Способы, связанные с гликозилированием клеточной поверхности

Способы, связанные с гликозилированием клеточной поверхности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на связанные заявки

Эта заявка заявляет приоритет по предварительной заявке Соединенных Штатов, номер 60/923,688, поданной 16 апреля 2007 года, полное содержание которой включено в данное изобретение посредством ссылки.

Предпосылки заявки изобретения

Конфигурация гликозилирования гликопротеина часто играет важную роль в функции такого гликопротеина. При рассмотрении лишь нескольких примеров видно, что конфигурация гликозилирования гликопротеина может влиять на способность его молекул правильно складываться, на его устойчивость (например, устойчивость к протеолитическому и/или иному расщеплению), каталитическую активность, фармакодинамические и/или фармакокинетические свойства и/или на способность такого гликопротеина взаимодействовать должным образом с другими молекулами. Как альтернатива или дополнение конфигурация гликозилирования гликопротеина может влиять на перенос и наведение гликопротеина. Например, конфигурация гликозилирования гликопротеина может влиять на то, останется ли гликопротеин внутриклеточным (в том числе, например, правильное наведение гликопротеина в надлежащий субклеточный компартмент или компартменты), будет ли он мембранно-связанным и/или выделенным из клетки. По этим причинам важно иметь возможность идентификации и/или исследования конфигураций гликозилирования гликопротеина.

Сущность изобретения

Раскрытие сущности изобретения частично основано на понимании того, что гликаны клеточной поверхности могут обеспечить информацию о состоянии клетки, например, так, как показано в гликозилировании протеинов, продуцируемых клеткой. В частности, было обнаружено, что поверхность клеток гликанов может предоставить информацию о статусе гликозилирования гликопротеинов, продуцируемых (и по желанию секретированных) клеткой. Таким образом не требуется изолировать заказной протеин от клетки для получения информации о статусе его гликозилирования. Точнее, гликозилирование одного или более протеинов или липидов на клеточной поверхности может быть оценено для косвенного раскрытия одного или более аспектов гликозилирования целевого протеина. Это может упростить и облегчить анализ гликозилирования целевого протеина.

Среди всего прочего раскрытие сущности настоящего изобретения обеспечивает способы для выполнения анализа гликанов клеточной поверхности в тех клетках, которые производят, по меньшей мере, один заказной гликопротеин. Обнаружение гликанов клеточной поверхности служит заменителем обнаружения гликозилирования целевого гликопротеина (то есть обнаруженные гликаны не находятся ни на целевых гликопротеинах, ни выделенно от них). Во многих вариантах выполнения изобретения целевой гликопротеин - это гликопротеин, который не находится на клеточной поверхности. Например, целевой гликопротеин является растворимым или выделенным из клетки. В таких вариантах выполнения изобретения обнаружение гликанов клеточной поверхности служит в качестве заменителя для определения структуры конкретного гликана в гликопротеине, который произведен вне клеточной поверхности.

В определенных вариантах выполнения изобретения раскрытие сущности настоящего изобретения обеспечивает способы, когда клетка, которая продуцирует интересующий гликопротеин (например, гликопротеин, расположенный не на клеточной поверхности, или любой другой гликопротеин, отличный от того, чьи имеющие к нему отношение гликаны проанализированы напрямую), культивируется при условиях, которые позволяют найти экспрессию интересующего гликопротеина и затем вступить в реакцию с одним или более реагентами, обнаруживающими гликозилирование гликана на клеточной поверхности, которая не является частью интересующего гликопротеина. Обычно такие способы не включают стадию отщепления интересующего гликопротеина. К тому же во многих вариантах выполнения изобретения в такие стадии не входит любой прямой анализ интересующего гликопротеина. Соответственно, в таких вариантах выполнения изобретения анализ гликана клеточной поверхности используется как заменитель оценки гликозилирования целевого гликопротеина.

В некоторых вариантах выполнения изобретения согласно раскрытию его сущности важной рабочей клеткой является клетка млекопитающегося, например клетка яичника китайского хомячка (CHO). В некоторых вариантах выполнения изобретения согласно раскрытию его сущности видно, что целевой гликопротеин является средством, используемым как лекарство; в некоторых вариантах выполнения изобретения целевой гликопротеин содержит антитело или фрагмент антитела.

