Способ характеризации рекомбинантного поликлонального белка

Способ характеризации рекомбинантного поликлонального белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу структурной характеризации популяции различных видов легких цепей в композиции рекомбинантных поликлональных антител. Способ полезен как для количественного, так и для качественного анализа и может использоваться, например, для анализа постоянства от партии к партии, а также для оценки композиционной стабильности во время процесса производства и для определения того, отвечает ли данная партия конкретной определенной заранее спецификации для выпуска продукта.

Уровень техники

WO 2006/007853 раскрывает процедуру характеризации образца, который включает рекомбинантное поликлональное антитело. Способ включает расщепление цепей антитела с высвобождением маркерного пептида, который уникален для каждого конкретного вида белка (так называемый метод 'маркерного пептида').

Необходимым условием для промышленного производства рекомбинантного поликлонального белка, предназначенного для профилактики и терапевтического использования, является сохранение разнообразия белков в процессе культивирования и последующей обработки. Таким образом, важно иметь возможность мониторинга и измерения клонального разнообразия поликлональной клеточной линии, продуцирующей поликлональный белок, а также относительной представленности индивидуальных белков в поликлональном белке в любой желаемый момент времени и в любом соответствующем образце, что позволяет анализировать стабильность экспрессирующей системы за один раунд, а также вариации конечного продукта от партии к партии.

Анализ постоянства от партии к партии в различных партиях лекарственного вещества, получаемого из индивидуальных поликлональных рабочих клеточных банков, необходим для гарантии того, что конкретная партия соответствует определенной заранее спецификации для выпуска продукта. При проведении такого анализа можно воспользоваться методом, который способен определять относительные содержания индивидуальных белков в поликлональной смеси белков.

Осуществление метода маркерного пептида, описанное в WO 2006/007853, обеспечивается методом LC-MS (жидкостная хроматография с масс-спектрометрией) для идентификации и характеризации уникальных гидрофобных пептидов, произошедших из вариабельного участка, генерированных с помощью ферментативного расщепления, что позволяет идентифицировать конкретные виды антител в рекомбинантном поликлональном антителе.

У Adamczyk et al. (Краткие Сообщения в Масс-спектрометрии 14, 49-51 (2000)) описан анализ поликлонального антитела путем очистки поликлонального антитела животного происхождения (т.е. нерекомбинантного) с восстановлением дисульфидных связей между легкой и тяжелой цепями, а также осуществление LC-MS одновременно для тяжелых и легких цепей с получением профиля поликлонального антитела сывороточного происхождения. У Wan et al. в публикации (J. of Chromatography A 913, 437-446 (2001)) описано использование LC-MS для рекомбинантного моноклонального антитела, продуцированного в CHO-клетках, для количественной оценки гликоформ антитела непосредственно из клеточной культуры. Образцы рекомбинантного антитела из клеточной культуры восстанавливают и вводят непосредственно в систему ВЭЖХ, которая присоединена к масс-спектрометру.

Дополнительные данные по уровню техники представлены в WO 2006/007853.

Сущность изобретения

В изобретении предлагается способ характеризации типа легкой цепи в композиции рекомбинантных поликлональных антител, включающий стадии:

a) производства и очистки композиции рекомбинантных поликлональных антител;

b) восстановления цистеиновых мостиков, соединяющих тяжелую и интактную легкую цепи;

с) отделения тяжелых цепей от интактных легких цепей;

d) по меньшей мере, одного хроматографического анализа интактных легких цепей, в котором белки разделяются согласно физико-химическим свойствам;

e) масс-спектрометрии разделенных интактных легких цепей со стадии (d); и

f) анализа данных, полученных на стадии (e), для характеризации вида интактной легкой цепи в композиции рекомбинантных поликлональных антител.

