Способы визуализации и композиции, содержащие флюоресцентные красители, связанные с вирусными компонентами для визуализации нервов

Способы визуализации и композиции, содержащие флюоресцентные красители, связанные с вирусными компонентами для визуализации нервов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственная заявка

В соответствии с § 119(e) 35 Свода Законов США, по данной заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США № 61/127659, поданной 14 мая 2008 г, и предварительной заявкой на патент США № 61/082981, поданной 23 июля 2008 г, описания которых включены в данное описание путем ссылки.

Область, к которой относится изобретение

В настоящей заявке описаны композиции и способы, относящиеся к области медицинской визуализации.

Предпосылки изобретения

Ятрогенное повреждение нервов может привести к инвалидизирующей потере функции у людей. Обычные причины ятрогенного повреждения нервов включают повреждения, вызванные неудачными хирургическими вмешательствами, вытяжением или сдавливанием, гематомой или неадекватным положением пациента (Fercan Komurcu, MD et al., 2005, Annals of Plastic Surgery, 54(2):135-139).

Например, нервы часто визуализируются во время процедур простатэктомии. В качестве предпосылки, рак предстательной железы представляет собой наиболее распространенный тип рака у американских мужчин. Одним обычным вариантом лечения является удаление раковой ткани предстательной железы (т.е. простатэктомии) перед тем, как рак распространится местно, и перед метастазированием. Осложнения радикальной простатэктомии включают недержание мочи и импотенцию. У значительного процента мужчин, подвергающихся радикальной простатэктомии, возникает импотенция вследствие повреждения кавернозных нервов во время операции.

Риск ятрогенного повреждения нервов может быть снижен избеганием повреждения нервных пучков, которые проходят вдоль поверхности предстательной железы и необходимы для эрекции. Однако успешного сохраняющего нервы хирургического вмешательства часто трудно достичь ввиду трудности дифференцировки ткани предстательной железы и иннервирующей нервной ткани.

Существует потребность в усовершенствованных способах визуализации и композициях для визуализации нервов.

Краткое описание сущности изобретения

В настоящей заявке описаны композиции и способы для визуализации нервов. Нервы могут локализоваться в различных областях тела индивида.

В настоящей заявке также описано открытие того, что связывание флюоресцентного красителя с вирусным компонентом (например, вирусом, вирусными белками, капсидами), способным проникать в нервные аксоны, может образовывать комплекс красителя/вирусного компонента, который может проникать в аксоны нервов, таким образом, обеспечивая возможность улучшенной визуализации нервных клеток. Один вариант осуществления относится к композиции, содержащей:

флюоресцентный краситель; и

вирусный компонент, выбранный из нейротропного, репликационно-дефектного вируса, вирусного белка нейротропного вируса и капсида нейротропного вируса,

где флюоресцентный краситель связан с вирусным компонентом для образования комплекса красителя/вирусного компонента, который способен проникать в нервные клетки.

В этом и других вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, нейротропные репликационно-дефектные вирусы могут представлять собой, например, ослабленные или инактивированные вирусные компоненты, которые способны проникать в нервные клетки. В другом варианте осуществления композиция может представлять собой вакцину, содержащую флюоресцентный краситель и вирусный компонент, выбранный из нейротропного вируса, вирусного белка нейротропного вируса и капсида нейротропного вируса. Соответственно, другой вариант осуществления относится к вакцине, содержащей:

флюоресцентный краситель; и

вирусный компонент, выбранный из нейротропного вируса, вирусного белка нейротропного вируса и капсида нейротропного вируса,

где флюоресцентный краситель связан с вирусным компонентом для образования комплекса красителя/вирусного компонента, который способен проникать в нервные клетки.

Другой вариант осуществления относится к способу получения композиции, включающему:

комбинирование флюоресцентного красителя с вирусным компонентом, выбранным из нейротропного, репликационно-дефектного вируса, вирусного белка нейротропного вируса и капсида нейротропного вируса,

обеспечение возможности связывания флюоресцентного красителя с вирусным компонентом для образования комплекса красителя/вирусного компонента, который способен проникать в нервные клетки.