В некоторых аспектах раскрытие сущности изобретения обеспечивает способы идентификации свойства гликозилирования продуцируемого клеткой гликопротеина за счет оценки свойства гликана клетки, полученного на клеточной поверхности (например, гликан клеточной поверхности на гликопротеине или гликолипид на клеточной поверхности). В некоторых аспектах свойство гликана может коррелироваться в большей степени на общих основаниях по состоянию клетки, например по жизнеспособности клетки, ее морфологии, плотности или по другому свойству, на которое могут повлиять другие условия рабочего процесса, например те, что имеют место в процессе культивирования клетки, например в процессе производства продукта гликопротеина из клетки. Таким образом, варианты выполнения изобретения согласно раскрытию его сущности могут быть использованы в многообразии различных контекстов, например, среди всего прочего гликаны клеточной поверхности можно оценить для:

(а) оценки или прогнозирования характеристик гликозилирования продукта гликопротеина, например продукта лечебного гликопротеина;

(b) контроля качества продукта гликопротеина (например, структуры гликана) во время одного или более стадий процесса производства продукта гликопротеина;

(c) обнаружения изменений в условиях рабочего процесса производства продукта гликопротеина,

(d) предоставления информации (например, для сравнения) о различных партиях препарата гликопротеина,

(e) предоставления информации (например, для сравнения) о статусе клетки или продукта гликопротеина во время нескольких различных стадий процесса производства продукта гликопротеина;

(f) предоставления информации (например, для сравнения) о статусе клетки или продукта гликопротеина во время той самой стадии во множестве рабочих процессов для производства продукта гликопротеина; и/или

(g) предоставления информации (например, для сравнения) о характеристиках гликозилирования продукта гликопротеина, продуцируемого двумя или более клетками или популяциями клеток (например, клональными популяциями, полученными из отдельных клеток, которые выбираются из начальной популяции клетки), выращенных при аналогичных или идентичных условиях.

Краткое описание фигур

Фиг.1 показывает уровни фукозилирования ядра на экспрессивно выраженном гликопротеине антитела, не расположенного на клеточной поверхности, который получен в среде клеточной культуры вместе с увеличенным дополнением глюкозамином или без него.

Фиг.2 показывает уровни фукозилирования гликопротеинов клеточной поверхности, полученных в среде клеточной культуры вместе с дополнением в виде увеличенного дополнением глюкозамином или без него.

Фиг.3A-B показывают структуры гликана в гликопротеинах клеточной поверхности, выращенных в контролируемой среде (Фиг.3A) или в среде, содержащей увеличенное дополнение глюкозамином (Фиг.3Б).

Фиг.4 показывает проведение анализа с помощью жидкостной хроматографии применительно к уровням сиаловой кислоты для экспрессивно выраженных (не на клеточной поверхности) гликопротеинов клеточной поверхности с рекомбинантным антителом.

Фиг.5 показывает уровни сиаловой кислоты экспрессивно выраженного гликопротеина с антителом, продуцируемого в среде клеточной культуры, с повышенной концентрацией N-ацетилманнозамина или без нее так, как измерено в результате маркирования образца диметилбутадиеном или после применения высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Фиг.6 показывает уровни сиаловой кислоты гликопротеинов клеточной поверхности в среде клеточной культуры при повышенной концентрации N-ацетилманнозамина или без нее так, как измерено в результате маркирования образца диметилбутадиеном или после применения высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Фиг.7 показывает уровни сиаловой кислоты гликопротеинов клеточной поверхности в среде клеточной культуры при повышенной концентрации N-ацетилманнозамина или без нее так, как измерено с помощью фиксации лектина, специфичного к сиаловой кислоте, и проточной цитометрии.

Фиг.8 показывает содержание сиаловой кислоты на клеточной поверхности, которое определено с помощью ионообменной хроматографии, проведенной в отношении гликанов клеточной поверхности. На верхней хроматограмме показана перегруппировка нейтрального (NA2F), моносиализированного (A1), дисиализированного (A2) или трисиализированного (A3) стандартных образцов. На нижней хроматограмме показаны репрезентативные данные по гликанам клеточной поверхности для клеток яичника китайского хомячка и относительные процентные отношения.

