Ингибитор репродукции вируса гриппа а на основе экстракта базидиального гриба laetiporus sulphureus

Ингибитор репродукции вируса гриппа а на основе экстракта базидиального гриба laetiporus sulphureus

Реферат

Изобретение относится к противовирусным средствам, в частности к ингибитору репродукции вируса гриппа типа А субтипов H5N1 и H1N1, и может быть использовано в медицине, вирусологии и фармакологии.

Вирус гриппа А является самым известным и распространенным из более сотни вирусов, вызывающих инфекционные заболевания верхних дыхательных путей. Ежегодно эпидемии гриппа в мире приводят к 3,5 миллионам случаев тяжелых заболеваний и к 300-500 тыс. случаев со смертельным исходом [CDC 2005. Centers for Disease Control. Prevention and control of influenza recommendations of the advisory committee on immunization practices (ACIP) // MMWR. - 2005. - V.54 (RR08). - P.1-40. Available from URL: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr5408a1.html].

Новые эпидемичные штаммы вируса гриппа А возникают каждые 1-2 года в результате точечных мутаций в двух поверхностных гликопротеинах - гемагглютинине (НА) и нейраминидазе (NA). Используя разнообразие и изменчивость антигенной структуры вирионов, вирус гриппа способен обходить защитные механизмы иммунитета человека, и поэтому длительного иммунитета против вируса нет ни после естественной инфекции, ни после прививания в отличие от натуральной оспы, желтой лихорадки, полиомиелита или кори.

Поэтому в настоящее время борьба с заболеванием основывается на лечении гриппа с применением этиотропных, патогенетических и симптоматических средств. Поиск новых эффективных в отношении гриппа лекарственных веществ является одной из приоритетных задач здравоохранения.

Гриб Laetiporus sulphureus - серно-желтый трутовик - принадлежит к экологической группе дереворазрушающих грибов-базидиомицетов. В природе встречается на живых и сухостойных стволах деревьев лиственных и хвойных пород, у которых вызывает бурую сердцевинную гниль. Известно, что гриб обладает сложным составом различных биологически активных веществ. В плодовых телах присутствуют следующие группы соединений: тритерпены (до 0,5%), фенольные соединения (0,7-4%), аминокислоты (1-6,5%), углеводы: манит (0,5-2,0%), водорастворимые полисахариды (0,5-2,5%), щелочерастворимые полисахариды (24-62%), хитин (2-5%), белки (12,8-45,1%), липиды (0,6-1%), органические кислоты (2-8%), макро- и микроэлементы (3,5-9%). Выделено 2 новых полисахарида: латипоран А и латиглюкан 1. Впервые для данного гриба обнаружено присутствие алкалоидов и природных соединений [Агафонова С.В. Автореф. канд. дис. Изучение химического состава и особенностей накопления биологически активных соединений в плодовых телах Laetiporus sulphureus (Bull., Fr.), Иркутск, 2007. - 22 с.].

Установлено также, что среди вторичных метаболитов, обнаруженных в экстракте из данного гриба, присутствовали такие, как egonol, demethoxyegonol, egonol glucoside [Jordan К. Zjawtony Biologically Active Compounds from Aphyllophorales (Polypore) Fungi. - J. Nat. Prod. - 2004. - № 67(2). - P.300-310].

Природа пигмента лаетипораксантина, определяющего окраску плодовых тел, была изучена в 70-е годы XX столетия. Пигмент по своей структуре отнесен к каротиноидам, среди которых многие характеризуются биологической активностью [Valadon L.R.G., Mummery R.S.A. A new carotenoid from Laetiporus sulphureus I Ann. Bot. - 1969. - Vol.33. - P.879].

На основе глубинного мицелия Laetiporus sulphureus получена биологически активная добавка (БАД) - Летипорин. Пищевая добавка нетоксична и рекомендована в республике Беларусь для восстановления витаминной и минеральной недостаточности, повышения иммунной устойчивости к простудным заболеваниям [Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Гвоздкова Т.С. Новые биологически активные добавки на основе глубинного мицелия базидиальных грибов. Успехи медицинской микологии. - М.: Национальная Академия микологии, 2006. - Т.6. - С.178-181].