Другой вариант осуществления относится к способам визуализации нервов и/или диагностики аномалий и/или состояний нервов. Способы включают стадии (a) введения описанной в настоящей заявке композиции индивиду, (b) предоставления возможности комплексу красителя/вирусного комплекса проникнуть в нервные клетки, (c) подачи достаточного количества энергии излучения на индивида с тем, чтобы произошла флюоресценция красителя, (d) интраоперационного получения изображения флюоресценции индивида. Способ может включать стадию осмотра изображения флюоресценции для обозрения одного или нескольких нервов у индивида, или осмотра изображения флюоресценции для определения того, пересечен ли один или более нервов.

Соответственно, другой вариант осуществления относится к способу снижения ятрогенного повреждения у индивида во время хирургической процедуры, включающему:

(a) введение композиции индивиду, причем композиция содержит:

флюоресцентный краситель; и

вирусный компонент, выбранный из нейротропного, репликационно-дефектного вируса, вирусного белка нейротропного вируса и капсида нейротропного вируса,

где флюоресцентный краситель связан с вирусным компонентом для образования комплекса красителя/вирусного компонента;

(b) предоставление возможности комплексу красителя/вирусного комплекса проникнуть в нервные клетки;

(c) подачу достаточного количества энергии излучения на индивида с тем, чтобы произошла флюоресценция красителя;

(d) интраоперационное получение изображения флюоресценции индивида;

(e) осмотр изображения флюоресценции для обозрения одного или нескольких нервов у индивида.

Другой вариант осуществления относится к способу диагностики состояния нерва, включающему:

(a) введение композиции индивиду, причем композиция содержит:

флюоресцентный краситель; и

вирусный компонент, выбранный из нейротропного вируса, вирусного белка нейротропного вируса и капсида нейротропного вируса,

где флюоресцентный краситель связан с вирусным компонентом для образования комплекса красителя/вирусного компонента;

(b) предоставление возможности комплексу красителя/вирусного комплекса проникнуть в нервные клетки;

(c) подачу достаточного количества энергии излучения на индивида с тем, чтобы произошла флюоресценция красителя;

(d) интраоперационное получение изображения флюоресценции индивида; и

(e) осмотр изображения флюоресценции для определения того, пересечен ли нерв.

Один вариант осуществления относится к набору, содержащему композиции, описанные в настоящей заявке, наряду с инструкциями по применению композиции в соответствии с одним или более способов, описанных в настоящей заявке. В других вариантах осуществления набор включает один или более ингредиентов, красителей, вирусов, предшественников или других инструментов, которые могут использоваться для получения композиций, описанных в настоящей заявке, наряду с инструкциями по применению композиции в соответствии с одним или более способов, описанных в настоящей заявке.

На фиг.1 схематически изображена система для медицинской визуализации;

Фиг.2 представляет собой блок-схему, изображающую алгоритмы для медицинской визуализации, которая может выполняться программным обеспечением, установленным на процессор компьютера;

На фиг.3А показано изображение флюоресценции спины мыши из примера 3.

Фиг.3B представляет собой полученное видимым (белым) светом изображение той же спины мыши, показанной фиг.3A, но без флюоресцентной визуализации;

Фиг.3C представляет собой изображение флюоресценции с некоторым освещением видимым светом обнаженного спинного мозга мыши из примера 3;

Фиг.3D представляет собой изображение флюоресценции того же спинного мозга ближе к голове мыши с нервами, входящими в спинной мозг, не меченными ICG/PBS/HSV-2 ΔRR;

На фиг.4A показана флюоресценция ICG/PBS/HSV-2ΔRR (комплекса красителя/вирусного компонента) в виде с вентральной стороны тела мыши из примера 4;

Фиг.4B представляет собой изображение, показывающее спину (вид со спины) мыши из примера 4, с рассечением тканей для показа позвоночника и флюоресцирующего нерва от левой стопы при использовании визуализации флюоресцентным и белым светом;

Фиг.4C представляет собой изображение флюоресценции той же мыши, что и на фиг.4B;

Фиг.4D представляет собой флюоресцентные изображения (i) отпрепарированного флюоресцирующего дорзального корневого ганглия с левой стороны позвоночника мыши из примера 4 только в белом свете с коротким сегментом его аксонов с правой стороны ганглия, и (ii) соответствующего ганглия с правой стороны позвоночника, где не производилась инъекция в аксоны правой подушечки лапы.