Определения

Приблизительно, около, примерно: Использованные в данном изобретении термины “приблизительно”, “около” или “примерно” применительно к одному или более представляющим интерес значениям относятся к значению, которое соответствует установленному контрольному значению. В определенных вариантах выполнения изобретения термины “приблизительно”, “около” или “примерно” ссылаются на диапазон значений, которые оказываются в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или величины меньше установленного контрольного значения.

Биологический образец: В использованном здесь смысле термин “биологический образец” имеет отношение к любому твердому или жидкому образцу, полученному, выделенному или секретированному любой живой клеткой или организмом, включая, но, не ограничиваясь, тканевой культурой, образцом ферментера, тканью человека или животного, растением, фруктами, овощами, одноклеточными организмами (такими, как бактерии и дрожжи) и многоклеточными организмами. Например, биологический образец может быть биологической жидкостью, полученной, например, из крови, плазмы, сыворотки, мочи, желчи, семенной жидкости, спинномозговой жидкости, водянистой влаги или эндолимфы либо любой секреции человеческого тела, отечной жидкости, экссудата (например, жидкости, полученной из абсцесса или любого другого инфицированного или воспаленного участка тела), или жидкостью, полученной из сустава (например, здорового сустава или сустава, пораженного такой болезнью, как ревматоидный артрит, остеоартрит, подагра или септический артрит). Биологический образец также может быть, например, образцом, полученным из любого органа или ткани (включая образчики, полученные в результате биопсии или аутопсии), может содержать клетки (либо эмбриональные или культивируемые), быть средой, кондиционированной любой клеткой, тканью либо органом, тканевой культурой.

Гликопротеин клеточной поверхности: Термин “гликопротеин клеточной поверхности” в использованном здесь смысле имеет отношение к гликопротеину, по меньшей мере, часть которого присутствует на внешней клеточной поверхности. В некоторых вариантах выполнения изобретения гликопротеин клеточной поверхности представляет собой протеин, который располагается на клеточной поверхности так, что, по меньшей мере, одна из структур гликанов находится на внешней клеточной поверхности.

Гликан клеточной поверхности: “Гликан клеточной поверхности” - это тот гликан, который присутствует на внешней клеточной поверхности. Во многих вариантах выполнения изобретения из представленного раскрытия его сущности гликан клеточной поверхности ковалентно связан с пептидом как часть гликопротеина клеточной поверхности. Гликан клеточной поверхности также может быть связан с липидом клеточной мембраны.

Корреляция: Термин “корреляция” в использованном здесь смысле имеет отношение к установлению прогнозируемого взаимоотношения двух понятий. В описанных здесь вариантах выполнения изобретения конфигурация гликозилирования (или ее характеристика) на клеточной поверхности коррелируется с конфигурацией гликозилирования (или ее характеристикой) целевого гликоконъюгата (например, гликопротеина), продуцируемого клеткой. Скоррелированные конфигурации (или характеристики) не должны быть идентичными между собой столь долго, сколько одна из них может быть спрогнозирована на основании другой. После установления корреляции можно внести, например, ее данные письменно в журнал или иным образом зафиксировать на носителе или в памяти (например, на носителе, читаемом на компьютере или в базе данных либо на диске). После этого обнаружение скоррелированной конфигурации гликозилирования (или ее характеристики) может повлечь за собой ссылку на письменную или внесенную в носитель запись либо передачу данных на компаратор для проведения эксперимента, подтверждающего корреляцию, и т.д. Такой эксперимент с применением компаратора можно провести одновременно с оценкой конфигурации гликозилирования (или ее характеристики) или как эксперимент с привлечением к сравнению давних данных либо для прогнозирования будущей конфигурации.

