевтическим соединением. Антитело может быть конъюгировано с радиоизотопом, таким как, но не ограничиваясь этим, ²¹²Bi, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹²Bi, ²¹²At, ²¹¹Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd и ¹⁸⁸Re, например, для иммунотерапии.

В дополнительном варианте осуществления антитело настоящего изобретения может быть соединено с меткой. Указанная метка может дать возможность колориметрического выявления антитела. Альтернативно, антитело является радиомеченым. Наиболее предпочтительно радиометка представляет собой ⁶⁴Cu.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление диагностического или научного средства, содержащего антитело, раскрытое здесь.

Антитело настоящего изобретения можно использовать при диагностировании или проверке субъекта на амилоидоз или болезнь Альцгеймера или при определении у субъекта риска развития амилоидоза или болезни Альцгеймера.

В дополнительном варианте осуществления изобретение, кроме того, включает диагностический способ, содержащий этап введения эффективного количества антитела настоящего изобретения субъекту, предпочтительно млекопитающему. Способ дополнительно включает этап обнаружения метки.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение включает метод иммунологического анализа, содержащий антитело, описанное здесь, в котором исследование может быть in vivo или in vitro иммуноанализом. Антитело может быть использовано в жидкой фазе или связанным с твердой фазой. Примеры таких иммунологических анализов включают радиоиммунологические анализы (RIA), проточную цитометрию, вестерн-блоттинг и микрочипы.

Кроме того, изобретение включает набор для анализа, содержащий антитело, раскрытое здесь.

В предпочтительном варианте осуществления антитело настоящего изобретения опосредует поглощение фибриллярного Абета микроглией, тем самым уменьшая уровни Абета in vivo.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитело настоящего изобретения улучшает при введении эффективного количества когнитивное поведение и сохраняет число незрелых нейронов у субъектов с болезнью Альцгеймера.

Более того, настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию для лечения, предотвращения и/или замедления прогрессирования неврологического расстройства или амилоидоза, характеризующегося ненормальным накоплением и/или отложением Абета в центральной нервной системе, в частности болезни Альцгеймера, содержащую антитело, раскрытое здесь.

В дополнительном варианте осуществления изобретение предоставляет способ производства фармацевтической композиции для лечения, предотвращения и/или замедления прогрессирования вышеупомянутых неврологических расстройств, предпочтительно болезни Альцгеймера, содержащий этап комбинирования антитела, раскрытого здесь, по меньшей мере, с одним подходящим фармацевтическим носителем.

Предпочтительно фармацевтические композиции, раскрытые здесь, предотвращают и/или уменьшают эффект накопления Абета в мозге субъекта.

Антитело может быть введено в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или в комбинации с одним или более дополнительными действующими началами. Действующие начала могут быть небольшими органическими молекулами и/или анти-Абета антителами.

Антитело и/или фармацевтические композиции, раскрытые здесь, могут быть введены разными способами, например, внутривенно, внутрибрюшинно, интраназально, подкожно, внутримышечно, местно или внутрикожно, внутрь черепа, подоболочечно в спинномозговую жидкость. Предпочтительными способами применения являются (в этой последовательности) интраназальное, подкожное, внутривенное, подоболочечное в спинномозговую жидкость и внутричерепное введение.

Как правило, используемые композиции известны квалифицированному специалисту. Например, аэрозольные композиции, такие как назальные спрэи, включают очищенные водные или другие растворы активного вещества с консервантами и изотоническими веществами. Такие композиции предпочтительно устанавливают до значения рН и изотонического состояния, совместимого со слизистыми оболочками носа.

Более того, может быть желательно совместное введение или последовательное введение других веществ. Предпочтительно антитело присутствует в количестве, достаточном для восстановления нормального поведения и/или когнитивных свойств в случае болезни Альцгеймера.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способы лечения, предотвращения и/или замедления прогрессирования неврологической болезни, как упомянуто выше, включающие этап введения эффективного количества антитела настоящего изобретения субъекту, нуждающемуся в этом.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа пассивной иммунизации млекопитающего, включающего этап введения млекопитающему антитела, раскрытого здесь. Предпочтительно, пассивную иммунизацию проводят в рамках анти-Абета иммунотерапии.

В другом варианте осуществления изобретение представляет изолированную нуклеиново-кислотную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности, заключенные в настоящем изобретении. Указанные нуклеиновые кислоты могут быть или ДНК, или РНК и могут быть или одноцепочечными, или двухцепочечными.

