Sparc, связывающийся с scfv

Sparc, связывающийся с scfv

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Притязание на приоритет

В настоящей заявке испрашивается преимущество предварительной заявки США № 61/120228, поданной 5 декабря 2008 г., и полное содержание этой заявки вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Секреторный кислый белок, богатый цистеином (SPARC), который также известен как остеонектин, представляет собой гликопротеин, состоящий из 303 аминокислот и экспрессирующийся в организме человека. Экспрессия SPARC является стадие-регулируемой, причем SPARC экспрессируется, главным образом, в тканях при их ремоделировании в процессе нормального развития или в ответ на их повреждение. См., например, Lane et al., FASEB J., 8, 163-173 (1994). Так, например, высокий уровень экспрессии белка SPARC наблюдается в костях и в зубах развивающегося организма и, главным образом, в остеобластах, одонтобластах, перихондриальных фибробластах и в дифференцирующихся хондроцитах мышиных, коровьих и человеческих эмбрионов. SPARC также играет важную роль во взаимодействиях клеток с матриксом в процессе ремоделирования ткани, заживления ран, морфогенеза, дифференцировки клеток, миграции и ангиогенеза, включая процессы, ассоциированные с патологическими состояниями. Так, например, SPARC экспрессируется при интерстициальном фиброзе почек и может играть определенную роль в вырабатывании ответа у хозяина на повреждение легких, такое как индуцированный блеомицином фиброз легких.

SPARC дифференциально экспрессируется в опухолях и в окружающей их строме при различных раковых заболеваниях, но не экспрессируется в нормальных тканях, причем характер его экспрессии зависит от типа ракового заболевания. Таким образом, пока не существует унифицированной модели, которая объясняла бы все аспекты функций этого белка и его вклада в развитие и прогрессирование рака. В качестве примера можно отметить, что в литературе сообщалось о повышенной экспрессии SPARC в раковой опухоли молочной железы (Bellahcene and Castronovo, 1995; Jones et al., 2004; Lien et al., 2007; Porter et al., 1995), в меланоме (Ledda et al., 1997a) и в глиобластомах (Rempel et al., 1998). Повышенные уровни экспрессии SPARC играют определенную роль в стимуляции развития опухоли или в прогрессировании указанных раковых заболеваний.

В соответствии с этим сверхэкспрессия SPARC при воспалительных заболеваниях и при некоторых раковых заболеваниях позволяет считать SPARC потенциальной мишенью, которая может быть использована в диагностике и в терапии.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям для доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, а именно для доставки терапевтически или диагностически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое или диагностическое средство, связанное с SPARC-связывающимся пептидом («SBP»), и фармацевтически приемлемый носитель («композиции согласно изобретению»), где указанный SBP содержит одну или несколько последовательностей SEQ ID NO:1-117.

Особенно предпочтительные варианты изобретения включают, например, композиции согласно изобретению, предназначенные для доставки терапевтического средства в пораженную область млекопитающего и включающие один или несколько SBP, где указанное терапевтическое средство представляет собой фрагмент антитела, содержащий функциональный Fc-домен антитела, включая, например, функциональный Fc-домен антитела, содержащий SEQ ID NO:118.

Другими предпочтительными вариантами изобретения являются композиции согласно изобретению, предназначеные для доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, где SBP, например, включает по меньшей мере 10 следующих друг за другом аминокислот, присутствующих в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112 и 117. Предпочтительно, SBP может состоять по меньшей мере из 10 смежных аминокислот, присутствующих в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112 и 117. Другие варианты изобретения включают композиции, например, содержащие два или более отдельных SBP, каждый из которых содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот, присутствующих в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112 и 117, а предпочтительно, в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-5. Другие варианты изобретения включают композиции, например, содержащие два или более отдельных SBP, каждый из которых состоит из одной или нескольких SEQ ID NO:1-117.