Гликан: На основании того, что известно из предметной области и используется в данном изобретении, «гликаны» являются сахарами. Гликаны могут быть мономерами или полимерами сахарных остатков, однако они обычно содержат, по меньшей мере, три вида сахаров и могут иметь линейную или разветвленную структуру. Гликан может содержать остатки натурального сахара (например, глюкозу, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилнейраминовую кислоту, галактозу, маннозу, фукозу, гексозу, арабинозу, рибозу, ксилозу и т.д.) и/или модицифированные сахара (например, 2'-фторорибозу, 2'-дезоксирибозу, фосфоманнозу, 6'-сульфо-N-ацетилглюкозамин и т.д.). Термин “гликан” включает гомополимеры и гетерополимеры сахарных остатков. Термин “гликан” также охватывает гликанный компонент гликоконъюгата (например, гликопротеин, гликолипид, протеогликан и т.д.). Этот термин также охватывает свободные гликаны, в том числе и те гликаны, которые были расщеплены или иным образом освобождены от гликоконъюгата.

Препарат гликана: Термин “препарат гликана” в использованном здесь смысле имеет отношение к набору гликанов, полученных согласно конкретному производственному способу. В некоторых вариантах выполнения изобретения препарат гликана имеет отношение к набору гликанов, полученных из препарата гликопротеина (смотрите ниже определение препарата гликопротеина).

Гликоконъюгат: Термин “гликоконъюгат” в использованном здесь смысле включает все молекулы, в которых, по меньшей мере, одна составляющая сахара ковалентно связана, по меньшей мере, с одной другой составляющей. Этот термин конкретно охватывает все биомолекулы с ковалентно присоединенными составляющими сахара, в том числе, например, N-связанными гликопротеинами, O-связанными гликопротеинами, гликолипидами, протеогликанами и т.д.

Гликоформ: Термин «гликоформ» используется в данном изобретении для ссылки на конкретную форму гликоконъюгата. То есть, когда та же самая составляющая остова белка (например, полипептида, липида и т.д.), которая является частью гликоконъюгата, может быть связана с другими гликанами или наборами гликанов, то на любой иной вариант выполнения гликоконъюгата (то есть там, где остов белка связан с конкретным набором гликанов) идет ссылка как на “гликоформ.”

Гликолипид: Термин “гликолипид” в использованном здесь смысле указывает на липид, содержащий один или более ковалентно связанных составляющих сахара (то есть гликанов). Составляющая (составляющие) сахара может быть представлена в форме моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов и/или гликанов. Составляющая (составляющие) сахара может охватывать отдельную неразветвленную цепь сахарных остатков или состоять из одной или более разветвленных цепей. В определенных вариантах выполнения изобретения сахарные составляющие могут содержать группы сульфатов и/или фосфатов. В определенных вариантах выполнения изобретения гликопротеины содержат O-связанные составляющие сахара; а в определенных вариантах выполнения изобретения - N-связанные составляющие сахара.

Гликопротеин: Термин “гликопротеин” в использованном здесь смысле указывает на белок, который содержит остов пептида, ковалентно связанного с одной или более составляющими сахара (то есть гликанами). Специалистам, квалифицированным в предметной области, понятно, что остов пептида обычно состоит из линейной цепи остатков аминокислот. В определенных вариантах выполнения изобретения остов пептида перекрывает клеточную мембрану так, что охватывает ее трансмембранную и внеклеточную часть. В определенных вариантах выполнения изобретения остов пептида гликопротеина, который перекрывает клеточную мембрану, охватывает ее внутриклеточную, трансмембранную и внеклеточную часть. В определенных вариантах выполнения настоящего изобретения способы раскрытия его сущности изобретения включают расщепление гликопротеина клеточной поверхности с помощью протеазы для высвобождения внеклеточной части гликопротеина или ее доли, причем такое воздействие незначительно разрушает клеточную мембрану. Составляющая (составляющие) сахара может быть представлена в форме моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов и/или гликанов. Составляющая (составляющие) сахара может охватывать отдельную неразветвленную цепь сахарных остатков или состоять из одной или более разветвленных цепей. В определенных вариантах выполнения изобретения сахарные составляющие могут содержать группы сульфатов и/или фосфатов. Как альтернатива или дополнение составляющие сахара могут содержать ацетил, гликолил, пропил или другие модификации алкильной группы. В определенных вариантах выполнения изобретения гликопротеины содержат O-связанные составляющие сахара; а в определенных вариантах выполнения изобретения - N-связанные составляющие сахара. В определенных вариантах выполнения изобретения способы, представленные в данном изобретении, охватывают стадию анализа любого или всех гликопротеинов клеточной поверхности, высвобожденных фрагментов (например, гликопептидов) гликопротеинов клеточной поверхности, гликанов клеточной поверхности, присоединенных к гликопротеинам клеточной поверхности, остовов пептидов гликопротеинов клеточной поверхности, фрагментов таких гликопротеинов, гликанов и/или остовов пептидов, а также комбинаций этих соединений.