Для того чтобы уменьшить сложность метода и для улучшения данных, полученных с использованием изолированных интактных легких цепей, авторами настоящего изображения обнаружено, что необходимо отделять тяжелые цепи от легких цепей. Авторы настоящего изобретения предполагают, что это, скорее всего, связано с высокой степенью гетерогенности физико-химических свойств тяжелых цепей, которые препятствуют характеризации легких цепей. Кроме того, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что при использовании интактных легких цепей можно получить более точную количественную оценку состава легких цепей антител в рекомбинантном поликлональном антителе. Еще одно преимущество по сравнению с методом маркерного пептида заключается в том, что процедура упрощается посредством меньшего количества стадий, что делает ее более надежной и более удобной в использовании.

Белки с интактными легкими цепями, которые необходимо охарактеризовать, как правило, происходят из известных генетических последовательностей, т.е. последовательности, используемые для создания поликлонального антитела, являются известными. Таким образом, стадия (f), как правило, включает сравнение данных, полученных на стадии (е), с генетическими данными, такими как установленный молекулярный вес каждой интактной легкой цепи, как определяется для генетической последовательности (или с помощью других генетических анализов, описанных в данном документе), или стадия (f) включает сравнение данных, полученных на стадии (е), с данными, полученными при определении молекулярного веса изолированного вида легкой цепи. Молекулярный вес изолированного вида легкой цепи может быть получен путем экспрессии антитела в виде моноклонального антитела с разделением легкой и тяжелой цепей и с определением молекулярного веса легкой цепи с использованием масс-спектрометрии. При сравнении данных, полученных на стадии (е), с данными по определению молекулярного веса будут приниматься во внимание посттрансляционные модификации, оказывающие влияние на молекулярный вес.

Хотя настоящее изобретение относится исключительно к анализу легких цепей, конечный результат может включать определение количества и/или относительного содержания цельных антител в композиции, так как между легкой цепью и тяжелой цепью всегда существует соотношение 1:1. Это позволяет оценить фактическое количество (на основе веса) каждого вида антител, поскольку структура тяжелой цепи, ассоциированной с той или иной легкой цепью, заранее известна из ее кодирующей последовательности. Это также можно сделать путем измерения молекулярного веса каждой изолированной тяжелой цепи с помощью, например, масс-спектрометрии, чтобы принять во внимание посттрансляционные изменения (в частности, гликозилирование).

В изобретении также предлагается способ детектирования вариации между популяциями интактных легких цепей в двух или более композициях рекомбинантных поликлональных антител, включающий осуществление вышеописанного способа характеризации вида легкой цепи в композиции рекомбинантных поликлональных антилел, для каждой из двух или более композиций рекомбинантных поликлональных антител, и определение любой вариации между популяциями интактных легких цепей в двух или более композициях рекомбинантных поликлональных антител.

Краткое описание фигур

Фиг.1 - Типичная хроматограмма SEC (эксклюзионная хроматография) восстановленного и алкилированного Sym00l. HC=тяжелая цепь, LC=легкая цепь.

Фиг.2 - Типичные хроматограммы LC-MS легких цепей Sym00l. Вверху показана регистрация суммарного количества ионов (TIC) и внизу показана регистрация УФ при 214 нм.

Фиг.3 - Типичная УФ-хроматограмма легких цепей Sym00l с временем удерживания индивидуальных антител.

Фиг.4 - TIC легких цепей Sym00l (вверху) с хроматограммой экстрационной ионной хроматографии (XIC) для RhD159 (внизу).

Фиг.5 - XIC для RhD159 (вверху) с соответствующим м/з-диапазоном.

Фиг.6 - Расширение м/з-диапазона, показанное на Фиг.5 (вверху) с соответствующим XIC (внизу).

Фиг.7 - Различные вводимые количества Sym00l WS-I LC, линейность клонов (n=3).

Фиг.8 - Анализ двух различных партий Sym00l (n=3).