Более того, настоящее изобретение предоставляет клонирующий вектор или вектор экспрессии, содержащий последовательность ДНК, кодирующую полипептид, наиболее предпочтительно антитело, настоящего изобретения.

Кроме того, предоставляется подходящая клетка-хозяин, несущая вектор и/или нуклеиново-кислотную последовательность, содержащую последовательность, кодирующую раскрытые здесь аминокислотные последовательности. Это может быть прокариотическая или эукариотическая клетка, в частности E. coli, дрожжевая, растительная, клетка насекомого или млекопитающего.

Антитело настоящего изобретения можно создать с помощью обычных методов в области рекомбинантной молекулярной биологии. Зная последовательности полипептидов, квалифицированный специалист в данной области техники может сделать соответствующие кДНК, кодирующие полипептиды, посредством генного синтеза.

В другом варианте осуществления предоставляется способ получения антитела настоящего изобретения, включающий культивирование клетки-хозяина, трансформированной ДНК, кодирующей указанное антитело, при условиях, которые делают возможным синтез указанного антитела, и извлечение указанной молекулы из указанной культуры. Предпочтительно указанный способ предоставляет антитело scFv, очищенное (выделенное) из телец включения E. coli, или из периплазмы E. coli, если используемая конструкция scFv содержит сигнальную последовательность, которая направляет полипептид в периплазму. Может быть необходимо включение этапа ренатурации, для того чтобы вновь свернуть антитело в функциональную молекулу.

В дополнительном варианте осуществления изобретение предоставляет способ лечения, включающий этап введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина, как описано здесь.

Во втором аспекте настоящее изобретение предоставляет способ диагностирования, включающий этапы:

(i) мечения антитела;

(ii) введения эффективной дозы указанного антитела интраназально или системно субъекту; и

(iii) измерение концентрации и/или обнаружение присутствия меченого антитела в частях тела субъекта.

Антитело является предпочтительно гуманизированным антителом к эпитопу, образованному в пределах аминокислот с 30 по 40 Абета настоящего изобретения, предпочтительно одноцепочечным антителом (scFv). В предпочтительном варианте осуществления антитело метят позитронно-активным изотопом, наиболее предпочтительно ⁶⁴Cu.

Термин "эффективная доза" при использовании здесь относится к количеству, достаточному для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения желательного эффекта, например, различимого сигнала. Количества, эффективные для данного применения, будут зависеть от обнаруживающей силы метки (detective strength), массы тела субъекта и протяженности области, которая должна быть проверена.

Предпочтительно субъект является млекопитающим; более предпочтительно субъект является человеком.

Метод диагностической визуализации, позитронно-эмиссионная томография (PET), который предоставляет трехмерное изображение частей тела, основан на регистрации излучения позитронов. Как правило, биомолекула является радиоактивно-меченой, например она включает радиоактивный изотоп. После введения меченой биомолекулы субъекту, как правило, с помощью введения в кровоток, радиоактивно-меченая биомолекула концентрируется в ткани, представляющей интерес. Затем субъекта помещают в визуализирующий сканер, который обнаруживает излучение позитронов.

В одном варианте осуществления субъекту вводят антитело, меченое ⁶⁴Cu, а этап iii) осуществляют, помещая субъекта в визуализирующий сканер и обнаруживая излучение позитронов.

Изобретение, таким образом, включает способ РЕТ-визуализации, содержащий этап введения ⁶⁴Cu-меченого антитела настоящего изобретения субъекту.

Последовательностями настоящего изобретения являются следующие последовательности. (см. в конце описания)

Если не установлено иначе, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же самое значение, как правило, понятное среднему специалисту в области техники, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то что способы и материалы, сходные или эквивалентные тем, которые описаны здесь, могут быть использованы при применении на практике или проверке настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. В случае конфликта, настоящее подробное описание, включая определения, будет осуществлять контроль. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначаются для ограничения.

Понятно, что различные варианты осуществления, предпочтения и диапазоны можно комбинировать произвольно. Кроме того, в зависимости от конкретного варианта осуществления, некоторые определения, варианты осуществления или диапазоны могут не использоваться.

