Мультивалентная вакцина из нативных везикул наружной мембраны менингококков, способы ее получения и применения

Мультивалентная вакцина из нативных везикул наружной мембраны менингококков, способы ее получения и применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США номер 61/057462, озаглавленной «МУЛЬТИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ИЗ НАТИВНЫХ ВЕЗИКУЛ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ МЕНИНГОКОККОВ» и поданной 30 мая 2008 г., полное описание и содержание вышеуказанной заявки, таким образом, полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Федеральная поддержка исследования или разработки

Правительство США имеет права на настоящее изобретение.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Neisseria meningitidis является основной причиной менингита и септицемии во всем мире. Менингококковый менингит представляет собой воспаление мягких оболочек мозга, оболочки, выстилающей головной мозг и спинной мозг. Как при менингококковой септицемии, так и при менингококковом менингите поражение вызвано неконтролируемым местным или системным воспалительным ответом хозяина. Заболевание, вызываемое менингококками группы B, в настоящее время является причиной по меньшей мере половины всех вызванных менингококками заболеваний во многих странах, включая Северную и Южную Америку и Европу. Возникновение нового вирулентного клона Neisseria meningitidis группы B, известного как ET5, в Норвегии в конце 70-х годов с тех пор стало ответственным за продолжительные эпидемии в Норвегии, на Кубе, в Бразилии и Чили. Эти эпидемии вызвали серьезную опасность для общественного здравоохранения и значительно усилили попытки разработки эффективной вакцины против группы B в нескольких странах с эпидемией. Отсутствие лицензированной в США вакцины против группы B наряду со слабым эффектом вакцин, состоящих из капсульных полисахаридов A и C, на детей младше 18 месяцев препятствует принятию решения о повсеместной вакцинации детей против менингококковых инфекций.

Neisseria meningitidis разделяют на 13 серогрупп, из которых 9 вызывают инвазивное заболевание (A, B, C (C1, C1-), X, Y, W-135, Z, и L). Пять серотипов являются мишенями для разработки вакцин из-за их способности вызывать эпидемии, включая серотипы A, B, C, Y и W135, являющиеся мишенью большого числа исследований для создания вакцин.

Вакцины против серогрупп A, C, Y и W135 Neisseria meningitidis, вызывающих почти все инвазивные менингококковые инфекции, являются доступными и общепринятыми для использования с отличными результатами. Разработка подходящей вакцины против штаммов Neisseria meningitidis группы B более значительно затруднена множеством причин. Например, капсульный полисахарид, определяющий серогруппу, неэффективен и потенциально небезопасен для использования в вакцине, поскольку обладает такой же структурой, как полисиаловая кислота, обнаруженная на определенных клетках человека, а именно клетках крови.