Описание изобретения

Определения

Термин "антиидиотипическое антитело" обозначает полноразмерное антитело или его фрагмент (например, Fv, scFv, Fab, Fab' или F(ab)₂), которые специфично связываются с изменчивой частью индивидуального компонента поликлонального белка. Предпочтительно, антиидиотипическое антитело по настоящему изобретению специфично связывается с изменчивой частью индивидуального компонента поликлонального антитела или поликлонального TcR. Специфичность антиидиотипического антитела предпочтительно направлена против антиген-специфичной части индивидуального компонента поликлонального антитела или поликлонального T-клеточного рецептора, так называемого V-участка. Оно может также демонстрировать специфичность по отношению к определенной субпопуляции индивидуальных компонентов, например к специфичному семейству генов VH, представленному в смеси.

Термин "антиидиотипический пептид" обозначает специфичный пептид-лиганд, который способен к специфичной ассоциации и, следовательно, идентификации индивидуального белкового компонента в смеси гомологичных белков. Предпочтительно, антиидиотипический пептид по настоящему изобретению специфично связывается с индивидуальным компонентом поликлонального антитела или поликлонального TcR. Антиидиотипические пептиды по настоящему изобретению предпочтительно направлены против антиген-специфичной части последовательности индивидуального антитела или индивидуального Т-клеточного рецептора. Однако антиидиотипический пептид также может демонстрировать специфичность к определенной субпопуляции индивидуальных компонентов.

Термин "клональное разнообразие" или "поликлональность" обозначает вариабельность или разнообразие поликлональных белков, кодирующих их последовательностей нуклеиновых кислот, или продуцирующей их поликлональной клеточной линии. Вариабельность характеризуется различиями в аминокислотных последовательностях индивидуальных компонентов поликлонального белка или различиями в последовательностях нуклеиновых кислот из библиотеки кодирующих последовательностей. Для поликлональных клеточных линий клональное разнообразие может оцениваться по вариабельности последовательностей нуклеиновых кислот, представленных в клеточной линии, например, как точечные интеграции в геноме индивидуальных клеток. Однако оно может также оцениваться как вариабельность аминокислотных последовательностей, представленных на поверхности клеток внутри клеточной линии.

Термин "эпитоп" обозначает часть антигенной молекулы, с которой будет связываться T-клеточный рецептор или антитело. Антиген или антигенная молекула будут, как правило, представлять несколько или даже большое количество эпитопов одновременно.

Термин "антитело" описывает функциональный компонент сыворотки и часто обозначается либо как совокупность молекул (антитела или иммуноглобулины, фрагменты и т.д.), либо как одна молекула (молекула антитела или молекула иммуноглобулина). Молекула антитела способна связываться или реагировать с конкретной антигенной детерминантой (антигена или антигенных эпитопов), которая, в свою очередь, может приводить к индукции эффекторных иммунологических механизмов. Молекула индивидуального антитела обычно рассматривается как моноспецифичная, и композиция молекул антител может быть моноклональной (т.е. состоящей из идентичных молекул антител) или поликлональной (т.е. состоящей из различных молекул антител, реагирующих с одним и тем же или с различными эпитопами на одном и том же антигене или на отдельных, различных антигенах). Отдельные и различные молекулы антител, составляющие поликлональное антитело, могут быть обозначены термином "компоненты". Каждая молекула антитела обладает уникальной структурой, которая позволяет ему специфично связываться с его соответствующим антигеном, и все молекулы природных антител обладают такой же общей базовой структурой из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.

Термин "иммуноглобулин" часто используется в качестве общего обозначения для смеси антител в крови или сыворотке. Поэтому полученное из сыворотки поликлональное антитело часто обозначается термином иммуноглобулин или гамма-глобулин. Однако "иммуноглобулин" также может использоваться для обозначения смеси антител, полученных из других источников, как например рекомбинантный иммуноглобулин.

Термин "индивидуальный клон", используемый здесь, обозначает изогенную популяцию клеток, экспрессирующих конкретный белок, например моноклональное антитело. Такие индивидуальные клоны могут, например, быть получены путем трансфекции клетки-хозяина целевой нуклеиновой кислотой, и после селекции положительных трансфектантов один клон может быть размножен или ряд индивидуальных клонов может быть объединен и размножен. Поликлональные клеточные линии могут быть генерированы путем смешивания индивидуальных клонов, экспрессирующих различные индивидуальные компоненты поликлонального белка.

