Фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на твердом носителе, способ иммобилизации фермента, биокатализируемый проточный реактор и способ очистки симвастатина

Фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на твердом носителе, способ иммобилизации фермента, биокатализируемый проточный реактор и способ очистки симвастатина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к ферменту ловастатин эстеразе, иммобилизованному на твердом носителе, нерастворимом в воде, способу иммобилизации фермента, применению иммобилизованного фермента, биокатализируемому проточному реактору и способу получения и/или очистки симвастатина.

Симвастатин и ловастатин принадлежат к классу соединений, представляющих собой ингибиторы гидрокси-3-метил-глутарил-коэнзим A (HMG-CoA) редуктазы, называемых статинами. Статины значительно снижают риск заболеваний коронарной недостаточности, инсультов мозга и периферического атеросклероза. Вследствие уменьшения отложений холестерина статины стабилизируют атеросклеротические бляшки, улучшают функцию эндотелия сосудов, замедляют рост и миграцию гладкомышечных клеток, также оказывают благоприятное влияние на свертывание крови, фибринолиз и активность тромбоцитов, а также проявляют противовоспалительные свойства. [Tobert J.A. et al., Journal of Clinical Investigations, 1982, April, 69 (4), 913-919; Pedersen T. et al. Lancet (1994) 344, 1383-89; Czynniki Ryzyka. Kwartalnik Polskiego Towarzystwa Badań nad Miażdżycą (Risk Factors. Polish Society of Atherosclerosis Research Quarterly) 2003, 40, 5-13].

Ловастатин, соединение, соответствующее формуле I, получают ферментацией с использованием штамма Aspergillus terreus. Симвастатин, соединение, соответствующее формуле II, обладающий более высокой фармакологической активностью и меньшей токсичностью по сравнению с ловастатином, получают полусинтетическим путем из ловастатина.

В патенте США №4,582,915 предложен способ получения симвастатина, который заключается в модификации боковой цепи ловастатина, в соответствии со следующей схемой.

Ловастатин подвергают щелочному гидролизу, и образовавшуюся калийную соль обрабатывают сильным основанием, таким как н-бутиллитий, в присутствии вторичного амина, и далее метилирующим агентом (например, метилиодидом). Итоговая конверсия не превышает 95%. Выделение симвастатина в чистом виде затруднительно, так как примесь остаточного ловастатина может быть отделена, в принципе, только с использованием ВЭЖХ.

Фермент ловастатин эстераза позволяет селективно подвергать гидролизу соли ловастатина в присутствии солей симвастатина. Данный фермент продуцируется гифообразующим грибом Clonostachys compactiuscula (ATCC 38009, АТСС 74178). После конверсии в аммонийные соли смесь симвастатина и ловастатина подвергают реакции ферментативного гидролиза, катализируемой ловастатин эстеразой, что приводит к селективному гидролизу соли ловастатина в «триол», не затрагивая соль симвастатина. Лактонизация смеси кислот в кислых условиях приводит к образованию смеси лактонов, которая может быть разделена кристаллизацией.

Проведение реакции ферментативного гидролиза с использованием природного фермента ловастатин эстеразы приводит к потере фермента, что увеличивает стоимость превращения ловастатина в симвастатин. Применение цельноклеточного материала культуры Clonostachys compactiuscula допустимо, но это усложняет выделение продукта.

Иммобилизация фермента на твердом носителе позволяет устранить эти недостатки. Попытки иммобилизовать ловастатин эстеразу на твердом носителе, нерастворимой в воде, описаны Ostaszewski R. et al., Biotechnology (2006, 888-892). Тем не менее, полученные катализаторы проявляли низкую активность, и иммобилизованный фермент характеризовался отсутствием или значительным снижением селективности гидролиза ловастатина относительно симвастатина, то есть ферментативный процесс приводил к гидролизу и ловастатина, и симвастатина.

Задачей настоящего изобретения является обеспечение фермента ловастатин эстеразы, иммобилизованного на твердом носителе, нерастворимом в воде, способ иммобилизации фермента, применение иммобилизованного фермента, биокатализируемый проточный реактор и способ получения и/или очистки симвастатина.

Фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на водонерастворимом твердом носителе, согласно настоящему изобретению, отличается тем, что фермент ковалентно связан с твердым носителем, активированным по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом, при этом иммобилизованная ловастатин эстераза проявляет гидролитическую активность к ловастатину и солям ловастатина, в присутствии симвастатина и/или солей симвастатина, по меньшей мере в 5 раз превышающую активность к симвастатину и солям симвастатина.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полисахарид или модифицированный полисахарид. Полисахарид главным образом представляет собой полигалактозид. В частности, модифицированный полисахарид представляет собой ди-(С_1-6алкил)амино-С_1-6алкилцеллюлозу, предпочтительно диэтиламиноэтилцеллюлозу.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой силикагель или модифицированный силикагель. В частности, модифицированный силикагель представляет собой силикагель, модифицированный амино-С_1-6-алкил-три(С_1-6алкокси)силаном, предпочтительно аминопропилсиланизованный силикагель.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂- или -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C_1-6алкил, или Y представляет собой -SO₂-Ar-SO₂-, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал может содержать C_1-6алкильные заместители. В частности, указанный по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле где Y представляет собой -SO₂-.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галогенангидрид циануровой кислоты, предпочтительно цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полигалактозид, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂-.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой аминопропилсиланизованный силикагель, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

В частности, фермент представляет собой фермент, продуцируемый Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, АТСС 74178.

Способ иммобилизации фермента ловастатин эстеразы на твердой нерастворимой в воде подложке согласно настоящему изобретению, характеризуется тем, что в способе используют механическое перемешивание, приводят во взаимодействие галогенангидрид циануровой кислоты с твердым носителем в растворителе, отделяют фильтрованием активированный твердый носитель, сушат активированный твердый носитель и суспендируют в водной смеси, содержащей фермент ловастатин эстеразу до иммобилизации фермента, отделяют суспендированное вещество фильтрованием, промывают буферным раствором и сушат.

Преимущественно, полисахарид или модифицированный полисахарид используют в качестве твердого носителя. В частности, модифицированный полисахарид представляет собой ди-(С_1-6алкил)амино-С_1-6алкилцеллюлозу, предпочтительно диэтиламиноэтилцеллюлозу.

Преимущественно, силикагель или модифицированный силикагель используют в качестве твердого носителя. В частности, силикагель, модифицированный амино-C_1-6алкил-три(С_1-6алкокси)силаном, предпочтительно аминопропилсиланизованный силикагель, используют в качестве модифицированного силикагеля.

Преимущественно, используемый галогенангидрид циануровой кислоты представляет собой цианурхлорид.

В частности, используют автоклавированный твердый носитель.

Возможно, механическое перемешивание представляет собой встряхивание.

Преимущественно, отфильтрованное вещество промывают водой перед промыванием в буферном растворе.

В частности, галогенангидрид циануровой кислоты приводят в контакт с твердым носителем в присутствии основания и/или буферного раствора.

Используемый водный раствор, содержащий фермент, представляет собой, предпочтительно, протеиновую фракцию вещества, экстрагированного из Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, АТСС 74178.

Способ иммобилизации фермента ловастатин эстеразы на твердом носителе, нерастворимом в воде, в соответствии с изобретением, характеризуется тем, что соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂- или -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C_1-6алкил, или Y представляет собой -SO₂-Ar-SO₂-, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал возможно содержит C_1-6алкильные заместители, приводят в контакт с твердым носителем на основе полигалактозы в растворителе при механическом перемешивании, активированный твердый носитель отделяют фильтрованием, активированную твердую подложку сушат и суспендируют в водном растворе, содержащем фермент ловастатин эстеразу, суспендированное вещество отделяют фильтрованием, промывают буферным раствором и сушат.

Преимущественно, соединение, соответствующее формуле , представляет собой соединение, где Y представляет собой -SO₂-.

В частности, встряхивание используют в качестве механического перемешивания.

Перед промыванием буферным раствором отфильтрованное вещество возможно промывают водой.