Кроме того, дополнительным фактором невозможности создания подходящей вакцины является антигенная изменчивость и/или непостоянная экспрессия у разных штаммов группы B субкапсульных антигенов, экспонированных на поверхности, таких как белки наружной мембраны и липоолигосахарид (эндотоксин). Не было идентифицировано ни одного антигена, который бы обладал всеми характеристиками, необходимыми для создания эффективной вакцины.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей нативные везикулы наружной мембраны менингококков (NOMV), полученные по меньшей мере из двух штаммов менингококков, генетически модифицированных для обеспечения широкого спектра защиты. Нативные везикулы наружной мембраны менингококков включают три различных набора антигенов на основе PorA, LOS и консервативных белков наружной мембраны; и генетически модифицированные штаммы модифицированы для обеспечения повышения безопасности путем инактивации генов lpxL1, synX и lgtA. Оба штамма менингококков могут экспрессировать LOS с различной коровой структурой LOS и иметь альфа-цепи, состоящие из глюкозы и галактозы. Каждый штамм может экспрессировать по меньшей мере два различных подтипа белков или подтипа эпитопов PorA, которые выбраны на основе подтипов PorA, преобладающих у изолятов группы B. Кроме того, вакцина может дополнительно содержать другой консервативный поверхностный белок, который, как известно, может индуцировать бактерицидные антитела, со сверхэкспрессией в каждом штамме и выбранный из группы, состоящей из вариантов 1 FHBP (GNA1870), вариантов 2 FHBP и вариантов 3 FHBP; NadA; App; NspA; TbpA и TbpB.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к комбинации NOMV из трех генетически модифицированных штаммов Neisseria meningitidis, обладающих антигенной изменчивостью. По меньшей мере один из штаммов выбран из (1) H44/76 HOPS-DL, который обладает следующими генетическими модификациями или характеристиками: гены synX, lpxL1 и lgtA инактивированы; инсерция второго гена porA (подтип P1.7-1,1) вместо opaD; повышена экспрессия NadA; и стабилизирована высокая экспрессия Opc и PorA; (2) 8570 HOPS-G_AL, обладающего следующими генетическими модификациями или характеристиками: гены synX, lpxL1 и lgtA инактивированы; инсерция второго гена porA вместо opaD; повышена экспрессия варианта 1 белка, связывающего фактор H; и стабилизирована высокая экспрессия PorA и Opc; и/или (3) B16B6 HPS-G₂A, обладающего следующими генетическими модификациями или характеристиками: гены synX, lpxL1 и lgtA инактивированы; инсерция второго гена porA вместо opaD; повышена экспрессия варианта 2 белка, связывающего фактор H; и стабилизирована высокая экспрессия PorA и Opc. NOMV получают без обработки детергентом или денатурирующими растворителями из клеточной массы или из истощенной культуральной среды. Вакцину можно комбинировать с одним или несколькими адъювантами и можно вводить внутримышечно и/или интраназально.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции вакцины против менингококковой инфекции, более предпочтительно инфекции, вызванной менингококками группы B, содержащей нативные везикулы наружной мембраны менингококков (NOMV) одного или нескольких генетически модифицированных штаммов Neisseria meningitidis. Один или несколько генетически модифицированных штаммов модифицированы посредством: инактивации гена synX, инактивации гена lpxL1, инактивации гена lgtA в каждом штамме, приводящей к экспрессии укороченных или усеченных липоолигосахаридов (LOS) с отсутствием тетрасахарида лакто-N-неотетраозы, и/или инсерции по меньшей мере одного второго гена porA, отличающегося по антигенным свойствам, вместо гена opa. В другом аспекте генетически модифицированный штамм дополнительно обладает повышенной или стабильной экспрессией по меньшей мере одного минорного консервативного белка наружной мембраны, и/или стабилизированной экспрессией по меньшей мере одного белка наружной мембраны. По меньшей мере один второй ген porA, отличающийся по антигенным свойствам, может экспрессировать по меньшей мере один подтип белка или подтип эпитопа PorA, выбранный из наиболее распространенных подтипов PorA изолятов meningitidis группы B.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к генетически модифицированному вакцинному штамму Neisseria meningitidis подтипа B. Генетически модифицированный вакцинный штамм может включать штамм H44/76 HOPS-D (B1), штамм 8570 HOS-G1 (B2) и/или штамм B16B6 HPS-G₂A (B3).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к генетически модифицированному вакцинному штамму Neisseria meningitidis подтипа B, полученному из: штамма H44/76, который имеет следующие генетические модификации: i) ген synX инактивирован, ii) ген lpxL1 инактивирован, iii) ген lgtA инактивирован, iv) инсерция второго гена porA вместо гена opaD, v) экспрессия NadA по сравнению с нативным штаммом повышена и vi) стабилизирована повышенная экспрессия белков Opc и PorA. В некоторых аспектах генетически модифицированный штамм получен из штамма дикого типа ET-5 H44/76 (B:15: P1.7,16: L,3,7:P5.5,C).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к генетически модифицированному вакцинному штамму из штамма Neisseria meningitidis подтипа B, полученному из 8570, который обладает следующими генетическими модификациями из: i) ген synX инактивирован, ii) ген lpxL1 инактивирован, iii) ген lgtA инактивирован, iv) инсерция второго гена porA вместо opaD; v) повышена экспрессия варианта 1 белка, связывающего фактор H; и vi) стабилизирована повышенная экспрессия белков PorA и Opc. В некоторых аспектах генетически модифицированный штамм получен из штамма дикого типа ET-5 85 70(B:4: P 1.19,15: L3,7v: P5.5,11,C).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к генетически модифицированному вакцинному штамму Neisseria meningitidis подтипа B, полученному из B16B6, который имеет следующие генетические модификации: i) ген synX инактивирован, ii) ген lpxL1 инактивирован, iii) ген lgtA инактивирован, iv) инсерция второго гена porA (подтип P1.22-1,4) вместо opaD; v) повышена экспрессия варианта 2 белка, связывающего фактор H; и vi) стабилизирована повышенная экспрессия белков PorA и Opc. В некоторых аспектах генетически модифицированный штамм получен из штамма дикого типа ET-37 B16B6 (B:2a:P 1.5,2: L2:P5.1,2,5).