Фиг.4E представляет собой изображения (i) ганглия, показанного на фиг.4D(i), и (ii) ганглия, показанного на фиг.4D(ii);

Фиг.4F представляет собой увеличенное изображение ганглия, показанного на фиг.4E(i);

На фиг.5A показан рисунок, представляющий анатомическое строение левой конечности кролика, для сравнения с изображением флюоресценции;

Фиг.5B представляет собой изображение флюоресценции, показывающее, что комплекс ICG/HSV-2ΔRR прошел из участка инъекции в пальцевую подушечку вверх в верхний подошвенный нерв;

На фиг.5C показан рисунок, представляющий анатомическое строение правой конечности кролика, для сравнения с изображением флюоресценции;

Фиг.5D представляет собой изображение изолированного сегмента подкожной вены в видимом белом свете;

Фиг.5E представляет собой изображение флюоресценции, показывающее изолированный сегмент подкожной вены с помощью флюоресценции комплекса ICG/HSV-2ΔRR;

Фиг.5F и 5H представляют собой изображения флюоресценции, показывающие соответственно иссеченный сегмент подкожной вены предыдущих двух рамок (фиг.5F) и нерв in situ (фиг.5H);

Фиг.5G и 5I представляют собой изображения флюоресценции, показывающие иссеченный сегмент подкожной вены, показанный на фиг.5F, но окрашенный на наличие гена LacZ инактивированного УФ вируса ICG/PBS/HSV-2ΔRR;

На фиг.5J показан рисунок, представляющий анатомическое строение левой конечности кролика, для сравнения с изображением флюоресценции; и

Фиг.5K представляет собой изображение флюоресценции дорзальной стороны левой задней конечности кролика из примера 5.

Детальное описание

Один вариант осуществления относится к композициям для визуализации нервов.

В одном варианте осуществления композиция включает краситель, такой как флюоресцентный краситель, используемый для медицинской визуализации. Однако многие красители не подходят для визуализации определенных частей тела, таких как нервы, поскольку красители обычно не способны проникать в нервные клетки. В настоящей заявке описано обнаруженное явление, состоящее в том, что нейротропный вирусный компонент, т.е. вирусный компонент, способный проникать в нервные клетки, может использоваться для аксонального переноса красителя через части или всю сеть нервов. Это может быть достигнуто образованием комплекса красителя, связанного с вирусным компонентом.

Красители

Используемый в настоящем описании термин «флюоресцентный краситель» или «краситель» означает маленькую молекулу или белок, или другой полимер, или макромолекулу, которая флюоресцирует испусканием света в видимом или близком к инфракрасному диапазоне длины волн после возбуждения энергией светового излучения соответствующей длины волн.

Подходящие флюоресцентные красители включают любой нетоксичный краситель, который флюоресцирует при воздействии на него энергии излучения, например света. В определенных вариантах осуществления краситель представляет собой флюоресцентный краситель, который испускает свет в спектре, близком к инфракрасному спектру. В некоторых вариантах осуществления краситель может не быть растворимым в липидах, тогда как в других вариантах осуществления он может быть растворимым в липидах. В определенных вариантах осуществления краситель представляет собой трикарбоцианиновый краситель, такой как индоцианин зеленый (ICG), выпускаемый компанией Akorn, Inc. (Buffalo Grove, IL). Краситель ICG утвержден FDA (Администрацией пищевых продуктов и лекарственных средств США) для использования у людей. В других вариантах осуществления краситель представляет собой инфрацианин зеленый. В других вариантах осуществления краситель выбран из флюоресцеина изотиоцианата, родамина, фикоэритрина, фикоцианина, аллофикоцианина, о-фтальдегида, флуоресцамина, розового бенгальского, трипана синего, флуорозолота, 3-индоцианина зеленого-ацил-1,3-тиазолидинтиона, зеленого флюоресцентного белка, красного флюоресцентного белка, желтого флюоресцентного белка, синего флюоресцентного белка и других флюоресцентных белков. Красители могут смешиваться или комбинироваться. В некоторых вариантах осуществления могут применяться аналоги красителей. «Аналог красителя» представляет собой краситель, который был химически модифицирован, но все же сохраняет свою способность флюоресцировать при воздействии на него энергии излучения соответствующей длины волн.