Известны антиоксидантная и антимикробная активность гриба Laetiporus sulphureus [Тихонова О.В., Ершова Е.Ю., Лурье Л.М., Куляева В.В., Катруха Г.С., Камзолкина О.В., Ефременкова О.В., Дудник Ю.В. Антимикробные свойства представителей вида Laetiporus sulphureus (Fr.) Bond et sing // Успехи медицинской микологии: под ред. Ю.В. Сергеева. - 2001. - Т.1. - Гл.6. - С.313-315; Тихонова О.В., Лурье Л.М., Ершова Е.Ю., Ефременкова О.В., Дудник Ю.В. Изучение глубинной культуры Laetiporus sulphureus // Современная микология в России. - М., 2002. - С.257; Капич А.Н., Гвоздкова Т.С., Квачева З.Б., Николаева С.Н., Шишкина Л.Н., Галкин С., Кхатакка Н., Конопля Е.Ф., Верещако Г.Г., Ходосовская A.M., Рудковская Я.А. Антиоксидантная, радиопротекторная и антивирусная свойства мицелиального экстракта гриба Laetiporus sulphureus // Успехи медицинской микологии: под ред. Ю.В.Сергеева. - М. - 2004. - Т.3. - С.146; Turkoglu A. Duru M.E., Mercan N., Kivrak I., Gezer К. Antioxidant and antimicrobial activities of Laetiporus sulphurous (Bull.) Murril // Food Chemistry. - 2007. - 101. - P.267-273]. Упоминается в ряду других базидиальных грибов как продуцент соединений, подавляющих развитие вирусных заболеваний растений, например табачной мозаики [патент JP 1272508 (А), 1989].

Известно использование экстракта из культуральной биомассы гриба Laetiporus sulphureus в качестве противовирусного средства в отношении растительных вирусов (патент Японии №1272508, МПК A01N 63/04, опубл. 31.10.1989 г.).

Одним из наиболее близких аналогов (прототипом) является применение водного экстракта из мицелия гриба Laetiporus sulphureus в качестве противовирусного средства в отношении вируса герпеса 1 типа (ВПГ-1). Установлено, что экстракты мицелия этого гриба проявляли активность в отношении вариантов вируса простого герпеса первого типа (ВПГ-1), устойчивых к ингибиторам ацикловиру и фосфоноуксусной кислоте, обладающим высокой избирательностью антивирусного эффекта. Работа проведена на экспериментальной модели герпетической инфекции в перевиваемых культурах клеток глиомы - С-6, полученных из опухоли мозга крысы, а также в клетках почки африканской желтой мартышки - Vero [Квачева З.Б., Капич А.Н., Вотяков В.И., Николаева С.Н. Противовирусная активность экстрактов мицелия базидиального гриба Laetiporus sulphureus / Успехи медицинской микологии. - 2005. - Т.5. - С.271-273]. Для оценки противовирусной активности экстракта мицелия гриба его разводили водой и добавляли в нетоксичных концентрациях в культуры клеток одновременно с инфицированием соответствующим вариантом ВПГ-1. Перед этим определяли максимально переносимую дозу препарата. Противовирусную активность препаратов констатировали по снижению инфекционной активности вируса. При внесении экстракта мицелия в различных концентрациях (0,1%; 0,2%; 0,4% и 0,8%) в инфицированные культуры клеток наблюдали выраженный вирусингибирующий эффект в отношении всех исследованных вариантов ВПГ-1 - чувствительных и резистентных к ацикловиру и фосфоноуксусной кислоте. Вирусингибирующая концентрация экстракта мицелия (0,2% раствор) была в 4 раза меньше его максимально переносимой дозы. Снижение инфекционной активности вируса для разных вариантов ВПГ-1 составляло от 2,8 до 3,2 lgТЦД50/мл.

Однако в прототипе исследовались экстракты, полученные из культивируемого мицелия гриба Laetiporus sulphureus, которые обладают ингибирующей активностью только в отношении вируса герпеса 1 типа (ВПГ-1).

Техническим результатом заявленного технического решения является обеспечение возможности получения средства на основе водного экстракта базидиального гриба Laetiporus sulphureus, обладающего ингибирующим действием в отношении вируса гриппа типа А.

Указанный технический результат достигается тем, что ингибитор репродукции вируса гриппа А представляет собой водный экстракт базидиального гриба Laetiporus sulphureus, полученный путем экстракции биомассы измельченного гриба водой при соотношении 1:1 или 1:2 с последующим удалением нерастворимого осадка.