Используемый водный раствор, содержащий фермент, представляет собой, предпочтительно, протеиновую фракцию вещества, экстрагированного из Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, АТСС 74178.

В соответствии с изобретением фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на твердом носителе, нерастворимом в воде, используют для получения, и/или выделения, и/или очистки симвастатина.

Преимущественно, фермент используют для очистки и/или выделения симвастатина из его смеси с ловастатином.

В частности, фермент используют для селективного гидролиза аммонийной соли ловастатина в триольную соль, в присутствии аммонийной соли симвастатина. Фермент используют, возможно, для селективного гидролиза аммонийной соли ловастатина в триольную соль, в присутствии аммонийной соли симвастатина, в периодичном технологическом процессе. Фермент используют, в частности, для селективного гидролиза аммонийной соли ловастатина в триольную соль, в присутствии аммонийной соли симвастатина, в непрерывном технологическом процессе.

Биокатализируемый проточный реактор с подложкой в соответствии с изобретением отличается тем, что реактор состоит из тела реактора с внутренним пространством, соединенным с подводом жидкости и соединенным с отводом жидкости, во внутреннем пространстве которого находится подложка, содержащая иммобилизованный фермент ловастатин эстеразу.

Преимущественно, подложка содержит фермент, иммобилизованный на твердом носителе, нерастворимом в воде, фермент ковалентно связан с твердым носителем, активированным по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом.

В частности, твердый носитель представляет собой полисахарид или модифицированный полисахарид. Полисахарид представляет собой, главным образом, полигалактозид, В частности, модифицированный полисахарид представляет собой ди-(С_1-6алкил)амино С_1-6алкилцеллюлозу, предпочтительно диэтиламиноэтилцеллюлозу.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂- или -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C_1-6 алкил, или Y представляет собой -SO₂-AC-SO₂-, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал может содержать C_1-6алкильные заместители. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂-.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галид циануровой кислоты, предпочтительно цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полигалактозид, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂-.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу, и по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

Указанный фермент представляет собой фермент, продуцируемый, главным образом, Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, ATCC 74178.

Способ получения и/или очистки симвастатина, включающий обработку раствора соли симвастатина, содержащего остаточное количество соли ловастатина, ферментом ловастатин эстеразой до прохождения гидролиза ловастатина для образования триола, отделение триола и выделение симвастатина, по существу не содержащего ловастатин, согласно настоящему изобретению, отличается тем, что раствор соли симвастатина, содержащий остаточное количество соли ловастатина, приводят во взаимодействие с ферментом ловастатин эстеразой, иммобилизованным на твердом носителе, нерастворимом в воде.

Преимущественно, фермент ковалентно связан с твердым носителем, активированным по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полисахарид или модифицированный полисахарид. Полисахарид представляет собой, главным образом, полигалактозид. В частности, модифицированный полисахарид представляет собой ди-(С_1-6алкил)амино С_1-6алкилцеллюлозу, особенно диэтиламиноэтилцеллюлозу.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой силикагель или модифицированный силикагель. В частности, модифицированный силикагель представляет собой силикагель, модифицированный амино-С_1-6алкил-три(С_1-6алкокси)силаном, предпочтительно аминопропилсиланизованный силикагель.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂- или -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C_1-6 алкил, или Y представляет собой -SO₂-Ar-SO₂-, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал может содержать C_1-6 алкильные заместители. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂-.

Преимущественно, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой галид циануровой кислоты, особенно цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой полигалактозид, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂-.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой диэтиламиноэтилцеллюлозу, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

Преимущественно, твердый носитель представляет собой аминопропилсиланизованный силикагель, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой цианурхлорид.

В частности, взаимодействие раствора соли симвастатина, содержащего остаточное количество соли ловастатина, с ферментом, иммобилизованным на твердом носителе, нерастворимом в воде, проводят при температуре от 26°С до 50°С.

Взаимодействие раствора соли симвастатина, содержащего остаточное количество соли ловастатина, с ферментом, иммобилизованным на твердом носителе, нерастворимом в воде, проводят предпочтительно непрерывно в проточном реакторе.