Настоящее изобретение также относится к композициям для доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, а именно для доставки терапевтически или диагностически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое или диагностическое средство, связанное с SBP, фармацевтически приемлемый носитель, а также фармацевтически приемлемый носитель, дополнительно включающий альбумин-связывающий пептид («ABP»), где ABP содержит SEQ ID NO:119 или SEQ ID NO:120, или обе последовательности SEQ ID NO:119 и 120. Такими композициями являются композиции, в которых SBP и ABP присутствуют в одном и том же полипептиде, и композиции, в которых SBP и ABP присутствуют в различных полипептидах.

Настоящее изобретение также относится к способам доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, где указанные способы включают доставку терапевтически или диагностически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое или диагностическое средство, связанное с SPARC-связывающимся пептидом, и фармацевтически приемлемый носитель («способы согласно изобретению»), где указанный SBP содержит SEQ ID NO:1-117. Предпочтительные варианты включают способы согласно изобретению, где указанные композиции включают, например, SBP, который содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот, происходящих от любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112 и 117, а более предпочтительно, в любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-5 и 117.

Другие предпочтительные варианты включают способы согласно изобретению, например, способы, в которых два или более отдельных SBP состоят из одной или нескольких SEQ ID NO:1-117. Настоящее изобретение также относится к способам согласно изобретению, где указанные два или более отдельных полипептида состоят по меньшей мере из одного SBP, и где указанные SBP содержат по меньшей мере 10 смежных аминокислот, происходящих от любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112.

Особенно предпочтительные способы согласно изобретению включают применение композиций, например, содержащих терапевтическое средство, которое представляет собой фрагмент антитела, содержащий функциональный Fc-домен антитела, где указанный фрагмент антитела содержит SEQ ID NO:118. Такими способами согласно изобретению являются, например, способы, где указанным терапевтическим средством является фрагмент антитела, который опосредует одну или несколько функций, таких как активация комплемента, клеточно-опосредуемая цитотоксичность, индуцирование апоптоза, индуцирование клеточной гибели и опсонизация.

Способы согласно изобретению, описанные в настоящей заявке, также включают применение пептидов, связывающихся с сывороточным альбумином ("ABP"), где указанные пептиды включают последовательности SEQ ID NO:119 или 120, или SEQ ID NO:119 и 120. Способами согласно изобретению также являются способы, где, например, SBP и ABP присутствуют в одном и том же полипептиде, и способы, где SBP и ABP присутствуют в различных полипептидах. Однако SBP может также состоять по меньшей мере из 10 смежных аминокислот, происходящих от любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-112.

Могут быть также применены композиции согласно изобретению и способы согласно изобретению, в которых пораженным участком является опухоль, а млекопитающим является человек.

Краткое описание некоторых аспектов графического материала

На фиг. 1 проиллюстрирована общая концепция присоединения связывающегося пептида к терапевтическому или диагностическому средству. В одном из примеров, проиллюстрированных в данном графическом материале, терапевтическим средством является Fc-домен антитела.

На фиг. 2 проиллюстрирована общая стратегия итеративного скрининга библиотеки фагового представления.

На фиг. 3 представлены последовательности, идентифицированные после скрининга пептидной библиотеки фагового представления на связывание с SPARC по числу выделенных последовательностей.

На фиг. 4 представлены последовательности, идентифицированные после скрининга пептидной библиотеки фагового представления на связывание с SPARC по авидности связывания с SPARC (на что указывает OD).

На фиг. 5 проиллюстрировано клонирование любого пептида из пептидов PD15 или PD21 в вектор pFUSE-hIgG1-Fc2 с получением гибридного белка PD15 или PD21-Fc.

На фиг. 6 представлена последовательность ДНК, полученная в результате клонирования последовательностей, кодирующих пептид 15 и пептид 21, в вектор pFUSE-hIgG1-Fc2, кодирующий гибридные белки «пептид-Fc».

На фиг. 7 представлены экспрессированные гибридные белки PD 15-Fc и PD 21-Fc, очищенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

На фиг. 8 проиллюстрирован массив Protoarray, используемый для определения нежелательного связывания PD15 и PD21.

На фиг. 9 представлен график, на котором проиллюстрированы ELISA-анализы на связывание путем сравнения авидности связывания SPARC с PD15 и PD21 с авидностью его связывания с анти-SPARC антителом.