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к генетически модифицированному штамму, выращенному на среде с дефицитом железа.

В других аспектах настоящее изобретение относится к генетически модифицированному штамму, где инактивацию гена synX, гена lpxL1 или гена lgtA осуществляют посредством введения гена устойчивости к лекарственному средству в последовательность инактивированного гена.

В другом аспекте изобретение относится к вакцине, содержащей NOMV, полученные из генетически модифицированных штаммов по настоящему изобретению. NOMV получают из клеточной массы или из использованной культуральной среды без обработки детергентом или денатурирующим растворителем. Вакцина может также содержать один или несколько адъювантов. В других аспектах генетически измененный штамм модифицирован так, что экспрессирует белки накопления железа.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине против менингококковой инфекции, содержащей множество нативных везикул наружной мембраны менингококков (NOMV), где по меньшей мере некоторые из NOMV по существу не экспрессируют или не сиалируют липоолигосахарид (LOS), содержат LOS, который включает липид A с пента-ацильной структурой, и имеют повышенный уровень экспрессии по меньшей мере одного минорного консервативного белка наружной мембраны, где минорный консервативный белок наружной мембраны выбран из белков, индуцирующих бактерицидные антитела. Минорный консервативный белок наружной мембраны может быть выбран из группы, состоящей из Nad A, варианта 1 белка, связывающего фактор H (FHBP) и варианта 2 FHBP. В других аспектах по меньшей мере некоторые из NOMV содержат укороченный или усеченный LOS, по существу не имеющий тетрасахарид лакто-N-неотетраозу (LNnT) и/или по меньшей мере некоторые из NOMV содержат два или более различных белков PorA.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа в ответ на менингококковую инфекцию у животного или человека, включающему введение композиции, содержащей NOMV по меньшей мере из одного генетически измененного штамма N. Meningitidis, животному или человеку для иммунизации против менингококковой инфекции. Вакцину используют для иммунизации против инфекции, вызываемой менингококками группы B.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения генетически модифицированного штамма N. Meningitidis, который можно использовать в вакцине против менингококковой инфекции, включающему стадии: a) выбора штамма менингококка типа B, способного к генетической модификации; b) генетической модификации штамма путем инактивации гена synX, c) генетической модификации штамма путем инактивации гена lpxL1, d) генетической модификации штамма путем инактивации гена lgtA и e) генетической модификации штамма путем повышения экспрессии одного или нескольких консервативных белков наружной мембраны. В других аспектах изобретения способ дополнительно включает генетическую модификацию штамма путем инсерции по меньшей мере одного второго гена porA, отличающегося по антигенным свойствам, в открытую рамку считывания гена opa. В других аспектах изобретения способ дополнительно включает стадию генетической модификации штамма для получения стабильной экспрессии или сверхэкспрессии по меньшей мере одного белка наружной мембраны посредством замены поли-C последовательности внутри промотора или открытой рамки считывания по меньшей мере одного белка наружной мембраны последовательностью, содержащей нуклеотиды G и C.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения вакцины против менингококковой инфекции, включающему стадии: a) культивирования генетически модифицированного штамма Ν. meningitidis, обладающего одной или несколькими модификациями, выбранными из группы, состоящей из ген synX инактивирован, ген lpxL1 инактивирован, ген lgtA инактивирован, введен по меньшей мере один второй ген porA с антигенными отличиями вместо гена opa, экспрессия по меньшей мере одного минорного консервативного белка наружной мембраны, повышена или стабильна, и/или стабильна экспрессия по меньшей мере одного белка наружной мембраны; b) увеличения размеров культуры посредством ферментации, используя культивированный штамм подпункта a), для инокуляции среды в ферментере; c) инактивации ферментированной культуры; d) сбора культивированных клеток N. meningitidis путем центрифугирования с непрерывным потоком и сбора клеточной массы; e) выделения ΝOMV из клеточной массы и f) ресуспендирования ΝOMV в буфере или носителе, подходящем для введения вакцины.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 представляет собой схему технологического процесса, обозначающую получение основного банка клеток из клеток для генетически модифицированных штаммов Neisseria для получения вакцины.

Фигура 2 представляет собой схему технологического процесса, обозначающую получение препарата банка клеток, применяемого для продукции генетически модифицированных штаммов Neisseria для получения вакцины.