В частности, фермент представляет собой фермент, продуцируемый Clonostachys compactiuscula ATTC 38009, АТСС 74178.

Иммобилизация фермента делает возможным повторное применение одного и того же фермента без потери активности при правильно настроенных параметрах процесса.

Особенно важно то, что увеличивается сопротивляемость протеолитическому разложению, что позволяет проводить процесс без использования антисептических условий, и таким образом стоимость процесса значительно уменьшается.

Согласно одному варианту реализации изобретения, иммобилизованный фермент содержится в проточном реакторе. В реактор подают смесь статинов, состоящую из 15% ловастатина и 85% симвастатина. Указанная смесь представляет собой типичную смесь, получаемую в процессе химического синтеза. Концентрация соли симвастатина изменяется не более чем на 1%, при этом аммонийная соль ловастатина гидролизуется примерно на 87%. Степень конверсии не меняется в течение длительного гидролиза, а технологическая стабильность поддерживается в течение по меньшей мере 6 месяцев. Таким образом, иммобилизация фермента ловастатин эстеразы приводит к получению стабильного биокатализатора, обладающего стабильностью, достаточной для технологического применения при синтезе симвастатина.

Техническое решение согласно настоящему изобретению проиллюстрировано на фигурах, где на Фигуре 1 представлен разрез биокатализируемого проточного реактора в соответствии с изобретением, на Фигуре 2 представлены изменения степени конверсии ловастатина в зависимости от температуры.

В описании настоящего изобретения и пунктах формулы изобретения термин «триол» обозначает соединение, соответствующее формуле III,

где М представляет собой атом водорода, а также где М представляет собой катион металла или катион аммония, то есть соединение в форме кислоты или в форме соли, соответственно, если не указано иное значение. Так как соединение III в форме кислоты (М=Н) легко превращается в лактон, термин «триол» также может включать форму лактон-диола, соответствующую формуле IV, если не указано иное значение.

Термины «ловастатин» и «симвастатин» относятся к соединениям, обозначаемым формулами 1 и II, соответственно.

В описании настоящего изобретения и пунктов формулы изобретения термины «ловастатин» и «симвастатин» включают формы карбоксильных кислот данных соединений, обозначаемые формулами IV и V (М=Н) соответственно,

,

а также соли соединений, обозначаемых формулами IV и V, если не указано иного значения. Термин «соль ловастатина» представляет собой соединение, соответствующее формуле IV, где М представляет собой катион металла или катион аммония, термин «соль симвастатина» представляет собой соединение, соответствующее формуле V, где М представляет собой катион металла или катион аммония.

В описании настоящего изобретения и пунктах формулы изобретения термин «ловастатин эстераза» относится к пористым или непористым веществам природного или рекомбинантного происхождения, обладающим ферментной активностью, которая заключается в катализе гидролиза ловастатина и солей ловастатина с получением указанного выше триола или соли триола в условиях, при которых соли симвастатина не подвергаются ферментативному гидролизу или подвергаются ферментативному гидролизу со скоростью меньшей по меньшей мере на один порядок.

В описании настоящего изобретения и формуле изобретения водонерастворимый твердый носитель, нерастворимый в воде, представляет собой гранулированную или волокнистую твердый носитель, которая принципиально не подвергается растворению в воде, то есть не образует жидкого раствора или псевдораствора в воде, содержащего больше 0,1 г подложки на 100 г воды.

В описании настоящего изобретения и пунктах формулы изобретения ферментативная активность представляет собой микромолярное количество субстрата (ловастатина или симвастатина), которое гидролизуется в течение одной минуты одним миллиграммом фермента.

В описании настоящего изобретения и пунктах формулы изобретения протеиновая фракция представляет собой порцию смеси, полученной очисткой биологического препарата, в которой определенная общая концентрация протеинов больше нуля.

Гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы к ловастатину и солям ловастатина представляет собой способность гидролизующихся ловастатина и солей ловастатина образовывать указанный выше триол.

Гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы к симвастатину и солям симвастатина представляет собой способность гидролизующихся симвастатина и солей симвастатина образовывать указанный выше триол.

Гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы к ловастатину и солям ловастатина по меньшей мере на один порядок выше, чем гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы к симвастатину и солям симвастатина. Указанная активность может быть изменена путем иммобилизации фермента ловастатин эстеразы на твердом носителе, в частности на твердой нерастворимой в воде подложке. Не ограничивая сущность изобретения конкретной теорией, можно предположить, что вследствие химического связывания вышеуказанного фермента с поверхностью твердого носителя могут произойти модификации пространственной конфигурации фермента, что приводит к изменению относительного расположения активных групп фермента. Поэтому гидролитическая активность фермента ловастатин эстеразы, так же как и активность фермента после иммобилизации на твердом носителе, может отличаться от активности фермента в водной смеси. Такое различие проявляется в потере селективности гидролитической активности после иммобилизации на твердом носителе и/или в уменьшении активности.

Неожиданно было обнаружено, что именно сочетание водонерастворимого твердого носителя с по меньшей мере бифункциональным связывающим агентом обеспечивает возможность получения фермента, иммобилизованного на твердом носителе, нерастворимом в воде, что приводит к гидролитической активности по отношению к ловастатину и солям ловастатина по меньшей мере в 5 раз большей, в присутствии симвастатина и солей симвастатина, чем к симвастатину и солям симвастатина, причем фермент является достаточно активным для того, чтобы быть использованным для очистки и/или выделения симвастатина из смеси с ловастатином.

В способе согласно настоящему изобретению фермент ловастатин эстеразу иммобилизуют на полигалактозном носителе, такой как агароза (предпочтительно Sepharose В4), с использованием по меньшей мере бифункционального агента, соответствующего формуле , где Y представляет собой -SO₂- или -SO₂-(CHR)_n-SO₂-, где n представляет собой целое число от 1 до 18, R представляет собой атом водорода или C_1-6 алкил, или Y представляет собой -SO₂-Ar-SO₂-, где Ar представляет собой бивалентный арильный радикал, образующийся при удалении двух атомов водорода, непосредственно связанных с атомами углерода ароматического кольца, при этом бивалентный арильный радикал может содержать С_1-6 алкильные заместители. В частности, по меньшей мере бифункциональный агент, активирующий твердый носитель, представляет собой соединение, соответствующее формуле , где Y представляет собой -SO₂-, например, дивинилсульфон.

Способ активации твердого носителя на основе полигалактозы, в соответствии с изобретением, заключается во взаимодействии носителя с соединением, соответствующим формуле , предпочтительно дивинилсульфоном, приводящим к образованию активированного твердого носителя. Затем смесь, содержащая фермент ловастатин эстеразу, приготовленная в соответствии с известной техникой, с использованием буферного раствора, приводят в контакт с активированным твердым носителем при механическом перемешивании, в течение периода, достаточного для иммобилизации фермента на твердом носителе. После иммобилизации полученный биокатализатор отделяют фильтрованием, предпочтительно промывают водой и/или буферным раствором. Иммобилизованный фермент, в соответствии с изобретением, затем используют в способах очистки и/или отделения симвастатина.

Фермент, иммобилизованный на твердом носителе с использованием дивинилсульфона в качестве связывающего агента, использовали в реакции гидролиза смеси статинов, содержащей 15% ловастатина и 85% симвастатина, которая представляет собой типичную смесь, полученную в процессе получения симвастатина из ловастатина посредством химического синтеза. Для проведения реакции был разработан и произведен проточный реактор, представленный в разрезе на Фигуре 1. Проточный реактор, в соответствии с изобретением, состоит из тела 1 реактора с внутренним пространством 2, соединенным с подводом жидкости 3 и соединенным с отводом жидкости 4. Во внутреннем пространстве реактора находится подложка 5, содержащая иммобилизованный фермент. Процесс гидролиза проводили непрерывно, подавая раствор смеси аммонийных солей ловастатина и симвастатина через подвод жидкости 3 и получая продукт через отвод жидкости 4. Последовательные порции выходящего продукта были проанализированы при помощи ВЭЖХ с подтверждением того, что концентрация соли симвастатина менялась в течение процесса не более чем на 1% по отношению к первоначальной концентрации. Степень гидролиза аммонийной соли ловастатина составила по меньшей мере 87%. Степень конверсии не изменялась в течение процесса, проводившегося непрерывно в течение 120 часов, подтверждая, что проточный реактор, согласно настоящему изобретению, с подложкой 5, содержащей иммобилизованный фермент ловастатин эстеразу, может быть эффективно использован в способе получения, выделения и/или очистки симвастатина из смеси статинов, содержащей симвастатин и ловастатин.