На фиг. 10 представлены микрофотографии, полученные в результате иммуногистологических анализов срезов человеческой опухоли, которые продемонстрировали экспрессию опухолевого SPARC в присутствии анти-SPARC антитела (анти-SPARC антитела R&D). Антитело против герцептина, используемое в качестве негативного контроля (только Fc-фрагмент) и гибридный белок «пептид-Fc», связывающийся со стабилином (stab-Fc), не окрашивали опухоль.

На фиг. 11 проиллюстрировано гистологическое окрашивание SPARC-экспрессирующей опухоли, указывающее на связывание PD15 и PD21 со SPARC-экспрессирующими клетками опухоли.

На фиг. 12 показан потенциальный SPARC-связывающий сайт на эластине.

На фиг. 13 проиллюстрирована противоопухолевая активность PD15 и PD21 в моделированной системе «мышь с человеческим раком предстательной железы»/«голая» мышь.

На фиг. 14 проиллюстрирована противоопухолевая активность PD15 и PD21 в моделированной системе «мышь с человеческим раком молочной железы»/«голая» мышь.

На фиг. 15 представлены два полипептида scFv, ScFv 3-1 и ScFv 3-2, обладающие SPARC-связывающей активностью.

На фиг. 16 представлены два полипептида scFv, ScFv 2-1 и ScFv 2-2, обладающие SPARC-связывающей активностью.

На фиг. 17 представлена нуклеотидная последовательность scfv 2-1, 2-2, 3-1 и 3-2. CDR подчеркнуты.

На фиг. 18 проиллюстрировано выделение scfv2-1 из бактерий.

На фиг. 19 проиллюстрировано выделение scfv3-1 из бактерий.

На фиг. 20 проиллюстрировано связывание scfv2-1 с белком SPARC, иммобилизованным на чипе, как было оценено с помощью анализа Biacore. Указаны величины Kd для scfv 2-1, 3-1 и 3-2, связанных с белком SPARC, которые были получены методом Biacore (SPARC HTI, то есть с очищенным тромбоцитарным SPARC, полученным от HTI; и SPARC Abx, то есть с SPARC, выделенным из сконструированных клеток HEK293, поставляемых Abraxis).

Подробное описание настоящего изобретения

SBP и ABP представляют собой «домены пептидного лиганда». Термин «домен пептидного лиганда» означает аминокислотную последовательность, которая может существовать сама по себе и/или присутствовать в более крупной полипептидной последовательности, где указанная аминокислотная последовательность связывается с другой биомолекулой с определенной степенью специфичности. Так, например, в связывании этих биомолекул с сывороточным альбумином участвует главная система транспорта жирных кислот, билирубина, триптофана, кальция, стероидных гормонов и других физиологически важных соединений в кровотоке. Связывание этих биомолекул осуществляется в дискретных сайтах аминокислотных последовательностей альбумина, то есть в доменах пептидных лигандов в сывороточном альбумине.

Настоящее изобретение относится к композициям для доставки терапевтического или диагностического средства в пораженную область млекопитающего, а именно для доставки терапевтически или диагностически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое или диагностическое средство, связанное с SPARC-связывающим пептидом («SBP»), и фармацевтически приемлемый носитель («композиции согласно изобретению» и «способы согласно изобретению»). Настоящее изобретение включает композиции и способы, в которых SBP содержит пептид, имеющий любую одну или несколько последовательностей SEQ ID NO:1-117, а наиболее предпочтительно, любую одну или несколько последовательностей SEQ ID NO:1-5 или один или несколько гомологов любой одной из SEQ ID NO:1-117.