Фигура 3 представляет собой схему технологического процесса, обозначающую ферментацию Neisseria, используемую для получения генетически модифицированных штаммов Neisseria для получения вакцины.

Фигура 4 представляет собой схему технологического процесса, обозначающую очистку NOMV из генетически модифицированных штаммов Neisseria для получения вакцины.

Фигура 5 представляет собой продолжение схемы технологического процесса фигуры 4.

Фигура 6 представляет собой изображение геля, окрашенного Кумасси синим, показывающего белковое содержание стандартного маркера (дорожка 1), контрольного препарата NOMV 8570 HOPS-G (дорожка 2), фильтрованной неочищенной вакцины (дорожка 3) и конечного продукта вакцины (дорожка 4).

Фигура 7 представляет собой гель, окрашенный серебром, показывающий содержание липоолигосахарида в вакцине. Дорожка 1 представляет собой контрольный ML5 LPS, дорожка 2 представляет собой фильтрованную неочищенную вакцину, и дорожка 3 представляет собой конечный продукт вакцины. Пятнадцать мкл разведения 1:2 100 мкг/мл вакцины разделяли в геле (20 мкл из 100 мкл/мл 1:2 разведения контроля).

Фигура 8 представляет собой изображение окрашенного антителом Вестерн-блота, показывающего идентичность и состав белков, обнаруженных в вакцине 8570 HOPS-G NOMV.

Фигура 9 представляет собой график, изображающий TNF-α, высвобождаемый из крови человека после инкубации с различными концентрациями вакцины.

Фигура 10 представляет собой график, на котором показано высвобождение IL-6 из крови человека после инкубирования с различными концентрациями генетически модифицированной вакцины NOMV.

Фигура 11 представляет собой график, на котором показан TNF-α, высвобождаемый из крови человека после инкубации с различными концентрациями генетически модифицированной вакцины по сравнению с DOC-экстрагированными OMV из штамма 44/76.

Фигура 12 представляет собой столбчатую диаграмму, на которой показаны бактерицидные титры у мышей, вакцинированных различными концентрациями вакцины 8570 HOPS-G с адъювантом или без.

Фигура 13 представляет собой столбчатую диаграмму, на которой показаны бактерицидные титры у мышей, вакцинированных вакциной 8570 HOPS-G, против различных тестируемых штаммов.

Фигура 14 представляет собой график, на котором показаны результаты анализа истощения бактерицидных антител для антигенов LOS, GNA1870, NOMV и Opc.

На фигуре 15 показан ответ антител у кроликов, вакцинированных вакциной 8570 HOPS-G NOMV с адъювантом и без.

Фигура 16 представляет собой график, на котором показаны результаты анализа бактерицидного истощения для тестируемых штаммов против вакцины 8570 HOPS-G1 NOMV.

Фигура 17 представляет собой график, на котором показаны результаты анализа бактерицидного истощения для антигенов LOS и FHBP для штамма 8570 HOPS-G1 с нокаутом PorA.

На фигуре 18 представлен фенотип трех генетически модифицированных штаммов Neisseria (A=B1, B=B2 и C=B3) по настоящему изобретению.

На фигуре 19 представлены плазмиды, используемые для конструирования генетически модифицированных штаммов Neisseria: a) плазмида, сконструированная для нокаута lgtA, b) плазмида для экспрессии второго PorA, c) плазмида для сверхэкспрессии fHbp под контролем ортологичного (Ptac в случае E. coli) промотора и d) плазмида для сверхэкспрессии NadA под контролем гомологичного промотора (промотор PorA N. meningitidis) и e) характерная схема трансформации N. meningitidis плазмидой для сверхэкспрессии fHbp (вариант 1 и 2) и ΝadA посредством замены гена NspA гомологичной рекомбинацией.

Фигура 20a представляет собой изображение стабилизации иммунотипа с усеченным LOS вакцинного штамма ΝOMV посредством нокаута гена lgtA трех генетически модифицированных штаммов. На фигуре 20b представлен иммуноблоттинг экспрессии альфа-цепи LOS генетически измененным штаммом B2 и родительским штаммом (B16B6) с моноклональными антителами против L3.7,9 (слева) и L8 (справа).