Биомассу гриба получают из плодовых тел и экстрагируют измельченную биомассу гриба водой при соотношении 1:2 или путем культивирования на жидкой питательной среде на основе овсяного отвара и экстрагируют измельченную биомассу гриба водой при соотношении 1:1.

В предлагаемом изобретении водные экстракты и извлеченные из них полисахариды исследовались с использованием вирусной модели на перевиваемой культуре клеток MDCK, инфицированной штаммами вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Moscow/226/2009 (H1N1)v. С помощью инвертированного микроскопа регистрировали цитопатическое действие (ЦПД) в монослое клеток и определяли наличие или отсутствие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур. После определения 50%-ных инфицирующих доз (ИД₅₀) вируса (в lgТЦД₅₀/мл) в контроле и при инкубировании с препаратами рассчитывали индексы нейтрализации (ИН) вируса in vitro (в lg):

ИН = ИД₅₀контроль - ИД₅₀опыт.

На модели лабораторных мышей, инфицированных штаммами вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Moscow/226/2009 (H1N1)v, по разнице между титрами вируса в гомогенатах легких в контроле и в опыте оценивался индекс подавления продукции (ИПП) вируса под влиянием препарата in vivo.

Ниже приведены примеры 1-3 получения экстрактивных веществ из плодовых тел, мицелия и полисахаридов гриба Laetiporus sulphureus.

Пример 1. Получение экстракта из плодовых тел гриба. 100 г измельченного замороженного плодового тела суспендировали в 200 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживали на кипящей водяной бане 30 мин, освобождали от осадка центрифугированием в течение 40 мин при 10000 об/мин. Содержание сухих веществ составляло 5 мг/мл (образец №08-09). Образец хранился 6 мес при температуре - 20°С.

Пример 2. Получение экстракта из плодовых тел гриба. 200 г измельченного замороженного плодового тела суспендировали в 400 мл стерильной дистиллированной воды и выдерживали на кипящей водяной бане 30 мин, освобождали от осадка центрифугированием в течение 40 мин при 10000 об/мин. Содержание сухих веществ составляло 5 мг/мл (образец №09-12).Образец хранился 1 год при температуре - 20°С.

Пример 3. Получение экстракта из биомассы гриба, полученной культивированием на питательной среде. Использовали 27-суточную культуру гриба, полученную путем культивирования на жидкой питательной среде на основе овсяного отвара в стационарном состоянии. Биомассу гриба в количестве 5 г, отделенную от культуральной жидкости (КЖ) через капроновый фильтр, замораживали, затем измельчали, добавляли 5 мл дистиллированной воды, обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе при амплитуде 24 мкм, доводили объем до 25 мл, центрифугировали 20 минут при 10000 об/мин. Содержание сухих веществ в образце составляло 1 мг/мл (образец №09-61).

Пример 4. Определение противовирусной активности образцов экстракта гриба Laetiporus sulphureus на культуре клеток.

Культура клеток. Для тестирования противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». В стерильном месте суспензию разводили предварительно подогретой до температуры +37°С средой RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, до концентрации 1,0-1,5×10⁵ клеток/мл. По 100 мкл суспензии клеток MDCK вносили в 96-луночные планшеты 12-канальной автоматической пипеткой. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре +37°С, 5% CO₂ и 100% влажности на 2-3 сут до образования клеточного монослоя.

Определение токсичности образца. Для определения токсических доз препаратов экстракты разводили в несколько раз и оценивали наличие токсического действия в монослоях культуры клеток MDCK с помощью инвертированного микроскопа. Для этого делали разведения исходного препарата в 5 раз, в 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз средой RPMI-1640, содержащей 5% сыворотки крови плодов коровы, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре +37°С, 5% СO₂ и 100% влажности на 2 сут. Через 2 сут с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями грибных экстрактов. В качестве контроля использовали монослой культуры клеток MDCK без препарата. Определяли минимально токсическую концентрацию (МТК) и максимально переносимую концентрацию (МПК), равную половине концентрации вещества, не оказывающей на клетки токсического действия. В исследованиях противовирусной активности препаратов использовали МПК или более низкие концентрации.