Технологическую стабильность реактора, в соответствии с изобретением, проверили повторением эксперимента, заключающегося в гидролизе смеси статинов, содержащей 15% ловастатина и 85% симвастатина, после 6-месячного простоя реактора при +4°С. Процесс гидролиза проводили непрерывно, подавая раствор смеси аммонийных солей ловастатина и симвастатина через подвод жидкости 3 с получением продукта из отвода жидкости 4. Последовательные порции выходящего продукта были проанализированы при помощи ВЭЖХ, с подтверждением того, что концентрация соли симвастатина менялась в течение процесса не более чем на 1% по отношению к первоначальной концентрации. Степень гидролиза аммонийной соли ловастатина составила по меньшей мере 96%. Данные, представленные в Таблице 3, показывают, что время простоя проточного реактора значительно не сказывается на его рабочих характеристиках. В течение 25 часов степень конверсии ловастатина оставалась практически неизменной, подтверждая то, что иммобилизованный фермент, согласно настоящему изобретению, сохранял свою активность, так же как и селективность гидролиза солей ловастатина в присутствии солей симвастатина. Следовательно, иммобилизация фермента на твердом носителе приводит к получению стабильного биокатализатора, обладающего стабильностью, достаточной для использования в способе получения, выделения и/или очистки симвастатина.

В другом варианте реализации способа иммобилизации фермента на твердом носителе, согласно настоящему изобретению, активировали твердую нерастворимую в воде подложку, представляющую собой силикагель, модифицированный амино-C_1-6алкил-три(С_1-6алкокси)силаном, предпочтительно силикагель, модифицированный аминопропилсилильными группами. Для активации использовали по меньшей мере бифункциональный активирующий агент, представляющий собой производное циануровой кислоты (1,3,5-триазин-2,4,6-триол производное), такое как галогенангидрид циануровой кислоты, или в котором по меньшей мере гидроксильные группы были замещены заместителем галогеном или O-сульфонатной группой, такое как галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты.

Силикагель, модифицированный амино-С_1-6алкил-три(С_1-6алкокси)силаном, активировали посредством обработки раствором производного циануровой кислоты с последующим суспендированием в буферном растворе и добавлением смеси, содержащей фермент ловастатин эстеразу, механического перемешивания в течение времени, достаточного для иммобилизации фермента на твердом носителе. Иммобилизацию проводили как с использованием неочищенного фермента, так и фермента, очищенного посредством хроматографии. При использовании аминопропилсиланизованного силикагеля в качестве предпочтительной твердого носителя и цианурхлорида в качестве предпочтительного связывающего агента было определено, что применение очищенного фермента приводит к увеличенной эффективности иммобилизации фермента. Кроме того, иммобилизованный фермент, в соответствии с изобретением, полученный с использованием неочищенного фермента, приводит к активности меньшей, чем у иммобилизованного фермента согласно настоящему изобретению, полученного с использованием очищенного фермента.

В другом варианте реализации способа иммобилизации фермента согласно настоящему изобретению активируют твердый носитель, нерастворимый в воде, такой как целлюлоза, модифицированная ди-(С_1-6алкил)амино-С_1-6алкильными группами. Примером такого твердого носителя является диэтиламиноэтилцеллюлоза. Для активации используют по меньшей мере бифункциональный активирующий агент, предпочтительно представляющий собой производное циануровой кислоты (1,3,5-триазин-2,4,6-триол производное), в котором по меньшей мере две гидроксильные группы замещены галогеном или O-сульфонатной группой, такое как галогенангидрид циануровой кислоты и/или O-сульфонат циануровой кислоты.

