Специфические и высокоафинные связывающие белки, содержащие модифицированные sh3-домены киназы fyn

Специфические и высокоафинные связывающие белки, содержащие модифицированные sh3-домены киназы fyn

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему, по меньшей мере, одно производное домена 3 (SH3) Src-гомологии киназы FYN, где, по меньшей мере, одна аминокислота, находящаяся в Src-петле или расположенная на расстоянии до двух аминокислот рядом с Src-петлей, и/или, по меньшей мере, одна аминокислота, находящаяся в RT-петле или расположенная на расстоянии до двух аминокислот рядом с RT-петлей, заменена, делегирована или добавлена. Кроме того, данное изобретение относится к слитым белкам, содержащим связывающий белок согласно данному изобретению, соединенный с фармацевтически и/или диагностически активным компонентом. Кроме того, данное изобретение относится к нуклеотидам, кодирующим эти связывающие и/или слитые белки, а также соответствующим векторам или клеткам-хозяевам. Последнее, но не менее важное, это то, что данное изобретение относится к применению связывающих и/или слитых белков настоящего изобретения для получения лекарственного средства или диагностического средства, а также к фармацевтическим и/или диагностическим композициям, содержащим указанные связывающие и/или слитые белки.

Уровень техники

Специфические и высокоаффинные связывающие агенты являются незаменимыми инструментами в биологических и медицинских исследованиях, а также используются в медицинской диагностике, профилактике и лечении. В настоящее время моноклональные антитела являются доминирующим классом связывающих молекул, которые могут быть легко выделены с высокой аффинностью и специфичностью практически в отношении любой мишени. Однако иммуноглобулины имеют ограничения, обусловленные, главным образом, их общими биофизическими свойствами и их довольно сложной молекулярной структурой. Поэтому уже в 1990-х годах несколько исследовательских групп проводили исследование малых глобулярных белков в качестве замены антител. В основе таких соображений лежит идея переноса универсального сайта связывания со структуры антитела на альтернативные белковые несущие конструкции, так называемые каркасы. До сих пор описано более 40 каркасов, среди них два SH3-домена, SH3-домены киназ Abl и Src (см. Binz et al., Nature Biotechnology, Vol.23, No.10, 1257-1268, 2005).

SH3-домены обнаружены во многих различных белках, участвующих в трансдукции внутриклеточных сигналов и организации цитоскелета (Cohen et al., "Modular binding domains in signal transduction proteins." Cell 80(2): 237-48, 1995). Несмотря на вариабельность в их первичных структурах эти SH3-домены имеют очень сходную общую структуру и способ связывания с белками, обладая минимальной консенсусной последовательностью РххР, представляющей собой критическую детерминанту природного SH3-связывания. Важной функцией ЗН3-доменов является их участие в высокоселективных белок-белковых взаимодействиях. Erpel et al. ("Mutational analysis of the Src SH3 domain: the same residues of the ligand binding surface are important for intra - and intermolecular interactions." Embo J. 14(5): 963-75, 1995) исследовали влияние мутаций в RT- и n-Src-петлях SH3-доменов Src и показали, что мутации в обеих петлях, которые находятся рядом с гидрофобной поверхностью, могут оказывать влияние на способность этого домена участвовать в меж- и внутримолекулярных связях.

Hiipakka et al. ("SH3 domains with high affinity and engineered ligand specificities targeted to HIV-1 Net" J. Mol. Biol. 293(5): 1097-106, 1999) исследовали способность RT-петли в SH3-домене Hck действовать в качестве детерминанты разносторонней специфичности и аффинности. Авторы сконструировали фаговую библиотеку Hck-доменов, где 6 аминокислот RT-петли были рандомизированы (названные RRT-SH3). Используя эту стратегию, они идентифицировали индивидуальные RRT-SH3 домены, которые могут связываться с Nef HIV-1 максимально в 40 раз лучше, чем Hck-SH3. Авторы указывают на важность RT-петли в выборе лиганда SH3 в качестве общей стратегии создания SH3-доменов с желаемыми связывающими свойствами.

Lee et al. ("A single amino acid in the SH3 domain of Hck determines its high affinity and specificity in binding to HIV-1 Nef protein." Embo. J. 14(20): 5006-15, 1995) исследовали структурную основу различных аффинностей связывания SH3 и специфичностей Hck в отношении Nef белка HIV-1 и могли переносить связывающую способность SH3 Hck в отношении Nef на SH3-домен Fyn единственной мутацией в RT-петле SH3-домена Fyn (R96I).