На фигуре 21 графически показана экспрессия варианта 2 fHbp в генетически модифицированном штамме B3. На фигуре 21a показан выбор штамма, содержащего устойчивый к гентамицину рекомбинант, содержащий сверхэкспрессированный fHbp, посредством иммуноблоттинга, и фигура 21b представляет собой Вестерн-блоттинг с использованием моноклонального антитела против fHbp JAR4, показывающий повышенную экспрессию fHBp.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композиции вакцины с широким спектром защиты, используемой для иммунизации против инфекции, вызываемой менингококками, более предпочтительно подгруппой Neisseria meningitidis типа B. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции вакцины, содержащий нативные везикулы наружной мембраны менингококков (NOMV) по меньшей мере одного, предпочтительно по меньшей мере двух, более предпочтительно по меньшей мере трех генетически модифицированных штаммов Neisseria meningitidis. Нативные везикулы наружной мембраны менингококков, называемые также пузырьками, представляют собой везикулы, сформированные или полученные из фрагментов наружной мембраны грамотрицательной бактерии, которые естественным образом отделяются во время роста и которые можно получить из культуральной среды или из клеток неагрессивными способами, в которых не применяются детергенты или денатурирующие растворители. Эти NOMV, как правило, содержат белки наружной мембраны (OMP), липиды, фосфолипиды, периплазматический материал и липополисахарид (LPS), в том числе липоолигосахариды. Грамотрицательные бактерии, особенно патогены, подобные N. meningitidis, часто передают ΝOMV при вирулентном инфицировании процессом, известным как пузырение. В соответствии с настоящим изобретением ΝOMV представляют собой везикулы, полученные из наружной мембраны бактерий без использования способов химической денатурации и полученные из генетически модифицированных штаммов, которые обладают антигенным разнообразием и каждый из которых генетически модифицирован с целью повышения безопасности, антигенной стабильности и расширения защитного иммунного ответа.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции вакцины, содержащей нативные везикулы наружной мембраны менингококков (NOMV), полученные по меньшей мере из двух или более генетически модифицированных штаммов N. meningitidis, предпочтительно по меньшей мере из трех различных генетически модифицированных штаммов.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к штаммам N. meningitidis с антигенным разнообразием, предпочтительно подтипа B, содержащим по меньшей мере три генетических модификации в бактериальном геноме, более предпочтительно по меньшей мере пять генетических модификаций, более целесообразно по меньшей мере шесть генетических модификаций. Генетические модификации могут включать одну или несколько из следующих модификаций: 1) инактивацию гена synX, необходимого для биосинтеза сиаловой кислоты, что приводит к потере способности экспрессировать или сиалировать липоолигосахарид (LOS) в капсуле; 2) инактивацию гена lpxL1, что приводит к значительно меньшей токсичности LOS, имеющего липид A с пента-ацильной структурой; 3) инсерцию второго гена porA, отличающегося по антигенным свойствам, вместо генов opa (OpaC или OpaD); 4) повышение экспрессии по меньшей мере одного минорного консервативного белка наружной мембраны, где минорный консервативный белок наружной мембраны обладает способностью индуцировать бактерицидные антитела (в качестве неограничивающих примеров, ΝadA, вариант 1 белка, связывающего фактор H (FHBP), и вариант 2 (FHBP); 5) инактивацию гена lgtA в каждом штамме, что приводит к экспрессии укороченного или усеченного LOS, у которого отсутствует тетрасахарид лакто-N-неотетраозы (LNnT); и/или 6) стабилизированной экспрессии конкретных белков наружной мембраны, таких как Opc и PorA, ответственных за фазовые варианты штаммов дикого типа.