В одном варианте осуществления краситель представляет собой флюоресцентный белок, такой как зеленый флюоресцентный белок, ковалентно связанный с белком в вирусном капсиде, сконструированном замещением гена вирусного белка таким же геном вирусного белка, но слитым с геном зеленого флюоресцентного белка. В одном варианте осуществления зеленый флюоресцентный белок ковалентно связан с белком нейротропного вируса, который проникает в нервные клетки.

Вирусные компоненты

В одном варианте осуществления вирусный компонент выбран из вируса, вирусных белков и капсид. В одном варианте осуществления вирусный белок представляет собой капсид или капсидный белок. В одном варианте осуществления вирусный белок представляет собой аналог вирусного белка. В одном варианте осуществления вирусные белки и аналоги способны проникать в нервную клетку самостоятельно, не являясь частью вирусного капсида или цельного вируса. В другом варианте осуществления вирусные белки и аналоги могут быть частью вирусного капсида или цельного вируса, который сам проникает в нервную клетку. Аналоги имеют другую структуру нуклеиновой кислоты, что приводит к консервативным аминокислотным изменениям, которые хотя и изменяют первичную последовательность белка или пептида, обычно не изменяют его функцию. Консервативные аминокислотные замещения обычно включают замещения внутри следующих групп:

глицин, аланин;

валин, изолейцин, лейцин;

аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота;

аспарагин, глутамин;

серин, треонин;

лизин, аргинин;

фенилаланин, тирозин.

В одном варианте осуществления вирусный белок и его аналоги могут быть выделены перед тем, как краситель связывается с ними.

Ввиду того, что он используется в медицинских заявках, данный компонент является невирулентным или «репликационно-дефектным». Используемый в настоящем описании термин «репликационно-дефектный» означает не образующий вирусных частиц (вирусного потомства) в клетке-мишени (нервной клетке). В одном варианте осуществления «репликационно-дефектный» относится к неспособности к репродукции. «Репликационно-дефектный» вирус может также относиться к ослабленному вирусу. В одном варианте осуществления ослабленные вирусы представляют собой живые вирусы, которые имеют низкую вирулентность. В одном варианте осуществления ослабленные вирусы не реплицируются. В другом варианте осуществления они могут экспрессировать вирусные антигены в инфицированных клетках без репликации. В другом варианте осуществления ослабленные вирусы медленно реплицируются и продуцируют потомство ослабленного вируса.

В одном варианте осуществления вирусный компонент не является нейровирулентным.

В одном варианте осуществления, вирусу придается свойство репликационной дефектности посредством мутации или инактивации нагреванием, светом (например, УФ светом) или химической обработкой. Дозировка и длины волн ультрафиолетового («УФ») света для уничтожения определенных вирусов хорошо известны. Например, на сайте http://www.americanairandwater.com/uv-faccts/uv-dosage.htm перечисляется дозировка УФ света, которая ингибирует образование колоний определенных вирусов, представлена ниже в таблице 1:

Таблица 1
Вирус	Дозировка энергии ультрафиолетового излучения (доза УФ) в мкВтс/см2, требуемой для уничтожения фактора
	90% (снижение на 1 логарифм)	99% (снижение на 1 логарифм)
Бактериофаг - E. Coli	2600	6600
Инфекционный гепатит	5800	8000

Грипп	3400	6600
Полиовирус - полиомиелит	3150	6600
Мозаика табака	240000	440000

В одном варианте осуществления мутация может быть осуществлена удалением или инактивацией вирусного генетического материала (такого как РНК для РНК вирусов, или ДНК для ДНК вирусов) или белков, требуемых для вирусной репликации, цитопатическими воздействиями или лизисом клеток. В одном варианте осуществления вирус представляет бой мутант вируса бешенства, например Imovax (Sanofi Pasteur SA).