Определение противовирусной активности образцов in vitro. Для оценки противовирусной эффективности водных экстрактов базидиальных грибов на культуре клеток MDCK использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и штамм пандемического вируса гриппа A/Moscow/226/2009 (H1N1)v из коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», наработанные на 10-суточных куриных эмбрионах (КЭ). Концентрацию вируса в исследуемых образцах определяли путем титрования на КЭ или на клетках MDCK, рассчитывали и выражали в lgЭИД₅₀/мл (десятичных логарифмах 50%-ных эмбриональных инфицирующих доз в мл) или в lgТЦД₅₀/мл (десятичных логарифмах 50%-ных тканевых цитопатических доз в мл) соответственно по методу Спирмана-Кербера. Наработанные и использованные в работе серии вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) со штаммами вируса гриппа хранили при -70°С. Концентрация вируса в вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ) составляла по разным экспериментам от 7,5 до 9,5 lgЭИД₅₀/мл.

Для определения противовирусной активности препаратов in vitro использовали максимально переносимые концентрации (МПК) препаратов. В среде Axcevir-MDCK (Stem Alpha, Франция), содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК (Sigma, США), готовили 8 разведений ВАЖ с десятикратным шагом. Для определения противовирусной активности препаратов на монослой клеток MDCK вносили 50 мкл выбранного разведения препарата и 100 мкл 1-8-го разведений ВАЖ. Клетки инкубировали 2 сут при температуре 37°С в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 сут в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали цитопатическое действие в монослое клеток и определяли наличие вируса гриппа в среде культивирования по реакции гемагглютинации с 1% эритроцитами кур. На основании этого определяли титры вируса гриппа в lgТЦД₅₀/мл в контроле (ИД₅₀ in vitro без препарата) и в опыте (ИД₅₀ in vitro с препаратом), а затем высчитывали индекс его нейтрализации (ИН) под влиянием препарата: ИН = ИД₅₀контроль - ИД₅₀опыт (lg).

В качестве контроля использовали:

1. Контроль клеток MDCK, культивируемых в питательной среде Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина трипсина ТРСК.

2. Контроль репродукции вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) или A/Moscow/226/2009 (H1N1)v с 1 до 8 разведения с десятикратным шагом в клетках MDCK, культивируемых в питательной среде Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК.

Статистическая обработка данных. При расчетах 50% инфицирующих доз в каждом единичном повторе использовали метод Спирмана-Кербера определяли 95%-ный доверительный интервал (I₉₅) и сравнивали по z-критерию. Для нескольких повторов определяли среднее значение показателя (М) и ошибку среднего (m), достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента.

Таблица 1
Результаты противовирусной активности экстракта из плодового тела Laetiporus sulphureus в культуре клеток MDCK, инфицированных A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)
№ препарата и его разведение	Содержание сухого вещества в препарате, мг/мл	Конечная концентрация сухих веществ препарата в культуральной жидкости, мг/мл	Инфекционность вируса (титр ВАЖ) в клетках MDCK (ИД50 в IgTЦД50/мл)	Индекс нейтрализации ИД50конт-ИД50опыт (lg)
08-09 (1:5)	5,0	0,3	2,5	7
Контроль вируса без препарата			9,5	0

В таблице 1 представлены результаты противовирусной активности экстракта из плодового тела гриба (образец 08-09). Следует отметить, что экстракт не оказывал токсического действия на клетки MDCK даже в исходных разведениях.

Как видно из таблицы 1, экстракт из плодового тела в сравнении с контролем проявил высокий ингибирующий эффект в отношении вируса гриппа птиц, индекс нейтрализации составил 7 lg, действующая на вирус доза препарата составляла 0,3 мг/мл.

Несмотря на то что при хранении образца в течение полугода при отрицательной температуре (-20°С) индекс нейтрализации снизился на 2 lg, его противовирусная активность оставалась высокой, индекс нейтрализации вируса составил 5 lg (табл.2).

Таблица 2
Результаты противовирусной активности экстракта из плодового тела Laetiporus sulphureus в культуре клеток MDCK, инфицированных A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) после 6 мес хранения
№ препарата и его разведение	Содержание сухого вещества в препарате, мг/мл	Конечная концентрация сухих веществ препарата в культуральной жидкости, мг/мл	Инфекционность вируса (титр ВАЖ) в клетках MDCK (ИД50 в ТЦД50/мл)	Индекс нейтрализации ИД50конт-ИД50опыт (lg)
08-09 (1:5) хранение 6 мес	5,0	0,3	2,5	5
Контроль вируса без препарата			7,5	0

В таблице 3 представлены результаты противовирусной активности экстракта из плодового тела Laetiporus sulphureus после 1 года хранения.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой противовирусной активности экстрактов, хранящихся в морозильной камере длительное время. Даже при разведении экстракта 1:100 индекс нейтрализации составил 2 lg.