Термины "индивидуальный компонент" или "отдельный компонент" обозначают белковую молекулу белковой композиции, включающей различные, но гомологичные белковые молекулы, такие как поликлональный белок, где индивидуальная белковая молекула гомологична другим молекулам композиции, а также содержит один или более участков полипептидной последовательности, характеризующейся различиями в аминокислотной последовательности между индивидуальными компонентами поликлонального белка, также обозначаемых термином вариабельный участок. Например, в поликлональном антителе, состоящем из антител Ab1-Ab50, все белки с последовательностью Ab1 будут рассматриваться как индивидуальный компонент поликлонального антитела, и Ab1 может, например, отличаться от белков Ab2 в последовательности участка CDR3. Субпопуляция индивидуальных компонентов может, например, состоять из антител, принадлежащих к Ab1, Abl2 и Ab33.

Термин "поликлональное антитело" описывает композицию различных молекул антител, которая способна связываться или реагировать с различными конкретными антигенными детерминантами на одном и том же или на различных антигенах. Поликлональное антитело также может рассматриваться как "коктейль моноклональных антител". Вариабельность поликлонального антитела локализована в так называемых вариабельных участках индивидуальных антител, составляющих поликлональное антитело, конкретно, в участках, определяющих комплементарность, CDRl, CDR2 и CDR3. Поликлональные антитела, которые могут быть охарактеризованы с помощью способа по изобретению, могут иметь любое происхождение, например могут быть химерными, гуманизированными или полностью человеческими.

Термины "поликлональная продуцирующая клеточная линия", "поликлональная клеточная линия", "поликлональный главный клеточный банк pMCB)" и "поликлональный рабочий клеточный банк (pWBC)" используются взаимозаменяемо, и обозначают популяцию экспрессирующих белок клеток, которые трансфицированы библиотекой изменчивых последовательностей нуклеиновых кислот, представляющих интерес. Индивидуальные клетки, которые в совокупности входят в состав рекомбинантной поликлональной продуцирующей клеточной линии, могут нести только одну копию представляющей интерес отдельной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей один компонент представляющего интерес рекомбинантного поликлонального белка, причем каждая копия предпочтительно интегрирована в одно и тоже место генома каждой клетки. Альтернативно, каждая индивидуальная клетка может нести множество копий отдельной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей компонент рекомбинантного поликлонального белка. Клетки, которые могут входить в состав такой продуцирующей клеточной линии, могут, например, представлять собой бактерии, грибы, эукариотические клетки, такие как дрожжи, клетки насекомых или клетки млекопитающих, особенно иммортализованные клеточные линии млекопитающих, такие как клетки CHO, клетки COS, клетки BHK, клетки миеломы (например, клетки Sp2/0, NSO), NIH 3T3, YB2/0 и иммортализованные человеческие клетки, такие как клетки HeLa, клетки HEK 293 или PER.C6.

В настоящем документе термин "поликлональный белок" обозначает белковую композицию, включающую различные, но гомологичные белковые молекулы, предпочтительно выбранные из суперсемейства иммуноглобулинов. Еще более предпочтительны гомологичные белковые молекулы, которые представляют собой антитела или Т-клеточные рецепторы (TcR), конкретно антитела. Таким образом, каждая белковая молекула гомологична другой молекуле композиции, а также содержит, по меньшей мере, один участок вариабельной полипептидной последовательности, которая характеризуется различиями в аминокислотной последовательности между индивидуальными компонентами, также называемыми отдельными изменчивыми компонентами поликлонального белка. Известные примеры таких поликлональных белков включают антитела, Т-клеточные рецепторы и В-клеточные рецепторы. Поликлональный белок может состоять из определенного набора белковых молекул, которые определяются по общей черте, такой как общая активность связывания по отношению к целевой мишени, например в случае поликлонального антитела против целевого антигена-мишени. Рекомбинантный поликлональный белок, как правило, состоит из такого определенного набора молекул, где последовательность каждого компонента является известной. В отличие от иммуноглобулина, полученного из сыворотки, рекомбинантный поликлональный белок обычно не содержит значительной доли неспецифичных к мишени белков.