Препарат гликопротеина: Термин “Препарат гликопротеина” в использованном здесь смысле указывает на набор отдельных молекул гликопротеина, каждая из которых содержит полипептид, куда входит последовательность конкретных аминокислот (которая включает, по меньшей мере, один сайт гликозилирования), и, по меньшей мере, один гликан, ковалентно присоединенный, по меньшей мере, к одному сайту гликозилирования. Отдельные молекулы конкретного гликопротеина в пределах препарата гликопротеина обычно представляют собой идентичные последовательности аминокислот, которые, тем не менее, могут отличаться наполняемостью, по меньшей мере, одного сайта гликозилирования и/или идентичностью гликанов, связанных, по меньшей мере, с одним сайтом гликозилирования. То есть препарат гликопротеина может содержать только один гликоформ конкретного гликопротеина, однако в нем обычно содержится множество гликоформ. Различные препараты одного и того же гликопротеина могут отличаться идентичностью присутствующих гликоформ (например, гликоформ, присутствующий в одном препарате, может отсутствовать в другом) и/или относительными количествами различных гликоформ.

Гликозидаза: Термин “гликозидаза” в использованном здесь смысле указывает на агент, который расщепляет ковалентную связь между последовательно расположенными сахарами в гликане или между сахаром и составляющей остова протеина (например, между сахаром и остовом пептида гликопротеина). В некоторых вариантах выполнения изобретения гликозидаза является ферментом. В определенных вариантах выполнения изобретения гликозидаза является протеином (например, протеиновым ферментом), состоящим из одной или более полипептидных цепей. В определенных вариантах выполнения изобретения гликозидаза является агентом химического расщепления.

Конфигурация гликозилирования: Термин “конфигурация гликозилирования” в использованном здесь смысле указывает на набор структур гликанов, присутствующий в конкретном образце. Например, конкретный гликоконъюгат (например, гликопротеин) или набор гликоконъюгатов (например, набор гликопротеинов) будет иметь конфигурацию гликозилирования. В некоторых вариантах выполнения изобретения делается ссылка на конфигурацию гликозилирования гликанов клеточной поверхности или на «конфигурацию гликозилирования поверхности». Термин «структура гликозилирования поверхности» в использованном здесь смысле может указывать на конфигурацию гликанов (или на «конфигурацию гликозилирования»), которая существует во внеклеточной области интересующего отдельного гликопротеина клеточной поверхности и/или гликолипида. В качестве дополнения или альтернативы термин «конфигурация гликозилирования поверхности» может указывать на конфигурацию гликанов (или на «конфигурацию гликозилирования»), которая существует во внеклеточной области множества гликопротеинов клеточной поверхности и/или гликолипидов. В определенных вариантах выполнения изобретения «конфигурация гликозилирования поверхности» описывает конфигурацию гликанов (или «конфигурацию гликозилирования»), которая существует во всем хромосомном наборе гликопротеинов и/или гликолипидов клеточной поверхности. Основываясь на контексте, специалисты обычной квалификации в предметной области быстро поймут, к чему относится термин «конфигурация гликозилирования поверхности» - к конфигурации гликозилирования отдельного гликопротеина клеточной поверхности и/или гликолипида либо к конфигурации гликозилирования множества гликопротеинов клеточной поверхности и/или гликолипидов. Конфигурация гликозилирования может характеризоваться, например, идентичностями гликанов, количествами (в абсолютных или относительных единицах) отдельных гликанов или гликанов конкретного типа, степенью заполнения сайтов гликозилирования и т.д. или комбинациями таких параметров.