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным штаммам, обеспечивающим как повышенную безопасность использования, так и увеличение широты защитного ответа антител на менингококковые инфекции. В одном из вариантов осуществления генетически модифицированные штаммы обеспечивают повышенную безопасность посредством включения по меньшей мере одной из следующих мутаций в бактериальный геном: делеции гена synX, что блокирует синтез сиаловой кислоты капсида и приводит к формированию отрицательного капсульного фенотипа NOMV, делеции гена lpxL1, уменьшающей активность эндотоксина, приводя к пента-ацильной структуре липида A, и/или делеции гена lgtA, блокирующей биосинтез лакто-N-неотетраозы на липоолигосахариде (LOS), что стабилизирует усеченную структуру LOS; более предпочтительно генетически модифицированные штаммы предоставляют две из этих мутаций, наиболее предпочтительно генетически модифицированные штаммы предоставляют все три эти мутации. В другом варианте осуществления настоящего изобретения генетически модифицированные штаммы обладают увеличенной широтой защитного ответа антител из-за нацеливания по меньшей мере на один из трех наборов возможных защитных антигенов, содержащихся в NOMV. Три возможных для нацеливания антигена включают по меньшей мере одно из следующего: белок PorA, по меньшей мере один консервативный минорный белок и/или коровая структура LOS, и включают любое их сочетание. В более предпочтительных вариантах осуществления генетически модифицированный штамм нацелен по меньшей мере на два из возможных защитных антигенов, наиболее предпочтительно нацелен на все три возможных защитных антигена.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутацию synX- (инактивация гена synX) вводили в генетически модифицированный штамм способом, как описано в патенте США 6558677, полное содержание которого приведено в настоящем документе в качестве ссылки. В кратком изложении, плазмиду на основе pUC19, содержащую ген synX, в котором последовательность 200 п.о. заменена на ген устойчивости к канамицину, использовали для трансформации генетически модифицированного штамма. Устойчивые к Kan трансформанты отбирали и тестировали посредством ПЦР по присутствию поврежденного гена synX и по отрицательному капсульному фенотипу. Этот synX-мутант сконструирован на основании результатов и информации о последовательности, опубликованной Swartley и Stephens (Swartley and Stephens (1994) J. Bacteriol. 176: 1530-1534), которые показали, что вставка транспозона в ген synX приводит к отрицательному капсульному фенотипу. Такую же или эквивалентную мутацию можно вводить в любой поддающийся трансформации штамм N. meningitidis. Подходящая плазмида для использования для трансформации менингококков была сконструирована с использованием следующего способа. Три последовательности ДНК соединяли с использованием слияния способом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с элонгацией перекрывающихся фрагментов (SOE) (Horton et al. (1989) Gene 77: 61-65). Три последовательности включали, в следующем порядке, начиная с 5'-конца, synXB, основания 67-681; ген устойчивости к канамицину из pUC4K (Pharmacia LKB Biotech Co.), 671-1623; и synxB, основания 886-1589. Кроме того, на 5'-конце добавляли предположительную последовательность для накопления, ACCGTCTGAA, посредством включения ее на конце праймера для ПЦР, применяемого для амплификации последовательности оснований 67-691 synXB. Полную конструкцию амплифицировали посредством ПЦР, очищали и лигировали по тупым концам в pUC19. pUC19 использовали для трансформации Escherichia coli DH5α и отбирали на LB с агаром с 50 мкг канамицина. Отбирали устойчивую к канамицину колонию, ДНК выделяли, очищали и расщепляли XbaI. Другую копию предположительной последовательности для накопления лигировали в полилинкер и полученную плазмиду опять использовали для трансформации E. coli DH5α, и проводили скрининг устойчивых к канамицину колоний посредством ПЦР по присутствию дополнительной последовательности для накопления. Плазмидную ДНК выделяли из отобранной колонии и использовали в качестве матрицы для ПЦР с использованием праймеров, амплифицирующих только часть вставки из плазмиды, исключая ген устойчивости к ампициллину, который не следует вводить в N. meningitidis. Затем амплифицированную ДНК очищали и использовали для трансформации генетически модифицированного штамма Ν. meningitidis. Мутант synX(-) Ν. meningitides отбирали по устойчивости к канамицину и подтверждали амплификацией ПЦР модифицированной области.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ген lpxL1 инактивировали в генетически модифицированных штаммах для получения LOS с уменьшенной эндотоксичностью, экспрессированного на ΝOMV в композициях вакцины. Липид A из LOS N. meningitidis обычно представляет собой гекса-ацильную структуру и является ответственным за эндотоксические свойства LOS. Две вторичные жирные кислоты, связанные ацил-окси-ацилом, присутствующие в липиде A, являются важными для эндотоксической активности. Генетически модифицированный штамм включает мутант lpxL1, как описано van der Ley и соавторами (van der Ley, P., Steeghs, L., Hamstra, HJ., van Hove, J., Zomer, B., and van Alphen, L. Modification of lipid A biosynthesis in Neisseria meningitidis lpxL mutants: influence on lipopolysaccharide structure, toxicity, and adjuvant activity. Infection and Immunity 69(10), 5981-5990, 2001). Делеция гена lpxL1 приводила к экспрессии нормальных уровней пента-ацильного LOS с сильно уменьшенной эндотоксичностью, как тестировали и посредством теста на пирогенность у кроликов, и посредством анализа высвобождения цитокинов с использованием моноцитов человека из цельной крови. Другие способы нарушения функции гена lpxL1 предусмотрены в нижеприведенных вариантах осуществления настоящего способа для разработки генетически модифицированных штаммов.