Термин "белок" обозначает любую цепь аминокислот независимо от длины и посттрансляционной модификации. Белки могут существовать в виде мономеров или мультимеров, включающих две или более собранных полипептидных цепей, фрагментов белков, полипептидов, олигопептидов или пептидов.

Термин "уникальные маркерные пептиды" описывает ряд пептидов с происхождением из вариабельного участка индивидуальных компонентов поликлонального белка. Пептиды предпочтительно генерируют обработкой протеаз или другими способами фрагментации белков, и пептиды, которые могут быть однозначно обозначены как единственный индивидуальный компонент поликлонального белка, обозначаются термином уникальные маркерные пептиды.

Термин "рекомбинантное поликлональное антитело" обозначает коллекцию антител, полученных с использованием рекомбинантной технологии. В контексте настоящего изобретения антитело считается рекомбинантным, если его кодирующая последовательность является известной, т.е., также, если оно экспрессируется гибридомой или иммортализованной В-клеткой. Будет понятно, однако, что настоящее изобретение конкретно относится к характеризации композиций рекомбинантных поликлональных антител, где антитела экспрессируются с использованием клеточных линий, которые обычно используются для коммерческого производства рекомбинантных антител, например, с использованием одной из человеческих клеточных линий или других клеточных линий млекопитающих, упомянутых выше. В контексте настоящего изобретения термин "рекомбинантный поликлональный белок" включает "рекомбинантное поликлональное антитело".

Рекомбинантное поликлональное антитело согласно изобретению предпочтительно включает популяцию, по меньшей мере, из двух различных антител, где, по меньшей мере, легкие цепи отличаются.

Все иммуноглобулины, независимо от их специфичности, имеют общую структуру, содержащую четыре полипептидные цепи: две идентичные тяжелые цепи, каждая из которых потенциально несет ковалентно присоединенные олигосахаридные группы в зависимости от условий экспрессии; а также две идентичные не гликозилированные легкие цепи. Дисульфидная связь соединяет вместе тяжелую цепь и легкую цепь. Тяжелые цепи также соединены друг с другом с помощью дисульфидных связей. Все четыре полипептидные цепи содержат константные и вариабельные участки, расположенные в карбокси-концевой области и амино-концевой области, соответственно.

Иммуноглобулины делятся на пять основных классов в зависимости от компонентов их тяжелой цепи: IgG, IgA, IgM, IgD и IgE. Существует два типа легких цепей, K (каппа) и λ (лямбда). Индивидуальные молекулы могут содержать каппа или лямбда цепи, но никогда обе одновременно. IgG и IgA дополнительно делятся на подклассы, которые получаются в результате незначительных различий в аминокислотной последовательности в пределах каждого класса. У людей обнаружено четыре подкласса IgG, IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. У мышей также обнаружено четыре подкласса IgG: IgGl, IgG2a, IgG2b и IgG3. У людей существует три подкласса IgA, IgAl, IgA2 и IgA3.

Термин "интактная легкая цепь" обозначает рекомбинантно полученный полипептид, который состоит из обоих участков полипептида легкой цепи, вариабельного и константного. Интактная легкая цепь представляет собой продукт экспрессии кодирующего легкую цепь плинуклеотида, принимая во внимание посттрансляционные модификации, которые могут происходить во время продуцирования внутри экспрессирующего хозяина, а также во время последующей очистки и/или обработки.