N-гликан: Термин “N-гликан” в использованном здесь смысле указывает на полимер сахаров, который высвобожден из гликоконъюгата, однако ранее был связан с ним с помощью связи через азот (ниже смотрите определение N-связанного гликана).

N-связанные гликаны: N-связанными гликанами являются те гликаны, которые связаны с гликоконъюгатом с помощью связи через азот. Существует разнообразный набор N-связанных гликанов, однако он обычно основан на типичном сердцевинном пентасахариде (Man)3(GlcNAc)(GlcNAc).

O-гликан: Термин “O-гликан” в использованном здесь смысле указывает на полимер сахаров, который высвобожден из гликоконъюгата, однако ранее был связан с ним с помощью связи через кислород (ниже смотрите определение O-связанного гликана).

O-связанные гликаны: O- связанными гликанами являются те гликаны, которые связаны с гликоконъюгатом с помощью связи через кислород. O-связанные гликаны обычно присоединяются к гликопротеинам через N-ацетил-D-галактозамин (GalNAc) или же через N-ацетил-D-глюкозамин (GlcNAc), сцепляясь с гидроксильной группой L-серин (Ser) либо L-треонин (Thr). Некоторые O-связанные гликаны также имеют такие модификации, полученные после ацетилирования и сульфатирования. В некоторых случаях O-связанные гликаны присоединяются к гликопротеинам через фукозу или же через маннозу, сцепляясь с гидроксильной группой L-серин (Ser) либо L-треонин (Thr).

Фосфорилирование: В использованном здесь смысле термин «фосфорилирование» указывает на процесс ковалентного добавления одной или более фосфатных групп к молекуле (например, к гликану).

Протеаза: Термин “протеаза” в использованном здесь смысле указывает на агент, который расщепляет пептидную связь между последовательными аминокислотами в полипептидной цепи. В некоторых вариантах выполнения изобретения протеаза является ферментом (то есть протеолитическим ферментом). В определенных вариантах выполнения изобретения протеаза является протеином (например, протеиновым ферментом), состоящим из одной или более полипептидных цепей. В определенных вариантах выполнения изобретения протеаза - это агент химического расщепления.

Протеин: В общем случае «протеин» - это полипептид (то есть цепь, по меньшей мере, двух аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями). Протеины могут включать составляющие, отличные от аминокислот (например, это могут быть гликопротеины), и/или подвергаться иной обработке или модификации. Специалистам обычной квалификации в предметной области следует обратить внимание на то, что “протеин” может быть полностью полипептидной цепью в том виде, в каком его образовала клетка (с сигнальной последовательностью или без нее), или функциональной частью этого. Специалистам обычной квалификации в дальнейшем следует обратить внимание на то, что иногда протеин может включать более одной полипептидной цепи, которая, например, присоединяется с помощью одной или более дисульфидных связей или посредством других средств.

Сиаловая кислота: Термин “сиаловая кислота” в использованном здесь смысле является родовым термином N- или O-замещенных производных соединений нейраминовой кислоты, то есть 9-углеродным моносахаридом. Аминовая группа нейраминовой кислоты обычно привносит либо ацетиловую или гликольную группу в сиаловую кислоту. Гидроксильные заместители, которые присутствуют в сиаловой кислоте, могут быть модицированы ацетилированием, метилированием, сульфатированием и фосфорилированием. Доминирующая сиаловая кислота представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту (Neu5Ac). Сиаловые кислоты наделяют гликаны отрицательным зарядом, потому что карбоксильная группа имеет тенденцию диссоциировать протон физического водородного показателя pH. Типичные лишенные протонов сиаловые кислоты представлены ниже:

В основном: В использованном здесь смысле термин “в основном” указывает на качественное условие проявления в полной или почти полной мере или степени представляющей интерес характеристики или свойства. Специалист обычной квалификации по биологическим технологиям должен понимать, что биологические или химические явления редко, если вообще когда-либо, стремятся к завершению и/или продолжаются до полной завершенности либо достигают или отклоняются от абсолютного результата. Следовательно, термин “в основном” используется в данном изобретении для принятия во внимание возможного отсутствия завершенности, присущего многим биологическим или химическим явлениям. Дадим только один конкретный пример, когда сообщается, что обработка “в основном” не разрушает клеточные мембраны, и это указывает на следующее - все или большинство клеточных мембран остаются невредимыми во время и после обработки, вследствие чего, например, внутриклеточные гликопротеины или гликопептиды не высвобождаются из клеток. В определенных вариантах выполнения изобретения термин “в основном” применительно к невредимым клеточным мембранам, указывает на условие, когда 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньшее число клеток, подвергнутых конкретной обработке, демонстрируют измеримое количество поврежденных клеточных мембран. В определенных вариантах выполнения изобретения термин “в основном” применительно к невредимым клеточным мембранам, указывает на состояние дел, когда ни одна из клеток, подвергнутых конкретной обработке, не демонстрирует измеримое количество поврежденных клеточных мембран.

Подробное описание определенных вариантов выполнения изобретения

Как описано в данном изобретении, раскрытие сущности настоящего изобретения связано с обнаружением структур гликанов, находящихся на поверхности клеток, присутствие, идентичность и/или распределение (например, в относительных величинах) которых предоставляет информацию о состоянии клетки, например информацию о состоянии гликозилирования и/или характеристиках одного или более гликопротеинов, расположенных вне клеточной поверхности и продуцируемых клетками. То есть в одном аспекте раскрытия сущности изобретения гликаны клеточной поверхности действуют как заменитель способа для определения структур гликана и/или конфигурации гликозилирования, обнаруженной на гликопротеинах, расположенных вне клеточной поверхности. В некоторых вариантах выполнения изобретения согласно раскрытию его сущности гликопротеины, расположенные вне клеточной поверхности, относятся к лечебным гликопротеинам. В некоторых таких вариантах выполнения изобретения в клетку вносятся изменения для придания ей свойств лечебного протеина на предопределенном уровне или при заранее предопределенных условиях.

Гликаны клеточной поверхности

Для такого гликозилирования существуют много различных типов гликозилата клеток, по меньшей мере, некоторые продуцируемые ими протеины и/или липиды, а также несколько различных механизмов. Однако в общем случае цепи олигосахаридов связаны с цепью полипептида (то есть с протеином) и/или липида в эндоплазматической сети и в комплексе Гольджи с помощью либо N-связи или O-связи.

N-связанное гликозилирование

Обычно цепочки N-связанного олигосахарида добавляются к протеину в полости эндоплазматической сети (обратитесь к работе Alberts et al., журнал Molecular Biology of the Cell (Молекулярная биология клетки), 1994, указанной здесь посредством ссылки). Начальный олигосахарид (обычно 14-сахарный) конкретно добавляется в аминогруппу к боковой цепи остатка амида, которая входит в состав целевой консенсусной последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой за исключением пирролидин-карбоновой кислоты. Структура этого начального олигосахарида обычна для большинства эукариотов и содержит 3 остатка глюкозы, 9 остатков маннозы и 2 остатка 2 N-ацетилглюкозамина. Эта первоначальная цепочка олигосахарида обычно урезается посредством особых ферментов гликозидазы в эндоплазматической сети, что приводит к получению олигосахарида с короткой разветвленной сердцевиной ядра, состоящей из двух остатков N-ацетилглюкозамина и трех остатков маннозы.

N-гликаны могут быть подразделены на три отдельные группы, названные «маннозным типом высокого уровня» «гибридным типом» и «комплексным типом» с общим ядром пентасахарида (Man(α1,6)-(Man(α1,3))-Man(β1,4)-GlcpNAc(β1,4)-GlcpNAc(β1,N)-Asn), которое встречается во всех трех группах.

После начальной обработки в эндоплазматической сети гликопротеины вносятся в комплекс Гольджи, где происходит их дальнейшая обработка. Если гликан переносится в комплекс Гольджи перед моментом его полного урезания до структуры занимающего ядро пентасахарида, то он становится “высокоманнозным гликаном”.