Краткое описание чертежей

Изобретение будет более понятным и цели, отличные от изложенных выше, станут очевидны, после рассмотрения следующего подробного описания. Такое описание делает ссылки на прилагающиеся рисунки, на которых:

фиг.1 показывает сравнение последовательности вариабельного участка легкой цепи ESBA212 с VL каркасным участком 2.3 (ESBATech), на который были привиты Абета специфические CDR от 22С4;

на фиг.2 показано сравнение последовательности вариабельной тяжелой цепи VH ESBA212 с VH каркасного участка 2.3 (ESBATech);

фиг.3 показывает выравнивание последовательности VH ESBA212 с VH первоначальной VH из мышиного антитела 22С4;

фиг.4 показывает выравнивание последовательности VH ESBA212, 22С4 и каркасного участка;

фиг.5 показывает результаты ex vivo мечения бляшек на мышиной модели БА с помощью ESBA212. Были использованы или парафиновые срезы, или криосрезы (срезы из замороженных тканей) (нефиксированные или пост-фиксированные). Фиг.5А - мышиная модель SwePSI, парафиновый срез; фиг.5В - мышиная модель SwePSI, криосрез; фиг.5С - мышиная модель SweArc, парафиновый срез; фиг.5D - мышиная модель SweArc, криосрез;

фиг.6 описывает результаты ex vivo мечения бляшек в мозге человека с БА с помощью ESBA212. Были использованы или парафиновые срезы, или криосрезы (нефиксированные и пост-фиксированные). Фиг.6А - парафиновый срез; фиг.6В - криосрез, фиксированный ацетоном; фиг.6С - криосрез, необработанный; фиг.6D - криосрез; фиксированный ацетоном, кипяченый в течение 10 мин в нитратном буфере;

фиг.7 показывает ex vivo окрашивание амилоидных бляшек с помощью ESBA212 (фиг.7А) и Тиофлавина S (фиг.7В) на мозговых срезах SwePS1 мышей;

фиг.8 иллюстрирует результаты эксклюзионной хроматографии ESBA212, связанного с FITC-мечеными Абета42 мономерами (фиг.8А), и на фиг.8В контроль, в котором каркасный участок FW2.3 инкубировали с FITC-мечеными Абета42 мономерами;

фиг.9 показывает два Абета42 иммуноблота с использованием гомогенатов мозга трансгенных мышей SwePSI (фиг.9А; дорожка 1: ESBA212, дорожка 2: 6Е10) и ADDL (фиг.9В; дорожка 1: Fw 2.3, дорожка 2: ESBA212, дорожка 3: 6Е10) как антигенов. ESBA212 преимущественно распознает мономеры и слабее триммеры;

фиг.10 - определение аффинности ESBA212 с помощью ELISA (фиг.10А - для Абета40; константа аффинности: 6,26 нМ; и фиг.10В - для Абета42; константа аффинности: 6,31 нМ);

фиг.11 - масс-спектроскопия ESBA212;

фиг.12 представляет спектр FT-IR, показывающий процент разворачивания ESBA212 при разных температурах, в пределах от 25 до 95°С;

фиг.13 - вестерн-блот, показывающий стабильность ESBA212, инкубированного в присутствии (дорожка 1) или отсутствии (дорожка 2) гомогената мозга мыши;

фиг.14 - результат тиофлавин Т-анализа, демонстрирующий, что ESBA212 ингибирует олигомеризацию Абета42 in vitro;

фиг.15 - среднее значение концентраций в сыворотке ESBA212 в течение времени после однократной внутривенной или внутрибрюшинной инъекции;

фиг.16 - обнаружение связанного ESBA212 после интраназального (фиг.16А) или внутривенного (фиг.16В) применения. ESBA212 связывается с амилоидными бляшками в мозге независимо от выбранного способа применения;

фиг.17 - обнаружение связанного ESBA212 в мозге мыши SwePS1 после интраназального применения (фиг.17А), и окрашивание тиофлавином S (фиг.17А), подтверждающее, что ESBA212 связывается с амилоидными бляшками;

фиг.18 - мечение амилоидных бляшек ex vivo ⁶⁴Cu-ESBA212 (фиг.18 В и D) по сравнению с ESBA212 (фиг.18А и С). Фиг.18А и В показывают парафиновые срезы, тогда как фиг.18С и D показывают криосрезы;

фиг.19 - обнаружение связанного ESBA212 и Cu-ESBA212 на срезах мозга мыши (SwePS1) через 24 час и 48 час после интраназального применения. Фиг.19А - ESBA212 после 24 час; фиг.19В - ESBA212 после 48 час; фиг.19С - Cu-ESBA212 после 24 час; и фиг.19D - Cu-ESBA212 после 48 час;

фиг.20 - обнаружение ESBA212 в почке после внутривенного ESBA212 введения;

фиг.21 - дополнительное интраназальное применение, подобное фиг.16А, показывающее Аβ-окрашивание на фиксированных SwePS1 срезах мозга мыши, животное перфузировали 1 час