Термин «гомолог» означает полипептид, который, в основном, содержит такую же аминокислотную последовательность, как и исходная последовательность, и обладает релевантными свойствами, которые, по существу, аналогичны свойствам исходной последовательности. Одним из таких репрезентативных свойств является способность модулировать распределение активного агента в ткани, где указанный гомолог SEQ ID NO:1-117 может иметь уровень модуляции, в основном, аналогичный уровню модуляции SEQ ID NO:1-117. В этом контексте, желательно, например, чтобы гомолог SEQ ID NO:1-117, в основном, обладал такой же способностью к модуляции, при которой уровень активного агента в крови был по меньшей мере примерно на 80%, предпочтительно, по меньшей мере примерно на 85%, более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно на 95% аналогичен уровню, достигаемому с использованием SEQ ID NO:1-117. Альтернативно, термин «гомолог» также означает, например, пептидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 6 смежных аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере из 7 смежных аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере из 8 смежных аминокислот, еще более предпочтительно, по меньшей мере из 9 смежных аминокислот, еще более предпочтительно, по меньшей мере из 10 смежных аминокислот любой одной из SEQ ID NO:1-112, а наиболее предпочтительно, из любой одной или нескольких SEQ ID NO:1-5.

Композиции и способы согласно изобретению также включают ABP, содержащие SEQ ID NO:119 или 120, либо SEQ ID NO:119 и 120 и их гомологи. Способы согласно изобретению также включают, например, способы, в которых SBP и ABP присутствуют в одном и том же полипептиде и в которых SBP и ABP присутствуют в различных полипептидах.

Что касается изменений в исходной последовательности, то было бы желательно, чтобы гомолог имел последовательность, которая по меньшей мере примерно на 80%, предпочтительно, по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 95%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно на 99% была идентична исходной последовательности.

Используемый здесь термин «процент идентичности последовательностей» означает величину, определяемую путем сравнения оптимально двух выровненных последовательностей по «окну» сравнения. Кроме того, часть полипептидной последовательности в «окне» сравнения может содержать добавления или делеции (то есть «пробелы») по сравнению со сравниваемой последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций), используемой для оптимального сопоставления двух последовательностей. Процент вычисляют путем определения числа положений, в которых идентичный аминокислотный остаток присутствует в обеих последовательностях, в результате чего получают ряд соответствующих положений, и число этих положений делят на общее число положений в «окне» сравнения, а затем, полученный результат умножают на 100 и получают процент идентичности данных последовательностей. Предпочтительно, оптимальное выравнивание осуществляют с использованием алгоритма выравнивания для достижения максимальной гомологии Нидлмана и Вюнша (1970) J. Mol. Biol. 48:443 453.

В том случае, если гомологи не содержат идентичных аминокислот, также может оказаться желательным, чтобы мутации давали только консервативные аминокислотные замены. В соответствии с этим в положениях остатков, которые не являются идентичными, осуществляют замену таких аминокислотых остатков на другие аминокислотые остатки с аналогичными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью), а поэтому функциональные свойства такой молекулы не изменяются. Если последовательности имеют консервативные замены, то процент идентичности последовательностей может быть уточнен путем коррекции на консервативную природу таких замен. Говорят, что последовательности, отличающиеся такими консервативными заменами, представляют собой «аналогичные» последовательности или «подобные» последовательности. Методы осуществления такой коррекции хорошо известны специалистам.

Для лучшего объяснения термина «консервативная аминокислотная замена или модификация», употребляемого в контексте настоящего изобретения, ниже перечислены группы аминокислот A-F. Замена одного члена нижеследующих групп другим членом той же самой группы рассматривается как «консервативная» замена.

Группа A включает лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, серин, цистеин, треонин и модифицированные аминокислоты, имеющие нижеследующие боковые цепи: этил, изобутил, -CH₂CH₂OH, -CH₂CH₂CH₂OH, -CH₂CHOHCH₃ и CH₂SCH₃.

Группа B включает глицин, аланин, валин, серин, цистеин, треонин и модифицированную аминокислоту, имеющую этильную боковую цепь.

Группа C включает фенилаланин, фенилглицин, тирозин, триптофан, циклогексилметил и модифицированные аминокислотные остатки, имеющие замещенные бензильные или фенильные боковые цепи.

Группа D включает глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, замещенный или незамещенный алифатический, ароматический или бензиловый эфир глутаминовой или аспарагиновой кислоты (например, метиловый, этиловый, н-пропиловый, изопропиловый, циклогексиловый, бензиловый или замещенный бензиловый эфир), глутамин, аспарагин, CO-NH-алкилированный глутамин или аспарагин (например, алкилированный метилом, этилом, н-пропилом и изопропилом) и модифицированные аминокислоты, имеющие боковую цепь -(CH₂)₃COOH, их сложный эфир (замещенный или незамещенный алифатический, ароматический или бензиловый сложный эфир), амид и замещенный или незамещенный N-алкилированный амид.