В другом варианте осуществления репликационно-дефектный вирус представляет собой вакцину. Используемый в настоящем описании термин «вакцина» относится к невирулентной композиции (содержащей один или более вирусных компонентов), которая улучшает иммунитет в отношении заболевания. В другом варианте осуществления вакцина может использоваться в качестве вирусного компонента, такая как вакцина Zostavax® (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ). Соответственно, другой вариант осуществления относится к вакцине, содержащей:

флюоресцентный краситель; и

вирусный компонент, выбранный из нейропатического вируса, вирусного белка нейротропного вируса и капсида нейротропного вируса,

где флюоресцентный краситель связан с вирусным компонентом для образования комплекса красителя/вирусного компонента, который способен проникать в нервные клетки.

Вирусный компонент является нейротропным в том, что он проникает в клетки нервной системы (например, двигательные нервы и/или сенсорные нервы). В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой тот, который переносится по аксонам нервной системы. Он должен быть безопасным для применения у людей. Таким образом, в определенных вариантах осуществления может использоваться любой вирусный компонент, который способен проникать в нервную клетку и связываться с красителем, пока он не является литическим, и предпочтительно пока он не вызывает цитопатический эффект.

Нейротропное свойство вирусного компонента используется для визуализации путем обеспечения возможности связывания флюоресцентного красителя с этим компонентом, посредством этого образуя комплекс красителя/вирусного компонента, который также является нейротропным, т.е. способным проникать в клетки нервной системы. Связывание между красителем и вирусными белками может происходить посредством взаимодействий ван-дер-Вальса, междипольных взаимодействий, катион-пи взаимодействий, водородного связывания, ионного связывания, ковалентного связывания или любого другого типа связывания, достаточного для того, чтобы краситель вошел в нервную клетку с вирусом или вирусной частицей. В некоторых вариантах осуществления краситель и вирус или вирусные белки могут связываться непосредственно, и это означает, что они не связываются или ассоциируются промежуточным, вставленным линкером между красителем и его ассоциированным вирусом или вирусными частицами.

В одном варианте осуществления может использоваться капсид нейтротропного вируса со связанным флюоресцентным красителем.

В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой герпесвирус и может представлять собой вирус простого герпеса 2 типа (HSV-2) или его мутант. HSV-2 инфицирует клетки нервной системы. Ген ICP10 HSV-2 кодирует фермент рибонуклеотид-редуктазу (RR), состоящий из двух субъединиц, именуемых большой и маленькой субъединицами, кодируемыми соответственно генами UL39 и UL40. Ген ICP10 HSV-2 (GeneBank No. M 12700) описан в патентах США №№ 6013265, 6054131 и 6207168.

В одном примере мутанта HSV-2 имеется делеция домена репликационно-дефектного (RR) из ICP10. Устранение этого домена может быть полезно в том, что полученный мутант становится репликационно-дефектным.

В одном варианте осуществления вирус представляет собой мутантную форму HSV-2, обозначенную ICP10ΔRR, в которой домен репликационно-дефектного ICP10 замещен геном, кодирующим LacZ. Вирус ICP10ΔRR известен в данной области (Peng et al., 1996, Virology, 216:184-196; LacZ-specific staining facilitates detection of cells that are infected with the mutant virus). ICP10ΔRR может также иметь делецию гена RR, без добавления гена LacZ. Ген LacZ может быть замещен любым геном, представляющим интерес. Может использоваться любой мутант HSV-2, в котором имеется делеция или инактивация домена RR. Мутант ICP10ΔRR HSV-2 в настоящем описании именуется HSV-2 ΔRR.