Подробное описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предложение платформы для структурной характеризации для получения информации относительно присутствия или отсутствия относительного содержания индивидуальных антител в образцах, включающих рекомбинантное поликлональное антитело. Платформа характеризации может использоваться для оценки различных аспектов в процессе продуцирования, или очистки рекомбинантного поликлонального антитела, или в процессе долгосрочного хранения композиции рекомбинатного поликлонального антитела.

Предпочтительно, платформа характеризации по настоящему изобретению используется для одной из следующих целей i) для определения относительной представленности индивидуальных компонентов или некоторых из индивидуальных компонентов по отношению друг к другу внутри одного образца, ii) для оценки относительного содержания одного или более из индивидуальных компонентов в различных образцах для определения постоянства от партии к партии и iii) для оценки фактического содержания одного или более из индивидуальных компонентов. Необязательно, это может осуществляться путем сравнения с транслированными последовательностями в экспрессирующих векторах, исходно использованных для генерирования поликлональной продуцирующей клеточной линии. Платформа характеризации может использоваться для мониторинга клонального разнообразия поликлональной клеточной линии и/или представленности индивидуальных антител в рекомбинантном поликлональном антителе, продуцированном клеточной линией. Платформа характеризации особенно подходит для характеризации композиционной стабильности во время индивидуальных раундов продуцирования и для мониторинга постоянства от партии к партии.

Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ характеризации одного или несколько образцов, каждый из которых включает одно или несколько из рекомбинатных поликлональных антител, где поликлональные антитела включают множество антител, которые отличаются по их вариабельным участкам, так что полученная информация касается относительного содержания или присутствия индивидуальных антител рекомбинантного поликлонального антитела, причем указанный способ включает отделение аликвот изолированных легких цепей из указанных образцов с помощью, по меньшей мере, одного хроматографического метода, и впоследствии изолированные легкие цепи подвергают масс-спектрометрии и, необязательно, проводят один или более из генетических анализов последовательностей, кодирующих белок. Легкие цепи могут представлять собой или лямбда-изотип, или каппа-изотип, или смесь обоих изотипов в случае человеческих антител, или могут представлять собой другие изотипы в случае антител с происхождением из любого источника, кроме человека.

Важная особенность настоящего изобретения заключается в том, что последовательности, кодирующие каждую родственную пару тяжелой и легкой цепей, входящих в состав компонентов поликлонального антитела, являются известными. Информация, полученная из аналитических способов по настоящему изобретению, относится исключительно к легким цепям. Путем определения количества различных легких цепей в поликлональном антителе количество цельных антител также может быть рассчитано, как рассчитанный молекулярный вес каждой тяжелой цепи известен из ее кодирующей последовательности или определен экспериментально с использованием, например, масс-спектрометрии.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения интактные легкие цепи включают полную аминокислотную последовательность легкой цепи, т.е. полипептида легкой цепи, полученного с помощью продуцирующей клеточной линии, включая посттрансляционный процессинг, который происходит во время экспрессии и секреции интактных легких цепей. В одном варианте осуществления изобретения интактные легкие цепи содержат N-концевой аминокислотный остаток, отличный от глутамина, поскольку можно предположить, что N-концевой остаток может быть подвергнут процессингу перед характеризацией. С-концевой остаток также может быть подвергнут процессингу.

В одном варианте осуществления изобретения хроматографический способ основан, по меньшей мере, на одном физико-химическом свойстве, отличном от размера.

В одном варианте осуществления изобретения индивидуальный хроматографический способ основан, по меньшей мере, на одном физико-химическом свойстве, выбранном из группы, состоящей из суммарного заряда, гидрофобности, изоэлектрической точки и аффинности.

В одном варианте осуществления изобретения индивидуальный хроматографический способ основан на суммарном заряде.

В одном варианте осуществления изобретения хроматографический способ осуществляют в виде многомерной хроматографии.

В одном варианте осуществления изобретения хроматографический способ представляет собой или включает жидкостную хроматографию высокого разрешения.