В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированный штамм содержит инсерцию второго гена porA, отличающегося по антигенным свойствам, вместо одного из генов opa (OpaC или OpaD). Мажорный белок наружной мембраны, порин A, или PorA, Neisseria meningitidis, является продуктом гена porA. PorA обладает широким антигенным разнообразием и является объектом фазовой изменчивости для уклонения от иммуноселективного давления; таким образом, он не всегда перекрестно взаимодействует с другими подтипами. Для повышения реактивности композиций вакцины в отношении различных подтипов PorA по меньшей мере один дополнительный ген porA встраивают в ген opaC или opaD генетически измененного штамма. Серотип PorA, отобранный для вставки, выбирают на основе наиболее преобладающих форм PorA, обнаруженных при инфекциях, вызываемых менингококками подтипа B. Подходящие серотипы PorA включают в качестве неограничивающих примеров: P1.7-1 (из штамма M1080); P1.22,14 (из штамма M4410); P1.22,1,4; или другие подходящие серотипы PorA, что понятно специалисту в данной области или как описано в современной литературе, например, как описано в Sacchi et al., Diversity and prevalence of PorA types in Neisseria meningitidis serogroup B in the United States, 1992-1998, J Infect Dis. 2000 Oct; 182(4): 1169-76. Вторые гены PorA могут находиться под контролем любого подходящего сильного промотора, обеспечивающего экспрессию белка PorA, например промотора PorA подходящих штаммов, например, штамма H44/76. Подходящие способы клонирования гена porA в генетически измененный штамм известны специалисту в данной области и могут включать в качестве неограничивающих примеров гомологичную рекомбинацию. Например, ген porA можно амплифицировать с помощью ПЦР с ДНК бактериальной хромосомы, клонировать в клонирующий вектор и затем клонировать в соответствующим образом сконструированную плазмиду, например pUC19, с использованием слияния генов посредством модификации способа ПЦР с элонгацией перекрывающихся фрагментов. Эту сконструированную плазмиду можно вводить в бактериальный геном посредством гомологичной рекомбинации, так чтобы заменить ген opa. Трансформанты можно отбирать блоттингом колоний с моноклональными антителами против порина. Эти способы известны специалисту в данной области.

В следующих вариантах осуществления настоящего способа модифицированные штаммы обладают стабильной и/или повышенной экспрессией по меньшей мере одного минорного белка наружной мембраны. Подходящие минорные белки наружной мембраны обладают способностью индуцировать бактерицидные антитела (например, в качестве неограничивающих примеров, NadA, вариант 1 белка, связывающего фактор H (FHBP), и вариант 2 (FHBP). Не ограничиваясь рамками какой-либо теории, стабилизация и/или повышенная экспрессия высоко консервативных экспонированных на поверхности минорных белков наружной мембраны, идентифицированных посредством геномного анализа, как обладающие потенциалом индуцировать защитные антитела, могут приводить к увеличению перекрестного защитного иммунного ответа. Подходящие консервативные минорные белки включают в качестве неограничивающих примеров, NadA, вариант 1 и 2 FHBP и Opc. Способы стабилизации и/или сверхэкспрессии минорного белка наружной мембраны (OMP) включают использование экспрессирующих плазмид и гомологичной рекомбинации или других подходящих способов, известных специалисту в данной области. Минорные OMP могут находиться под контролем сильного промотора, в качестве неограничивающих примеров, промотора PorA N. meningitidis или индуцируемого IPTG промотора ptac E. Coli.

Как описано в примерах ниже, сконструированные плазмиды использовали для установления повышенной экспрессии fHbp 1 и fHbp 2 в генетически модифицированных штаммах, где сверхэкспрессированный белок выглядит правильно процессированным, липидированным и транслоцированным к поверхности наружной мембраны. Например, экспрессия v.1 под контролем индуцируемого IPTG промотора Ptac E. coli в штамме 8570 HOPS-G (B2) была приблизительно в 4 раза выше, чем в родительском штамме 8570, а экспрессия v.2 в штамме B16B2 HPS-G₂A (B3) была в 32-64 раза выше, чем в родительском штамме B16B6 (см. фигуру 20). Альтернативно, систему экспрессии с использованием промотора PorA можно использовать для стабилизации/сверхэкспрессии минорных консервативных белков.