Группа Е включает гистидин, лизин, аргинин, N-нитроаргинин, п-циклоаргинин, g-гидроксиаргинин, N-амидиноцитрулин, 2-аминогуанидинобутановую кислоту, гомологи лизина, гомологи аргинина и орнитин.

Группа F включает серин, треонин, цистеин и модифицированные аминокислоты, имеющие прямые или разветвленные алкильные боковые C₁-C₅-цепи, замещенные -OH или -SH.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим молекулу-конъюгат, содержащую домен пептидного лиганда, конъюгированный с активным агентом, где указанный домен пептидного лиганда дополнительно содержит примерно 50 аминокислот, предпочтительно, дополнительно примерно 25 аминокислот, более предпочтительно, дополнительно примерно 15 аминокислот, а наиболее предпочтительно, дополнительно примерно 10 аминокислот, присоединенных к амино-концу, или карбокси-концу, или к обоим концам. Полученные полипептиды согласно изобретению включают полипептиды, общая длина которых составляет менее чем 50, менее чем 40, менее чем 30, менее чем 25 или менее чем 20 аминокислот.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим молекулу-конъюгат, содержащую SBP, конъюгированный с активным агентом, где в указанной композиции присутствуют один или множество SBP, содержащих любую одну из SEQ ID NO:1-117, а наиболее желательно, любую одну или более SEQ ID NO:1, 2 и 117.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность домена, связывающегося с пептидным лигандом, включая последовательности, в которых указанная дополнительная аминокислота присоединена у амино- и/или карбоксиконца.

II. Способы получения пептидов согласно изобретению

Полипептиды, содержащие домен пептидного лиганда и полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть синтезированы, детектированы, количественно оценены и очищены известными методами. Так, например, клетки, экспрессирующие экзогенные полипептиды, содержащие домен пептидного лиганда, могут быть получены путем помещения кДНК под контроль сильного промотора/сайта инициации трансляции и в трансфицированный или трансформированный вектор, встраиваемый в подходящие прокариотические или эукариотические клетки для инициации экспрессии полипептидов, содержащих домен пептидного лиганда, методами, хорошо известными среднему специалисту в данной области. Альтернативно, полипептиды, содержащие домен пептидного лиганда, могут быть химически синтезированы методами, хорошо известными среднему специалисту в данной области.

Полипептиды, содержащие домен пептидного лиганда, могут быть получены стандартным методом твердофазного синтеза. Как, в основном, известно специалистам, пептиды требуемой длины могут быть получены с применением коммерчески доступного оборудования и реагентов в соответствии с инструкциями производителей по блокированию интерферирующих групп, защите реакционноспособных аминокислот, связыванию, реакции снятия защиты и кэпированию непрореагировавших остатков. Подходящее оборудование может быть закуплено, например, у Applied BioSystems, Foster City, CA, или Biosearch Corporation in San Raphael, CA.

Так, например, пептиды синтезируют в соответствии со стандартными протоколами автоматизированного твердофазного синтеза, где используются трет-бутоксикарбонил-альфа-аминокислоты с соответствующей защитой боковой цепи. Полноразмерный пептид удаляют с твердофазного носителя путем одновременного снятия защиты боковой цепи стандартным методом с использованием фтористого водорода. Затем, неочищенные пептиды дополнительно очищают с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (Vydac C18) в градиенте ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте (TFA). После этого пептиды сушат в вакууме для удаления ацетонитрила и лиофилизуют из раствора 0,1% TFA в воде. Чистоту подтверждают с помощью аналитической ОФ-ВЭЖХ. Пептиды могут быть лиофилизованы, а затем солюбилизированы в воде или в 0,01M уксусной кислоте в концентрациях 1-2 мг/мл по массе.