В другом варианте осуществления вирус может представлять собой вирус ветряной оспы (вирус опоясывающего герпеса).

Для получения подходящих вирусов могут использоваться стандартные процедуры молекулярной биологии, известные в данной области. Иллюстративные процедуры описаны в публикации Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), в публикации Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) и в публикации Gerhardt et al. (eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D. C).

Композиции

Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления композиция включает краситель, связанный с репликационно-дефектным вирусным компонентом. В определенных вариантах осуществления композиция включает краситель, связанный с вирусным белком или инактивированным вирусом, как далее описано в настоящей заявке. Композиции могут вводиться индивиду для визуализации нервов.

Соответственно, другой вариант осуществления относится к способу получения композиции, включающему:

комбинирование флюоресцентного красителя с вирусным компонентом, выбранным из нейротропного репликационно-дефектного вируса, вирусного белка нейротропного вируса и капсида нейротропного вируса,

предоставление возможности флюоресцентному красителю связаться с вирусным компонентом для образования комплекса красителя/вирусного компонента, который способен проникать в нервные клетки.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит небольшое количество или не содержит краситель, который не связан с вирусом или вирусным белком. Например, количество красителя, используемого для получения композиции, может титроваться до используемого количества вируса или вирусного белка. Аналогичным образом, посторонний (несвязанный) краситель может быть удален из композиции посредством диализа или использования градиента сахарозы.

В настоящей заявке также описывается получение и применение композиций, раскрытых в настоящей заявке. Такая композиция может состоять из одного активного ингредиента в форме, подходящей для введения индивиду, или композиция может содержать активный ингредиент и один или более фармацевтически приемлемых носителей, один или более дополнительных ингредиентов или некоторую их комбинацию. Активный ингредиент может присутствовать в композиции в форме физиологически приемлемого сложного эфира или соли, например, в комбинации с физиологически приемлемым катионом или анионом, как хорошо известно в данной области.

Используемый в настоящем описании термин «активный ингредиент» означает вирусный компонент, такой как нейротропный вирус, вирусный капсид или вирусный белок, с которым связан флюоресцентный краситель.

Используемый в настоящем описании термин «фармацевтически приемлемый носитель» означает химическую композицию, с которой активный ингредиент может комбинироваться и которая после объединения может использоваться для введения индивиду активного ингредиента.

Используемый в настоящем описании термин «физиологически приемлемый» означает сложный эфир или соль активного ингредиента, которые совместимы с любыми другими ингредиентами композиции и которые не оказывают вредного воздействия на индивида, которому вводится композиция.

Составы композиций, описанных в настоящей заявке, могут быть получены любым способом, известным или тем, который будет разработан в будущем в области фармакологии. В целом, такие способы получения включают стадию приведения активного ингредиента в ассоциацию с носителем или одним или более других вспомогательных ингредиентов, а затем, если необходимо или желательно, профилирование или упаковку продукта в желательную одно- или многодозовую стандартную лекарственную форму.

Хотя описания композиций, представленные в настоящей заявке, в основном, направлены на композиции, которые подходят для введения людям, специалистам в данной области будет понятно, что такие композиции, в целом, подходят для введения животным всех видов. Модификация композиций, подходящих для введения человеку, с целью придания композиции пригодности для введения различным животным, хорошо известны, и средний специалист в области ветеринарной фармакологии может сконструировать и выполнить такую модификацию, если потребуется, просто обычным экспериментированием. Индивиды, которым предусмотрено введение композиций, включают, без ограничения, людей, нечеловекообразных обезьян и других животных.

Композиции могут быть получены, упакованы или поставлены для продажи в препаративных формах, подходящих для парентерального, внутривенного, внутриглазного, подоболочечного или любого другого пути введения.

Композиции могут быть получены, упакованы или поставлены для продажи насыпью, в виде одной стандартной дозы или в виде множества стандартных доз. Используемый в настоящем описании термин «стандартная доза» представляет собой любое дискретное количество композиции, содержащее заданное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента, в целом, равно дозировке активного ингредиента, которое должно вводиться индивиду, или подходящей фракции такой дозировки, такой как, например, половина или одна треть такой дозировки.