Таблица 3
Результаты противовирусной активности экстракта из плодового тела Laetiporus sulphureus в культуре клеток MDCK, инфицированных A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) после 1 года хранения
№ препарата и его разведение, срок хранения при t -20°С	Содержание сухого вещества в препарате, мг/мл	Конечная концентрация сухих веществ препарата в культуральной жидкости, мг/мл	Инфекционность вируса (титр ВАЖ) в клетках MDCK (ИД50 в lgТЦL50/мл)	Индекс нейтрализации ИД50конт-ИД50опыт (lg)
09-12 (исх.)	5,0	1,67	2,5	5
09-12 (исх.)1 год хранения	5,0	1,67	2,5	5
09-12 1:1001 год хранения	5,0	0,067	5,5	2
Контроль вируса без препарата			7,5	0

Сравнивая результаты по всем образцам, можно сделать вывод о том, что антивирусная активность гриба в отношении штамма вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) зависит от количественного содержания действующих компонентов. В плодовых телах их, в пересчете на сухие вещества, содержится больше, чем в мицелии. Биологические компоненты гриба выдерживают без потери активности длительное хранение в замороженном состоянии. Минимальная доза экстракта (по сухому веществу), оказывающая ингибирующий эффект в культуре клеток, составляет 0,01 мг/мл, а на лабораторных животных (мышах) - 1,0 мг в сутки.

В таблице 4 представлены результаты противовирусной активности грибного экстракта из мицелия гриба Laetiporus sulphureus, полученного культивированием на жидкой питательной среде.

Как видно из таблицы 4, эффективность экстракта из мицелия гриба (образец 09-61), полученного в культуре, была ниже, чем экстрактов из плодовых тел. Но следует учесть, что достижение относительно высокого индекса нейтрализации 2,5 lg было достигнуто при конечной концентрации сухих веществ в препарате 0,01 мг/мл, в то время как для экстракта из плодового тела для достижения индекса нейтрализации 2 lg конечная концентрация составляла 0,067 мг/мл, что больше в 6,7 раз. Результаты показывают, что мицелий гриба, полученный в культуре, содержит, как и плодовое тело, активные соединения, ингибирующие инфицирование вирусом гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) культуры клеток MDCK.

Кроме того, авторами была проведена оценка изменения инфекционности пандемического штамма вируса гриппа A/Moscow/226/2009 (H1N1)v в клетках MDCK при внесении в среду культивирования экстракта №09-12 в концентрации 5 мг/мл или Тамифлю. Усредненные результаты для нескольких повторов этих экспериментов в сравнении с контролем представлены в таблице 5.

Таблица 5
Инфекционность штамма вируса гриппа A/Moscow/226/2009 (H1N1)v в клетках MDCK при инкубировании с экстрактом базидиальных грибов или Тамифлю и в Контроле (М±m)
Штамм вируса гриппа	Инфекционность вируса в клетках MDCK (ИД50 в lgТЦД50/мл) через 3 сут после заражения при инкубировании с препаратами:
09-12 (5 мг/мл)	Тамифлю	Контроль
A/Moscow/226/2009	2,3±0,1*	2,7±0,1*	5,4±0,1
(H1N1)v	n=1	n=4	n=4
Примечание: * - достоверное отличие от контрольной группы (р=0,05); n - число повторов.

Представленные в таблице 5 данные свидетельствуют о достоверном снижении инфекционности вируса гриппа в культуре клеток MDCK при инкубировании с экстрактом 09-12 на 3,1 lg. Инфекционность вируса гриппа в клетках MDCK при использовании Тамифлю также была ниже, чем в контроле на 2,7 lg.

Далее была изучена противовирусная активность данного грибного экстракта по способности подавлять продукцию штаммов вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и A/Moscow/226/2009 (H1N1)v при оценке индекса подавления размножения (ИПР) вируса в легких у лабораторных мышей через 4 сут после заражения (см. ниже табл.6).

Пример 5. Определение противовирусной активности гриба Laetiporus sulphureus на животных. Исследование выполнено на линейных мышах Balb/c, полученных из питомника лабораторных животных ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», массой 14-17 г. Проведение исследований и содержание животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» [Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755].