Hosse et al. ("A new generation of protein display scaffolds for molecular recognition", Protein Science, 15:14-27, 2006) особо рассмотрели требования для связывающих белков, подходящих для терапевтических применений. Авторы отмечают важность некоторых свойств для терапевтически применимых связывающих белков, таких как сывороточная стабильность, проникновение в ткани, клиренс из крови, удерживание мишени и иммунный ответ. В последнем случае замечено, что терапевтические белки, выделенные не из людей, должны быть сделаны как можно более похожими на их человеческие аналоги и человеческий каркас может быть менее иммуногенным сразу же с самого начала. Эти авторы делают вывод:

"Однако, даже полностью человеческий каркас не является гарантией того, что белок не вызывает иммунную реакцию у человека, особенно если он является внутриклеточным белком. Рандомизация аминокислот во время конструирования библиотеки может потенциально вводить новые эпитопы Т-клеток. Даже единичные точковые мутации могут делать белок человека иммуногенным. Кроме того, большинство человеческих каркасов вызывают некоторый аутоиммунный ответ".

В настоящее время SH3-домены киназ AbI и Hck считают белковыми каркасами для генерирования белковых связывающих агентов с предсказуемой специфичностью, даже если до сих пор идентифицированы только связующие вещества в отношении известных лигандов, подобных белкам Nef или синтетическим пептидам (см. Binz et al. выше).

SH3-домен киназы Fyn (Fyn SH3) содержит 63 остатка (аа 83-145 последовательности, описанной Semba et al. ("yes-родственный протоонкоген, син., относится к семейству белков, относящихся к протеинтирозинкиназному семейству". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(15): 5459-63, 1986) и Kawakami et al. ("Isolation and oncogenic potential of a novel human src-like gene". Mol Cell Biol. 6(12): 4195-201, 1986). Fyn является членом Src-семейства тирозинкиназ с молекулярной массой 59 кДа. В результате альтернативного сплайсинга белок Fyn существует в виде двух различных изоформ, различающихся их киназными доменами; одна форма найдена в тимоцитах, спленоцитах и некоторых гематолимфоидных клеточных линиях, в то время как вторая форма накапливается в основном в головном мозгу (Cooke and Perlmutter, "Expression of a novel form of the Fyn proto-oncogene in hematopoietic cells". New Biol. 1(1): 66-74, 1989). Биологические функции Fyn разнообразны и включают в себя передачу сигнала через рецептор Т-клеток, регуляцию функции головного мозга, а также передачу сигнала, опосредованную адгезией (Resh, M.D. "Fyn, a Src family tyrosine kinase". Int. J. Biochem. Cell Biol. 30(11): 1159-62, 1998). Fyn является внутриклеточным белком. SEQ ID NO:1 показывает последовательность Fyn SH3 (аа 83-145 киназы Fyn, как сообщено Kawakami et al. и Semba et al. в 1986, см. выше) :

Последовательности RT-Src и n-Src петли подчеркнуты один раз и два раза, соответственно.

Аминокислотная последовательность Fyn SH3 полностью консервативна среди людей, мышей, крыс и обезьян (гиббона). Fyn SH3 цыпленка отличается в одном положении, последовательность Xenopus laevis в двух положениях аминокислот от соответствующего домена человека. Так же, как и другие SH3-домены, Fyn SH3 состоит из двух антипараллельных β-слоев и содержит две гибкие петли (называемые RT-Src и n-Src-петли) для взаимодействия с другими белками.

Таким образом, известный уровень техники считает белковые несущие конструкции, так называемые каркасы, альтернативой установленным структурам антител. Домен 3 (SH3) Src-гомологии является одним из этих, приблизительно 40 или более, каркасов. Среди многих различных SH3-доменов (приблизительно, 300 в геноме человека и нескольких тысячах, описанных до настоящего времени, в природе) Fyn SH3 является единственным, который был использован однажды ранее для выяснения специфичности связывания и аффинности SH3 в целом. Специалисту в данной области техники известно также, что внутриклеточные белки особенно склонны вызывать иммунные реакции и, следовательно, менее применимы для применений в прикладных областях in vivo, например в терапии и диагностике.

Целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенных мишень-специфических и высокоаффинных связывающих белков, применимых в качестве исследовательских и, в частности, диагностических и медицинских агентов. Кроме того, эти связывающие белки должны быть стабильными и растворимыми в физиологических условиях, вызывать мало иммунных эффектов или вовсе не вызывать иммунных эффектов в людях, получающих их, и обеспечивать связывающую структуру, которая также доступна для больших структур-мишеней, т.е. которая не экранирована стерическими препятствиями.

Раскрытие изобретения

Неожиданно было обнаружено, что SH3-домен киназы Fyn Src-семейства обладает превосходными свойствами для конструирования рекомбинантных связывающих доменов, обладающих специфичностью и высокой аффинностью в отношении выбранных мишеней. В частности, было показано, что специфичность в отношении мишеней может быть сконструирована мутацией RT-петли и/или src-петли, приводящей к более высокой вариабельности и улучшенным связывающим свойствам в отношении многих мишеней.

Более того, было неожиданно обнаружено, что не только нативный связывающий белок Fyn SH3, но также мутированные связывающие белки, полученные на основе Fyn SH3, также не были иммуногенными in vivo. Таким образом, рекомбинантные мутантные связывающие белки Fyn SH3 особенно применимы для создания неиммунногенных белковых терапевтических и/или диагностических средств.

В результате вышесказанного первый аспект настоящего изобретения относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему, по меньшей мере, одно производное домена 3 (SH3) Src-гомологии киназы Fyn, в котором

(a) по меньшей мере, одна аминокислота, находящаяся в Src-петле или расположенная на расстоянии вплоть до двух аминокислот рядом с Src-петлей, и/или

(b) по меньшей мере, одна аминокислота, находящаяся в RT-петле или расположенная на расстоянии вплоть до двух аминокислот рядом с RT-петлей, заменена, делегирована или добавлена, причем производное SH3-домена имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%-ную идентичность относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1,

предпочтительно при условии, что этот рекомбинантный связывающий белок не содержит аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2,

и, предпочтительно, этот рекомбинантный белок не является природным SH3-доменом, содержащим белок, существующим в природе.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO:2 (вариант Fyn SH3 R96I по Lee et al., см. выше) представлена ниже.

GVTLFVALYDYEAITEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO:2)

В контексте данного изобретения RT-петля киназы Fyn (иногда также обозначаемая RT-Src-петлей) состоит из аминокислот Е A R Т Е D, находящихся в положениях 12-17 в SEQ ID NO:1. Положения, подлежащие замене, делегированию или добавлению, т.е. подлежащие мутации, находящиеся внутри RT-петли или расположенные рядом с RT-петлей, представляют собой аминокислоты 10-19, предпочтительно 11-18, более предпочтительно 12-17.

В контексте данного изобретения Src-петля киназы FYN (иногда также обозначаемая как n-Src-петля) состоит из аминокислот N S S Е, находящихся в положениях 31-34 в SEQ ID NO:1. Положения, подлежащие замене, делегированию или добавлению, т.е. подлежащие мутации, находящиеся в Src-петле или рядом с Src-петлей, представляют собой аминокислоты 29-36, предпочтительно 30-35, более предпочтительно 31-34.

Рекомбинантный белок данного изобретения предпочтительно не является природным белком, содержащим SH3-домен, существующим в природных условиях или выделенным из них. Другими словами объем данного изобретения предпочтительно исключает белки, содержащие SH3-домен дикого типа. В природе имеется множество белков, содержащих SH3 домен. Такие природные SH3-белки обладают связывающей способностью в отношении их природных лигандов. Большинство, если не все из этих природных SH3-лигандов, имеют РххР мотив. Однако рекомбинантные белки данного изобретения являются генно-инженерными белками, сконструированными для проявления аффинности к неприродным мишеням, т.е. неприродным мишеням, являющимся любыми мишенями, например, находящимися в природе, предпочтительно в млекопитающих, более предпочтительно в человеке, за исключением природных (дикого типа) SH3-лигандов. Более предпочтительно, рекомбинантные белки данного изобретения по существу не имеют связывающей способности в отношении любых природных SH3-связывающих лигандов, наиболее предпочтительно не к какому-либо природному SH3-связывающему лиганду, имеющему РххР мотив.