Применение вышеупомянутых методов синтеза необходимо в том случае, если в пептидах присутствуют некодируемые аминокислоты или D-формы аминокислот. Однако в случае пептидов, кодируемых геном, такой синтез может быть также проведен рекомбинантными методами с использованием уже синтезированных последовательностей ДНК в коммерчески доступных системах экспрессии.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему элементы регуляции экспрессии полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий домен пептидного лиганда. Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, где указанными клетками являются прокариотические клетки или эукариотические клетки. Методы культивирования микробных и тканевых культур хорошо известны специалистам (см., например, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), pp. 16.1-16.54). Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения полипептидов, содержащих домен пептидного лиганда, где указанный способ включает: (a) трансформацию клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид по п.1 формулы изобретения; (b) индуцирование экспрессии полипептида трансформированными клетками; и (c) очистку полипептида.

Экспрессия белка зависит от уровня транскрипции РНК, которая, в свою очередь, регулируется ДНК-сигналами. Аналогичным образом, трансляция мРНК требует, на очень небольшом уровне, присутствия инициирующего кодона AUG, который обычно локализуется в области между нуклеотидами 10 и 100 у 5'-конца матричной РНК. Было показано, что последовательности, фланкирующие инициирующий кодон AUG, влияют на его распознавание. Так, например, для распознавания эукариотическими рибосомами, инициирующие кодоны AUG встраивают в последовательности так, чтобы они точно соответствовали «консенсусной последовательности Козака», что будет приводить к оптимальной трансляции (см., например, Kozak, J. Molec. Biol. 196:947-950 (1987)). Кроме того, для успешной экспрессии экзогенной нуклеиновой кислоты в клетках может потребоваться посттрансляционная модификация полученного белка.

Описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно, включают кодирующую область, функционально присоединенную к подходящему промотору, например к промотору, который является функциональным в эукариотических клетках. В настоящем изобретении могут быть использованы вирусные промоторы, такие как, но не ограничивающиеся ими, промотор RSV и основной поздний промотор аденовируса. Подходящими не-вирусными промоторами являются, но не ограничиваются ими, промотор фосфоглицерокиназы (PGK) и промотор фактора элонгации 1α. Не-вирусными промоторными, предпочтительно, являются человеческие промоторы. Дополнительные подходящие генетические элементы, многие из которых известны специалистам, могут быть также присоединены к нуклеиновой кислоте согласно изобретению и к ее конструкциям, либо они могут быть встроены в указанную нуклеиновую кислоту и ее конструкции в целях сообщения им дополнительных функций, повышения уровня экспрессии или улучшения характера экспрессии.

Кроме того, описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты могут быть функционально присоединены к энхансерам для облегчения транскрипции. Энхансерами являются цисдействующие элементы ДНК, стимулирующие транскрипцию смежных генов. Примерами энхансеров, которые обеспечивают высокий уровень транскрипции сцепленных генов в ряде клеток различных типов, происходящих от множества видов, являются, но не ограничиваются ими, энхансеры, происходящие от SV40 и RSV-LTR. Такие энхансеры могут быть объединены с другими энхансерами, обладающими клетко-специфическими эффектами, либо может быть использован любой отдельно взятый энхансер.

Для оптимизации продуцирования белка в эукариотических клетках молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению может также содержать сайт полиаденилирования, расположенный за кодирующей областью молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, предпочтительно, чтобы все соответствующие сигналы транскрипции (и сигналы трансляции, если они имеются) были расположены так, чтобы экзогенная нуклеиновая кислота соответствующим образом экспрессировалась в клетках, в которые ее вводят. Если это необходимо, экзогенная нуклеиновая кислота может также включать сайты сплайсинга (то есть акцепторые и донорные сайты сплайсинга) для облегчения продуцирования мРНК, то есть полноразмерного транскрипта, с сохранением рамки считывания. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут также включать соответствующие последовательности для процессинга, секреции, внутриклеточной локализации и т.п.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть встроены в любой подходящий вектор. Подходящими векторами являются, но не ограничиваются ими, вирусные векторы. Подходящими вирусными векторами являются, но не ограничиваются ими, ретровирусные векторы, векторы на основе альфа-вирусов, вируса коровьей оспы, аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса герпеса и вируса оспы домашней птицы. Такие векторы, предпочтительно, обладают природной или сообщенной им способностью трансформировать эукариотические клетки, например клетки CHO-K1. Кроме того, векторами, используемыми в настоящем изобретении, могут быть векторы на основе «оголенной» нуклеиновой кислоты (то есть векторы, имеющие небольшое количество инкапсулированных в них белков, сахаров и/или липидов, или векторы, не содержащие указанных соединений), такие как плазмиды или эписомы, либо указанные векторы могут образовывать комплекс с другими молекулами. Другими молекулами, которые могут быть соответствующим образом объединены с нуклеиновыми кислотами согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, вирусные оболочки, катионные липиды, липосомы, полиамины, золотые частицы и нацеливающие молекулы, такие как лиганды, рецепторы или антитела, нацеленные на клеточные молекулы.

Описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты могут быть перенесены в любые подходящие клетки, обычно в эукариотические клетки, такие как, например, клетки CHO, HEK293 или BHK, так, чтобы это приводило к экспрессии полипептида, содержащего домен пептидного лиганда, такого как, например, полипептид, содержащий последовательности SEQ ID NO:1-120, или их гомологи, описанные в настоящей заявке. Клетка может быть культивирована так, чтобы она экспрессировала молекулу нуклеиновой кислоты, а поэтому продуцировала полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, такой как, например, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1-120, или ее гомологи, описанные в настоящей заявке.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к клетке, трансформированной или трансфицированной описанной здесь молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Методы трансформации или трансфекции клеток молекулой экзогенной ДНК хорошо известны специалистам. Так, например, молекулу ДНК вводят в клетки стандартными методами трансформации или трансфекции, хорошо известными специалистам, такими как, но не ограничивающимися ими, трансфекция, опосредуемая фосфатом кальция или DEAE-декстраном, слияние протопластов, электропорация, метод с применением липосом и прямая микроинжекция (см., например, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), pp. 1.1-1.162, 15.1-15.53, 16.1-16.54).

Другим примером метода трансформации является метод слияния протопластов, в котором протопласты, происходящие от бактерий, несущих большое число копий представляющей интерес плазмиды, смешивают непосредственно с культивированными клетками млекопитающих. После слияния клеточных мембран (обычно посредством полиэтиленгликоля) содержимое бактерий доставляется в цитоплазму клетками млекопитающих, и плазмидная ДНК переносится в ядро.

Электропорация, то есть подача коротких электрических импульсов высокого напряжения на различные клетки млекопитающих и растений, приводит к образованию нанометровых пор в плазматической мембране. ДНК переносится непосредственно в цитоплазму клетки либо через эти поры, либо в результате перераспределения компонентов мембраны, которое сопровождается закрытием этих пор. Электропорация может быть исключительно эффективной и может быть использована для временной экспрессии генов клонов и для получения клеточных линий, несущих интегрированные копии представляющего интерес гена.

Такие методы могут быть применены для стабильной и временной трансформации эукариотических клеток. Для выделения стабильно трансформированных клеток требуется введение селективного маркера в сочетании с трансформацией представляющего интерес гена. Такими селективными маркерами являются гены, сообщающие резистентность к неомицину, а также ген HPRT в HPRT-негативных клетках. При отборе может потребоваться более длительное культивирование в селективной среде, а именно по меньшей мере в течение примерно 2-7 дней, а предпочтительно, по меньшей мере примерно 1-5 недель (см., например, Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), pp. 16.1-16.54).