Используемый в настоящем описании термин «парентеральное введение» композиции включает любой путь введения, характеризуемый физическим нарушением целостности ткани индивида и введением композиции через брешь в ткани. Таким образом, парентеральное введение включает без ограничения введение композиции инъекцией, путем применения композиции посредством проникновения в ткань нехирургической раны и тому подобным путем. В частности, предусматривается, что парентеральное введение включает без ограничения подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутристернальную инъекцию и методики гемодиализных вливаний при почечной недостаточности.

Препаративные формы композиций, подходящих для парентерального введения, включают активный ингредиент в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как стерильная вода или стерильный изотонический солевой раствор. Такие препаративные формы могут быть получены, упакованы или поступать в продажу в форме, подходящей для болюсного введения или для непрерывного введения. Инъецируемые препаративные формы могут быть получены, упакованы или поступать в продажу в стандартной лекарственной форме, такой как ампулы или многодозовые контейнеры, содержащие консервант. Препаративные формы для парентерального введения включают без ограничения суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных носителях, пасты и имплантируемые препаративные формы длительного высвобождения или биологически разлагаемые препаративные формы. Такие препаративные формы могут, кроме того, содержать один или более дополнительных ингредиентов, включая без ограничения суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты. В одном варианте осуществления препаративной формы для парентерального введения активный ингредиент представлен в сухой форме (т.е. порошкообразной, гранулярной или лиофилизированной) для восстановления влагосодержания подходящим носителем (например, стерильной апирогенной водой) перед парентеральным введением композиции с восстановленным влагосодержанием.

Дозы, которые могут вводиться животному, например, человеку, находятся в диапазоне от примерно 10² до примерно 10⁸ или от примерно 10² до примерно 10⁴, или от примерно 10³ до примерно 10⁸ бляшкообразующих единиц (pfu) вируса на грамм массы тела. В другом варианте осуществления доза находится в диапазоне, например, от примерно 10⁴ мг до примерно 2×10³ мг красителя/г массы тела. Например, эксперименты на животных, описанные ниже в экспериментальном разделе, выполнялись с красителем ICG и следующим количеством вируса: (a) 4,2×10⁴ pfu вируса на грамм массы тела для мышей, и (b) 972,8 pfu на грамм массы тела для кроликов.

Способы визуализации

Один вариант осуществления относится к способу визуализации по меньшей мере одного нерва индивида. Изображение может быть получено интраоперационно. Таким образом, область, где предстоит проведение хирургического вмешательства, или соседние области, могут быть открыты для доступа. Способ включает: (a) введение композиции, описанной в настоящей заявке, для образования комплекса красителя/вирусного компонента, (b) обеспечения возможности проникновения комплекса красителя/вирусного компонента в нервные клетки; (c) подачи достаточного количества энергии излучения на область с тем, чтобы происходила флюоресценция красителя, (d) интраоперационного получения изображения флюоресценции и (e) осмотра изображения флюоресценции для определения присутствия или отсутствия по меньшей мере одного нерва на изображении флюоресценции.

В одном варианте осуществления «осмотр изображения флюоресценции» может относиться к осмотру фиксированного изображения (печатного или на экране) или в реальном масштабе времени на видеомониторе, в дополнение к другим способам осмотра изображений. В одном варианте осуществления отдельные изображения нервов (т.е. карты нервов), возможность получения которых была обеспечена связыванием флюоресцентного красителя с вирусным компонентом (например, вирусным вектором), могут использоваться для диагностических целей и для документации локализации нерва. В одном варианте осуществления одно применение картирования нервов не целесообразно. Предусматривается, что данная технология может использоваться для мечения нервов красителем для использования при флюороскопии, методике визуализации, обычно используемой врачами для получения в реальном масштабе времени подвижных изображений внутренних структур тела пациента. Например, интраоперационная визуализация хирургического поля обозрения любыми доступными обычными средствами может происходить так, что определение локализации и/или распознавания нервов - особенно их мелких ветвей - не адекватно для обеспечения хирургического вмешательства с сохранением нервов. В таких ситуациях интраоперационное флюороскопическое применение настоящей технологической инновации будет иметь решающее значение для успешных исходов.