В следующих вариантах осуществления настоящего способа генетически модифицированные штаммы обладают инактивацией гена lgtA, что приводит к экспрессии укороченного или усеченного LOS с отсутствием тетрасахарида лакто-N-неотетраозы (LNnT).

Важной характеристикой LOS менингококков является фазовая изменчивость, которая происходит из-за мутаций с высокой частотой в гомополимерных отрезках нуклеотидных остатков в lgtA и других генах Neisseria. Эти мутации включают или выключают экспрессию трансферазы LgtA, которая опосредует сборку α-цепи LOS (изменяя конфигурацию заместителей гептозы два). Эта активация гена lgtA с фазовой изменчивостью может приводить к нежелательному удлинению α-цепи LOS, дающему в результате лакто-N-неотетраозу, обладающую структурным сходством с антигенами клеток крови человека. Генетически модифицированные штаммы по настоящему изобретению обладают геном lgtA, нокаутированным посредством нарушения нативного гена с помощью маркера устойчивости к антибиотику или другого подходящего маркера (для использования для скрининга по изменениям в гене), в качестве неограничивающего примера, гена устойчивости к зеомицину. Способы нокаута гена lgtA известны специалисту в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров конструирование плазмид и гомологичную рекомбинацию или трансформацию. Подвергнутый мутагенезу ген ΔlgtA являлся неактивным во всех модифицированных штаммах на протяжении по меньшей мере 22 наблюдаемых пассажей и присутствовала стабилизированная усеченная форма коровой структуры LOS. Делеция гена lgtA стабилизирует усеченную α-коровую структуру LOS, например, обеспечивая усеченные коровые структуры, как изображено на фигуре 19, где показаны три иллюстративных модифицированных штамма, например штамм B3 содержит альфа-цепь L8 с коровой структурой L3. Генетически модифицированные штаммы по настоящему изобретению содержат специфические коровые структуры LOS, соответствующие иммунотипам L3, L5 и L2, обеспечивая стабилизированные коровые структуры, на которые можно вызвать иммунный ответ, и в примерах ниже показаны усеченные L8-подобные LOS (L8-3, L8-5 и L8-2), которые способны уничтожать штаммы дикого типа, экспрессирующие полноразмерный LOS. Штаммы ΔlgtA способны стимулировать антитела, распознающие как усеченные, так и полноразмерные формы структуры LOS, без перекрестной реакции с олигосахаридами лакто-N-неотетраозы, обнаруженными на клетках крови человека.

В следующих вариантах осуществления настоящего изобретения генетически модифицированные штаммы N. meningitidis обладают стабилизированной экспрессией белков наружной мембраны, которые обычно являются чувствительными к фазовой изменчивости в штаммах дикого типа, например, в качестве неограничивающих примеров, Opc и PorA. Экспрессию этих белков можно стабилизировать способами, известными в данной области и включающими способ замены последовательности полимерных повторов либо в промоторах, либо внутри рамки считывания гена, подлежащего стабилизации, не повторяющейся последовательностью оптимальной длины, вызывая максимальную экспрессию. Например, часть последовательности поли-C или поли-G в промоторе этих генов можно заменять последовательностью такой же длины, содержащей как C, так и G нуклеотиды, например, последовательность поли-G 12 п.о. из промотора opcA (см. SEQ ID NO:1) заменяли новой последовательностью такой же длины, содержащей как C, так и G нуклеотиды, и участок Not I (см. SEQ ID NO:2, участок Not I подчеркнут). В других подходящих вариантах осуществления последовательность поли-G в промоторе PorA (например, см. SEQ ID NO:3) можно заменять новой последовательностью, содержащей как C, так и G нуклеотиды.

Дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к вакцинным штаммам, выращенным в жидкой среде, содержащей низкий уровень железа, чтобы индуцировать белковую экспрессию белков, вовлеченных в накопление железа, например, связывающий трансферрин белок A и B. В некоторых вариантах осуществления используемая среда не содержит специфической добавки хелаторов железа, таких как десферол. Одна подходящая среда является модифицированной из среды, опубликованной BW Catlin (Catlin BW. (1973) J. Infec. Dis. 128: 178-194), посредством замены нескольких индивидуальных аминокислот на 1% ка