Предпочтительно, число аминокислот, которое добавляют в одну и/или обе петли, равно 1-20, более предпочтительно 1-10 или 1-5 аминокислот и наиболее предпочтительно, когда аминокислоты не добавляют в эти петли.

В другом предпочтительном варианте осуществления части производного SH3-домена, которые лежат вне RT- и Src-петель, консервируют, насколько это возможно, чтобы не вводить иммуногенных мотивов.

Предпочтительно, чтобы рекомбинантные белки данного изобретения по существу не вызывали иммуногенной реакции в млекопитающих, предпочтительно в мышах, крысах и/или в человеке, наиболее предпочтительно в человеке. Конечно, иммуногенность полного рекомбинантного белка данного изобретения будет зависеть не только от этой части производного SH3-домена, но может зависеть от других частей полного белка.

В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения, по меньшей мере, часть производного SH3-домена рекомбинантного белка является по существу неиммуногенной в млекопитающих, предпочтительно, в мыши, крысе и/или в человеке, наиболее предпочтительно в человеке.

Например, квалифицированный в данной области техники специалист может определить иммуногенные реакции рекомбинантного белка или части производного его SH3-домена стандартными и рутинными способами, например введением (например, внутривенной (i/v) инъекцией) представляющего интерес рекомбинантного белка или производного его SH3-домена млекопитающему, например мыши и анализом ответа иммуногенных клеток крови и/или факторов (например, интерлейкинов) по истечении соответствующего времени, необходимого для появления иммунной реакции.

В более предпочтительном варианте осуществления связывающий белок согласно настоящему изобретению представляет собой такой белок, в котором указанное производное SH3-домена имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 85%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 98-100%-ную идентичность относительно аминокислотной последовательности домена 3 (SH3) Src-гомологии киназы FYN вне src- и RT-петель.

В предпочтительном варианте осуществления мутации вводят как в RT-, так и Src-петли.

В дополнительном более предпочтительном варианте осуществления связывающий белок настоящего изобретения содержит один или предпочтительно два измененных остатка в положениях 37 и/или 50 производного SH3-домена, предпочтительно два гидрофобных измененных остатка, более предпочтительно Trp37 и/или Tyr50, причем Trp37 и Tyr50 являются наиболее предпочтительными. Как показано на фиг.3b ниже, их рандомизация может увеличивать аффинность.

Термин "производное домена 3 Src-гомологии киназы FYN" в данном контексте означает аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%-ную идентичность относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. То же самое относится и к производному SH3-домена, имеющего, по меньшей мере, 70% или, по меньшей мере, 85%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 98%-ную идентичность относительно домена 3 (SH3) Src-гомологии киназы FYN вне src- и RT-петель, за исключением того, что аминокислоты, образующие указанные петли, исключаются при определении идентичности последовательности.

Для определения степени идентичности последовательности производного SH3-домена Fyn относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1 может быть, например, использована программа SIM Local Similarity (Xiaoquin Huang and Webb Miller, "A Time-Efficient, Linear-Space Local Similarity Algorithm". Advances in Applied Mathematics, vol.12: 337-357, 1991), без ограничений доступная от авторов и их института (см. также www: http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html); для анализа путем множественного выравнивания может быть использована программа Clustal W (Thompson et al., CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice". Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680, 1994). Предпочтительно степень идентичности последовательности производного относительно SEQ ID NO:1 определяют относительно полной последовательности SEQ ID NO:1.

В предпочтительном варианте осуществления связывающий белок настоящего изобретения содержит, по меньшей мере, два производных SH3 домена Fyn. Более предпочтительно, он представляет собой двухвалентный связывающий белок. По меньшей мере, два производных SH3-домена могут быть одинаковыми или различными. Предпочтительно, они являются одинаковыми.

Связывающий белок настоящего изобретения может быть сконструирован таким образом, что он имеет какую-либо аффинность связывания в отношении к конкретной мишени. В предпочтительном варианте осуществления этой мишенью является мишень на основе аминокислот, такая как пептид или белок, более предпочтительно белок, содержащий мотив РххР. Конечно, только меньшая часть природных и физиологически релевантных белков-мишеней содержит мотив РххР. Примеры, приведенные ниже, показывают, что доступны связывающие белки согласно настоящему изобретению для мишеней (например, ED-B домена фибронектина) с мотивами, иными, чем РххР. Следовательно, связывающий белок настоящего изобретения ни в коей мере не ограничен мотивом РххР и может иметь специфическую аффинность связывания в отношении любой конкретной мишени, например сахаров, полипептидов и т.д.