На основании описанных ниже экспериментов, по оценке, флюоресценция красителя может перемещаться ретроградным образом через нервы со скоростью примерно 2 см/ч или быстрее. Эта высокая скорость потока красителя может обеспечить возможность введения композиций за несколько часов (или дольше) до выполнения визуализации. Композиция, включающая краситель, может вводиться за достаточное время до визуализации с тем, чтобы краситель поступил в область, подлежащую визуализации, и присутствовал в такой области во время визуализации. Требуемое количество времени может зависеть от применения визуализации нервов и участка введения. В качестве примера, композиция может вводиться за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 часов или менее до визуализации в определенных процедурах, например, на основании расстояния, которое должен пройти краситель до участка визуализации. В одном варианте осуществления композиция вводится не более чем за 1, 2 или 3 часа до визуализации.

Путем осмотра изображения флюоресценции хирургическая бригада может определить отсутствие или присутствие нерва на изображении. Часто нервы могут быть идентифицированы по их размеру, форме и макроскопической локализации с использованием обычного освещения операционного поля видимым светом. Однако часто контраст между нервами - особенно их мелкими ветвями - и подлежащими тканями настолько слабый, что без значительного контраста, обеспечиваемого флюоресценцией нервов, их вообще невозможно визуально обнаружить. Хирургическая бригада может, кроме того, определить локализацию одного или более определенного нерва (нервов) путем осмотра изображения флюоресценции. Таким образом, хирургическая бригада может использовать информацию о присутствии/отсутствии или локализации одного или более нервов для определения того, как они выполнят хирургическую процедуру. Например, на основании информации, полученной посредством использования описанных способов, хирургическая бригада может принять решение произвести разрез в точке на теле индивида, где менее вероятно нечаянное пересечение или хирургический контакт с определенным нервом на основании установленного отсутствия нерва в данной области.

Другие варианты осуществления предусматривают получение множества изображений. Множество изображений может сравниваться друг с другом для определения того, что нерв не был поврежден, например, нечаянно рассечен.

Информация, полученная по полученным изображениям, может помочь при трансплантации концов нервов, если они пересечены. В случае пересечения трансплантаты нервов могут накладываться непосредственно на концы для содействия прорастанию регенеративных нервных волокон. В этом случае свет, видимый в результате флюоресценции концов пересеченных нервов, обеспечивает мишень для направления наложения анастомозов нервов нервным трансплантатом.

Способ диагностики

Другой вариант осуществления относится к способу диагностики состояния нерва, например, был ли нерв поврежден или пересечен, или успешно резецирован, например, во время хирургической процедуры. В одном варианте осуществления способ диагностики включает стадии (a) введения индивиду композиции, описанной в настоящей заявке; (b) предоставления возможности комплексу красителя/вирусного комплекса проникнуть в нервные клетки; (c) подачу достаточного количества энергии излучения на индивида с тем, чтобы произошла флюоресценция красителя; (d) интраоперационного получения изображения флюоресценции индивида; и (e) осмотра изображения флюоресценции или для осмотра одного или более нервов у индивида и/или определения того, пересечен ли один или более нервов.

Таким образом, путем осмотра изображения нерва пользователь может определить, был ли пересечен определенный нерв. В некоторых вариантах осуществления изображение используется для определения того, был ли корригирован (т.е. резецирован) пересеченный нерв.

Изображения, полученные указанными способами, могут использоваться для содействия направлению трансплантации нерва, когда происходят непреднамеренные пресечения нервов, или когда их невозможно избежать иным образом. В некоторых вариантах осуществления изображение осматривается после выполнения трансплантации нерва для подтверждения того, что нерв был успешно резецирован.

Опытный практикующий врач сможет путем осмотра изображения, полученного в соответствии с описанными способами, определить, пересечен ли нерв. Например, не