Полипептид, содержащий домен пептидного лиганда, может быть экспрессирован в рекомбинантных клетках-хозяевах и выделен из этих клеток. Рекомбинантные клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, включая, но не ограничиваясь ими, бактерии, такие как E. coli, клетки грибов, такие как дрожжи, клетки насекомых, включая, но не ограничиваясь ими, клеточные линии, происходящие от дрозофилы и тутового шелкопряда, и клетки и клеточные линии млекопитающих. При экспрессии полипептида, содержащего домен пептидного лиганда, в клетках, например в человеческих клетках, независимо от того, используются ли они in vitro или in vivo, кодоны, отобранные для такого полинуклеотида, кодирующего пептид, могут быть оптимизированы для клеток данного типа (то есть вида). Специалистам известно множество методов оптимизации кодонов (см., например, Jayaraj et al., Nucleic Acids Res. 33(9):3011-6 (2005); Fuglsang et al., Protein Expr. Purif. 31(2):247-9 (2003); Wu et al., The Synthetic Gene Designer: a Flexible Web Platform to Explore Sequence Space of Synthetic Genes for Heterologous Expression, csbw, 2005 IEEE Computational Systems Bioinformatics Conference - Workshops (CSBW'05), pp. 258-259 (2005)).

Факторами, которые следует учитывать для достижения оптимальной экспрессии полипептида в прокариотах, являются конкретно используемые экспрессионные системы, выбор штамма-хозяина, стабильность мРНК, смещение кодонов, образование телец включения и предотвращение их образования; образование гибридного белка и его сайт-специфический протеолиз, а также компартмент-направленная секреция (см. публикацию Sorensen et al., Journal of Biotechnology 115 (2005) 113-128, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Обычно, экспрессия индуцируется с плазмиды, имеющейся в системе, совместимой с фоновым генотипом. Генетическими элементами экспрессионной плазмиды являются ориджин репликации (ori), маркер резистентности к антибиотикам, промоторы транскрипции, области инициации трансляции (TIR), а также терминаторы транскрипции и трансляции.

При этом может быть использована любая подходящая экспрессионная система, такая как, например, клетки Escherichia coli, которые благодаря их относительной простоте облегчают экспрессию белка; культуры высокой плотности; хорошо известные генетические элементы и большое число совместимых материалов, включая ряд доступных плазмид, рекомбинантные партнеры по слиянию и мутантные штаммы, подходящие для экспрессии полипептида. Особенно подходящими для рекомбинантной экспрессии являются штамм E. coli или фоновый генотип. Экспрессионные штаммы должны быть дефицитными по многим природным протеазам с нежелательным действием, а также должны поддерживать стабильную экспрессию плазмиды и содержать генетические элементы, соответствующие данной экспрессионной системе (например, DE3).

Число плазмидных копий регулируется ориджином репликации, который, предпочтительно, инициирует репликацию в нестрогих условиях (Baneyx, 1999). Репликон ColE1, присутствующий в современных экспрессионных плазмидах, происходит от семейства плазмид pBR322 (число копий 15-20) или pUC (число копий 500-700), а репликон p15A происходит от pACYC184 (число копий 10-12). Наиболее известные маркеры резистентности к лекарственным средствам, присутствующие в рекомбинантных экспрессионных плазмидах, сообщают резистентность к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину.

Экспрессионными системами E. coli являются экспрессионная система pET на основе T7 (поставляемая в продажу Novagen), промотор PL лямбда/репрессор cI (например, Invitrogen pLEX), промотор Trc (например, Amersham Biosciences pTrc), промотор Tac (например, Amersham Biosciences pGEX) и гибрид lac/T5 (например, Qiagen pQE), а также промотор BAD (например, pBAD Invitrogen).

Для инициации трансляции из области инициации трансляции (TIR) транскрибированной матричной РНК требуется присутствие сайта связывания с рибосомой (RBS), включая последовательность Шайна-Дальгарно (SD) и кодон инициации трансляции. Последовательность Шайна-Дальгарно представляет собой последовательность из 7±2 нуклеотидов, расположенных выше инициирующего кодона, который является каноническим AUG в эффективных рекомбинантных экспрессионных системах. Оптимальная инициация трансляции достигается из мРНК с использованием последовательности SD, такой как UAAGGAGG.

Частота встречаемости кодонов в E. coli зависит от уровня когнатных амино-ацилированных тРНК, присутствующих в цитоплазме. Большинство кодонов присутствует в генах, экспрессируемых на высоком уровне, а небольшое число кодонов или редко встречающиеся кодоны обычно встречаются в генах, экспрессируемых на низком уровне. Редко встречающиеся кодоны в E. coli часто в избытке присутствуют в гетерологичных генах, происходящих от таких источ