Как альтернативу или дополнение одну или более моносахаридных единиц N-ацетилглюкозамина можно добавить к маннозных субъединицам ядра для образования «сложных олигосахаридов». К субъединицам N-ацетилглюкозамина можно добавить галактозу, а субъединицы сиаловой кислоты - к субъединицам галактозы, что приведет к получению цепей, оканчивающихся молекулами любого соединения - сиаловой кислоты, галактозы или N-ацетилглюкозаминового остатка. Кроме того, к остатку N-ацетилглюкозамина олигосахарида, занимающего положение ядра, можно добавить остаток фукозы. Каждая из этих добавок катализируется посредством особых гликозиловых трансфераз.

«Гибридные гликаны» охватывают характеристики как высокоманнозного, так и сложного гликана. Например, одна ветвь гибридного гликана может охватывать главным образом и исключительно остатки маннозы, тогда как другая ветвь N-ацетилглюкозамин - сиаловую кислоту, галактозу и/или фукозные сахара.

O-связанное гликозилирование

Цепи O-связанных олигосахаридов добавляются к специфическим остаткам серина или треонина в цепях полипептидов. Перенос первого остатка сахара, который во многих случаях представляет собой N-ацетилгалактозамин, обычно начинается в эндоплазматической сети и завершается в комплексе Гольджи. Остатки O-связанного олигосахарида добавляются по одному за один раз, и добавка каждого остатка катализируется конкретным ферментом. В противоположность N-связанному гликозилированию согласованная последовательность аминокислот для O-связанного гликозилирования определена менее надежно.

Целевые гликопротеины

Способы раскрытия сущности настоящего изобретения могут применяться для оценки состояния гликозилирования любого гликопротеина, расположенного вне клеточной поверхности, или любого другого интересующего гликопротеина, отличного от того, чьи гликаны анализируются непосредственно или производятся конкретной клеткой или популяцией клеток. Идентичность интересующего гликопротеина, расположенного вне клеточной поверхности, не предназначена для ограничения раскрытия сущности настоящего изобретения. Однако в большинстве вариантов выполнения изобретения клетка или клетки, как известно, производят определенный интересующий гликопротеин («целевой» гликопротеин), чье состояние гликозилирования следует оценить.

Во многих вариантах выполнения изобретения представляющим интерес целевым гликопротеином является тот, который не продуцируется клеткой естественным образом; наоборот, в клетку вносятся изменения для организации его производства. В некоторых вариантах выполнения изобретения целевым гликопротеином является тот, который продуцируется клеткой естественным образом; однако в клетку были внесены изменения для организации его производства на высоком уровне и/или согласно предопределенным условиям (например, в присутствии стимулирующего агента и т.д.).

Во многих вариантах выполнения изобретения целевой гликопротеин обладает лечебной активностью при вводе его животным (например, млекопитающим, таким как человекообразные). Для предоставления всего лишь нескольких примеров скажем, что эритропротеины, интерфероны, факторы свертывания крови, колониестимулирующие факторы, множество антител и определенные ферменты - все они являются гликопротеинами, которые в настоящее время производятся в таких линиях измененных клеток как биофармацевнические агенты. В некоторых вариантах выполнения изобретения из настоящего раскрытия его сущности видно, что гликаны на поверхности тех клеток, которые производят один или несколько из этих агентов, подвергаются химическому анализу так, как описано в данном изобретении, для оценки и контроля гликозилирования агента. Специалист обычной квалификации в предметной области должен иметь представление и о других коммерчески пригодных гликопротеинах, которые могут быть получены промышленным способом (например, в производственных биореакторах) в лечебных и прочих целях. Раскрытие сущности настоящего изобретения обеспечивает способы для контроля конфигурации гликозилирования таких коммерчески пригодных гликопротеинов.

Типичные коммерчески доступные продукты гликопротеина охватывают, например:

Протеиновый продукт	Эталонный лекарственный препарат
Интерферон гамма-1b	Actimmune®
Альтеплаза; возбудитель плазминогена ткани	Activase®/Cathflo®
Рекомбинантный антигемофильный витамин	Advate
Альбумин для лечения людей	Albutein®
Ларонидаза	Aldurazyme®
Интерферон альфа-N3, полученный на основе человеческий лейкоцитов	Alferon N®
Антигемофильный витамин для лечения людей