Инфицирование мышей вирусом гриппа производили интраназально под легким эфирным наркозом при введении в обе ноздри суммарно 40 мкл соответствующего разведения вируса. Мышей инфицировали штаммами вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в дозе 10 ЛД₅₀ (50%-ных летальных доз), равной 1,6±0,4 lgЭИД₅₀/гол., и A/Moscow/226/2009 (H1N1)v в дозе 10 ИД₅₀ (50%-ных инфицирующих доз), равной 1,3±0,3 lgЭИД₅₀/гол. Определение концентрации ВГ в легких проводили через 4 сут после заражения вирусом гриппа при титровании объединенных гомогенатов легких для мышей каждой группы на 9-суточных КЭ, рассчитывали по методу Спирмана-Кербера и выражали в lgЭИД₅₀/мл.

В качестве препарата сравнения в экспериментах in vivo использовали Тамифлю (озельтамивир), который вводили мышам один раз в сутки перорально из расчета 30 мкг/г массы в объеме 0,2 мл сразу после заражения и далее в течение 4 сут после заражения вирусом гриппа.

Статистическая обработка данных. При расчетах титров вируса гриппа в биологических образцах в каждом единичном повторе использовали метод Спирмана-Кербера, определяли 95%-ный доверительный интервал (I₉₅) и сравнивали по z-критерию. Для нескольких повторов определяли среднее значение показателя (М) и ошибку среднего (m), достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента.

В таблице 6 представлены результаты определения титров вируса гриппа в легких у мышей через 4 сут после инфицирования штаммами A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) или A/Moscow/226/2009 (H1N1)v.

Как видно из таблицы 6, при введении препарата 09-12 в концентрации 5 мг/мл титры вируса в легких у инфицированных мышей были достоверно ниже, чем в соответствующей контрольной группе (табл.6). Было показано, что при введении препарата 09-12 мышам, инфицированным штаммом вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), индекс подавления продукции (ИПП) вируса в легких составлял 1,16 lg, а при введении Тамифлю он был равен 1,33 lg. При этом через 4 сут концентрация вируса гриппа в гомогенатах легких у мышей, инфицированных штаммом вируса гриппа A/Moscow/226/2009 (H1N1)v, получавших препараты 09-12 и Тамифлю, была достоверно ниже контроля на 0,75 lg.

Таблица 6
Титры штаммов вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) или A/Moscow/226/2009 (H1N1)v в легких у мышей через 4 сут после инфицирования при пероральном введении грибного экстракта из Laetiporus sulphureus или Тамифлю в сравнении с контролем
Штамм вируса гриппа	Титры вируса гриппа (в lgЭИД50/мл±I95) в гомогенатах легких у инфицированных мышей, получавших препараты:
09-12 (5 мг/мл)	Тамифлю	Контроль
A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)	4,67±0,6*	4,5±0,62*	5,83±0,55
A/Moscow/226/2009 (H1N1)v	6,0±0,57*	6,0±0,69*	6,75±0,49
Примечание: * - достоверное отличие от контрольной группы при р<0,05.

Как видно из таблиц 3, 5 и 6, экстракт 09-12 в исходной концентрации после года хранения показал достоверное снижение титра вируса гриппа птиц A(H5N1) и пандемического вируса гриппа A(H1N1/09)v не только на клеточной культуре, но и на лабораторных животных.

В процессе подавления репродукции вируса гриппа участвует широкий спектр химических соединений, входящих в состав гриба, обеспечивающих антивирусное действие препаратов на основе гриба Laetiporus sulphureus.

1. Ингибитор репродукции вируса гриппа А, представляющий собой водный экстракт базидиального гриба Laetiporus sulphureus, полученный путем экстракции биомассы измельченного гриба водой при соотношении 1:1 или 1:2 с последующим удалением нерастворимого осадка.

2. Ингибитор репродукции вируса гриппа А по п.1, отличающийся тем, что получают биомассу гриба из плодовых тел и экстрагируют измельченную биомассу гриба водой при соотношении 1:2.

3. Ингибитор репродукции вируса гриппа А по п.1, отличающийся тем, что получают биомассу гриба путем культивирования на жидкой питательной среде на основе овсяного отвара и экстрагируют измельченную биомассу гриба водой при соотношении 1:1.