В одном варианте осуществления изобретения композиция поликлональных антител представляет собой фракцию клеточной культуры, такую, которая включает клетки указанной культуры. Фракция клеточной культуры обычно представляет собой образец клеточной культуры, включающий клетки, представляющие каждую из клеточных линий в клеточной культур, так чтобы образец был репрезентативным для большей части клеточной культуры.

В одном варианте осуществления изобретения стадия (а) включает получение композиции поликлональных антител из одного или несколько супернатантов клеточных культур.

В одном варианте осуществления изобретения характеризация видов антител в композиции рекомбинантных поликлональных антител включает определение присутствия или отсутствия видов легких цепей в композиции рекомбинантных поликлональных антител.

В одном варианте осуществления изобретения характеризация видов антител в композиции рекомбинантных поликлональных антител включает определение относительного содержания видов легких цепей в композиции рекомбинантных поликлональных антител.

В одном варианте осуществления изобретения определение относительного содержания видов интактных легких цепей в композиции рекомбинантных поликлональных антител включает анализ одного или нескольких из сигнальных белков, присутствующих в указанной композиции.

В одном варианте осуществления изобретения стадия (f) включает сравнение данных, полученных на стадии (е), с данными, полученными, по меньшей мере, одним дополнительным аналитическим методом, выбранным из группы, состоящей из дополнительного метода характеризации белка и генетического метода.

В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, один дополнительный аналитический метод представляет собой генетический анализ полинуклеотидов, кодирующих легкие цепи, или полинуклеотидов, полученных или выделенных из производящей клеточной линии.

В одном варианте осуществления изобретения генетический анализ выбран из RFLP, T-RFLP, анализа микрочипов, количественного анализа ПЦР и секвенирования нуклеиновых кислот.

В одном варианте осуществления изобретения метод дополнительной характеризации представляет собой метод белковой характеризации, выбранный из N-концевого секвенирования и характеризации комплексных смесей гомологичных белков со специфическими детекторными молекулами, такими как антиидиотипические антитела или антиидиотипические пептиды.

В одном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, один дополнительный анализ осуществляют до, во время или после стадий а)-е).

В изобретении также предлагается способ детектирования дисперсии между популяциями интактных легких цепей в двух или более композициях рекомбинантных поликлональных антител, включающий осуществление способа характеризации вида легкой цепи, как описано в настоящем документе, для каждой из двух или более композиций рекомбинантных поликлональных антител, и определение любой вариации между популяциями интактных легких цепей в двух или более композициях рекомбинантных поликлональных антител.

В одном варианте осуществления изобретения две или более композиции рекомбинантных поликлональных антител получают из одной поликлональной клеточной культуры в различные моменты времени во время культивирования.

В одном варианте осуществления изобретения две или более композиции рекомбинантных поликлональных антител получают из различных поликлональных клеточных культур в конкретный момент времени.

В одном варианте осуществления изобретения вариацию детектируют путем сравнения относительного содержания, по меньшей мере, трех, по меньшей мере, 5 или, по меньшей мере, 10 легких цепей, присутствующих в двух или более композициях рекомбинантных поликлональных антител.

В одном варианте осуществления изобретения вариацию детектируют путем сравнения относительного содержания, по меньшей мере, двух легких цепей, присутствующих в двух или более композициях рекомбинантных поликлональных антител. Как правило, сравнение осуществляют с интактными легкими цепями в количестве 50 или менее, присутствующими в двух или более композициях рекомбинантных поликлональных антител, например, с таким количеством интактных легких цепей, как 2-40, 2-30, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10 или 2-5. Рекомбинантные поликлональные антитела могут быть подвергнуты необязательной дополнительной характеризации, такой как генетический и/или белковый анализ. Генетические анализы обозначают методы, такие как вывод аминокислотной последовательности, и/или теоретически определенной массы из генетических последовательностей, кодирующих интактные легкие или тяжелые цепи, анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции (RFLP), концевой-RFLP (T-RFLP), анализ микрочипов, количественный анализ ПЦР, такой как ПЦР в режиме реального времени, и секвенирование нуклеиновых кислот. Методы белковой характеризации обозначают методы, как правило, используемые в области протеомики для характеризации неизвестных белков, например хроматографические анализы, которые разделяют белки сообразно физико-химическим свойствам.