Целлюлозу, модифицированную ди-(С_1-6алкил)амино-С_1-6алкильными группами, активировали с использованием раствора производного циануровой кислоты, возможно в присутствии основания, с получением активированного твердого носителя. Твердый носитель суспендировали в буферном растворе и добавляли смесь, содержащую фермент ловастатин эстеразу, при механическом перемешивании в течение периода, достаточного для иммобилизации фермента на твердом носителе. Иммобилизованный фермент, в соответствии с изобретением, затем используют в процессах получения, выделения и/или очистки симвастатина.

Фермент, иммобилизованный на целлюлозе, модифицированной диэтилоаминоэтильными группами, с использованием хлорангидрида циануровой кислоты в качестве связывающего агента, использовали в процессе гидролиза смеси статинов, смеси аммонийных солей ловастатина и симвастатина, с достижением очень высокой степени конверсии (>99%) соли ловастатина в триол в течение нескольких часов. Фермент, иммобилизованный на твердом носителе диэтиламиноэтилцеллюлозы, обладающий даже большей активностью, получили с использованием активированного твердого носителя диэтиламиноэтилцеллюлозы, предварительно прокаленного в автоклаве.

Полученный иммобилизованный фермент согласно настоящему изобретению использовали в качестве носителя для реактора, в соответствии с изобретением, как показано на Фигуре 1. Реактор поместили в термостатируемый корпус, обладающий температурой, зафиксированной на 28°С. Процесс гидролиза проводили непрерывно, подавая раствор смеси аммонийных солей ловастатина и симвастатина через подвод жидкости 3 и собирая выходящий продукт через отвод жидкости 4. Последовательные порции выходящего продукта анализировали при помощи ВЭЖХ каждые 4 часа. В течение работы реактора скорость потока модифицировали и записывали изменения в степени конверсии ловастатина. Было обнаружено, что уменьшение степени конверсии ловастатина происходит при скорости потока, превышающей предельную скорость потока (т.е. максимальную скорость потока, при которой степень конверсии ловастатина составляет 100%). Для скоростей потока, превышающих предельную скорость потока (когда степени конверсии значительно ниже, чем при предельной скорости потока) были определены изменения степени конверсии ловастатина в зависимости от температуры реактора. Измерения проводили для серий температур. Результаты представлены на диаграмме (Фигура 2).

Было определено, что при 37°С фермент ловастатин эстераза, иммобилизованный на твердом носителе, нерастворимом в воде, в соответствии с изобретением проявляет наибольшую активность (Фигура 2).

Техническое решение согласно настоящему изобретению раскрыто более подробно в нижеследующих примерах. Далее по тексту термин «LE фермент» означает фермент ловастатин эстераза.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Выделение и очистка фермента

LE фермент продуцируется грибом рода Clonostachys compactiuscula, депонированным под номером АТСС 38009. Гриб получали в соответствии с процедурой, описанной в литературе (патент США №5,223,415).

1а. Выделение LE фермента из мицелия

Мицелий Clonostachys compactiuscula (59 г) растирали стеклянной дробью (0,4 г) в жидком азоте в течение 8 часов, затем его экстрагировали фосфатным буфером (60 мл, рН 6,5), а твердые компоненты отделили с помощью центрифугирования (12000 об/мин; 10 минут; 4°С). Супернатант отделили и повторили процедуру экстракции в буферном растворе (40 мл). Супернатанты объединили и отфильтровали через обычный фильтр до выхода фильтрата 110 мл, далее в описании обозначаемого как супернатант Х1 (C_{протеин}=4180 мкг/мл).

1b. Очистка ловастатин эстеразы посредством высаливания активной протеиновой фракции

К супернатанту Х1 (20 мл) добавили сульфат аммония до достижения концентрации 40% (4,62 г, 1 час, 0°С). Далее рас