Дополнительно к масс-спектрометрии может использоваться один или несколько из следующих методов белковой характеризации - или, при необходимости, на том же образце, или целесообразнее на параллельных образцах: анализ протеолитического расщепления гомологичных белков, "суммарное" N-концевое секвенирование, а также анализ с использованием специфических детекторных молекул гомологичных белков.

Генетические анализы клонального разнообразия поликлональной продуцирующей клеточной линии

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительно к способам характеризации по настоящему изобретению в экспрессирующей системе для продуцирования поликлонального белка осуществляют мониторинг поликлональности с помощью оценки количества клеток, кодирующих конкретный компонент поликлонального белка.

Дополнительно к способам белковой характеризации также может осуществляться один или несколько из генетических анализов, описанных здесь, включающих определение уровня мРНК, кодирующей индивидуальные компоненты поликлонального белка. С помощью генетического анализа может осуществляться мониторинг на уровне мРНК или на уровне генома, например, с помощью RFLP или T-RFLP анализа, анализа олигонуклеотидных микрочипов, количественного анализа ПЦР, такого как ПЦР в режиме реального времени, и секвенирования нуклеиновых кислот - вариабельных участков генных последовательностей, полученных из (или использованных для создания) продуцирующей клеточной линии. Альтернативно, такие же методы могут использоваться для дальнейшей качественной демонстрации (генетического) разнообразия поликлональной клеточной линии. Может проводиться мониторинг последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих поликлональный белок, на образцах, полученных из одной поликлональной клеточной культуры в различные моменты времени во время культивирования, осуществляя таким образом мониторинг относительного содержания индивидуальных кодирующих последовательностей в процессе раунда продуцирования для оценки их композиционной стабильности. Альтернативно, может осуществляться мониторинг последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих поликлональный белок, на образцах, полученных из различных поликлональных клеточных культур в конкретный момент времени, осуществляя таким образом мониторинг относительного содержания индивидуальных кодирующих последовательностей в различных партиях для оценки вариации от партии к партии. Предпочтительно, образец, используемый в генетических анализах, представляет собой фракцию, обогащенную клетками культуры, например, путем преципитации или центрифугирования. В одном варианте осуществления изобретения генетический анализ может осуществляться на продуцирующей клеточной линии(ях), которая продуцирует рекомбинантное поликлональное антитело, тогда как хроматографический анализ и масс-спектрометрический анализ осуществляют на образце поликлонального антитела, полученном из клеточной линии. Образец для генетического анализа, как правило, получают путем сбора фракции клеточной культуры в нужный момент времени с последующим удалением среды, например, с помощью центрифугирования. Образцы для сравнения постоянства от партии к партии предпочтительно получают из клеток, которые находятся на пределе in vitro возраста клеток для продуцирования.

В одном варианте осуществления изобретения генетический анализ может быть осуществлен ранее, такой как секвенирование генов, которые кодируют индивидуальные легкие цепи и которые используются для создания продуцирующей клеточной линии(й). Кроме того, предполагается, что такой генетический анализ может осуществляться одновременно или после стадий белковой характеризации, таких как хроматографический и масс-спектрометрический анализы.

Подробности осуществления указанного здесь метода генетического анализа понятны специалисту в данной области, и дополнительное руководство того, как осуществить RFLP/T-RFLP, анализ олигонуклеотидных микрочипов, количественный анализ ПЦР и секвенирование нуклеиновых кислот в контексте изобретения представлено в WO 2006/007853.

Разделение тяжелых и легких цепей

Одна особенность настоящего изобретения представляет собой разделение тяжелых и легких цепей в стадии, предшествующей масс-спектрометрии. Это разделение служит нескольким целям. Во-первых и прежде всего, оно уменьшает количество различных белковых