Более предпочтительно, связывающий белок согласно этому изобретению имеет специфическую аффинность связывания в отношении мишени 10^-7-10^-12 М, предпочтительно 10^-6-10^-12 М, предпочтительно к терапевтически и/или диагностически подходящей мишени, более предпочтительно к мишени на основе аминокислот, содержащей мотив РххР.

В наиболее предпочтительном аспекте связывающий белок согласно этому изобретению имеет специфическую (in vivo и/или in vitro) аффинность связывания в диапазоне 10^-7-10^-12 М, предпочтительно от 10^-6-10^-12 М, в отношении внеклеточного домена онкофетального фибронектина (ED-B).

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантному связывающему белку, содержащему, по меньшей мере, одно производное домена 3 (SH3) Src-гомологии киназы FYN, где

(а) по меньшей мере, одна аминокислота, находящаяся в Src-петле или расположенная на расстоянии вплоть до двух аминокислот рядом с Src-петлей, и/или

(b) по меньшей мере, одна аминокислота, находящаяся в RT-петле или расположенная на расстоянии вплоть до двух аминокислот рядом с RT-петлей, заменена, делегирована или добавлена, причем производное SH3-домена имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%-ную идентичность относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1,

предпочтительно при условии, что этот рекомбинантный связывающий белок не содержит аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2,

и, предпочтительно, этот рекомбинантный белок не является природным SH3-доменом, содержащим белок, существующим в природе,

где указанный связывающий белок имеет специфическую (in vivo и/или in vitro) аффинность связывания предпочтительно 10^-7-10^-12 М, предпочтительно 10^-6-10^-12 М, в отношении внеклеточного домена онкофетального фибронектина (ED-B).

В более предпочтительном варианте осуществления указанное производное SH3-домена имеет, по меньшей мере, 85%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, от 98 до 100% идентичности относительно домена 3 (SH3) Src-гомологии киназы FYN вне src- и RT-петель.

В другом более предпочтительном варианте осуществления вышеупомянутый ED-В-специфический связывающий белок содержит, по меньшей мере, два производных SH3-домена, предпочтительно он является двухвалентным связывающим белком.

Предпочтительно, указанный ED-B-специфический связывающий белок содержит один или несколько, предпочтительно два измененных, предпочтительно гидрофобных остатков в положениях 37 и/или 50 производного SH3-домена, в частности Trp37 и/или Tyr50, причем наиболее предпочтительными являются Trp37 и Tyr50.

Помимо специфической аффинности связывания в отношении полипептидных и белковых мишеней связывающий белок этого изобретения может также иметь специфическую аффинность связывания в отношении низкомолекулярных органических соединений или соединений не на основе аминокислот, например сахаров, олиго- или полисахаридов, жирных кислот и т.д.

Ряд слитых белков антитело-цитокин были уже исследованы в отношении применений, например, в лечении артрита или рака, часто с впечатляющими результатами. Например, антитело L19 человека, специфическое в отношении ED-B домена фибронектина (маркера ангиогенеза), использовали для доставки провоспалительных цитокинов (таких, как IL-2, IL-12 или TNF) к солидным опухолям, иногда с поразительной терапевтической пользой [в отношении обзора и соответствующих ссылок см. Neri & Bicknell, Nat. Rev. Cancer (2005) 5: 436-446, а также WO 01/62298].

В настоящее время связывающий белок настоящего изобретения используют для замены антител в слитых белках известного уровня техники, а также для конструирования новых и менее иммуногенных слитых (гибридных) для фармацевтических и диагностических применений in vivo и in vitro.

Во втором аспекте данное изобретение относится к слитому белку, содержащему связывающий белок этого изобретения, слитый с фармацевтически или диагностически активным компонентом.

Слитый белок этого изобретения может содержать неполипептидные компоненты, например непептидные линкеры, непептидные лиганды, например, для относящихся к терапии или диагностике радионуклидов.

Предпочтительно, указанный активный компонент является цитокином, предпочтительно цитокином, выбранным из группы, состоящей из IL-2, IL-12, TNF-альфа, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF₁ CD80, В70, TNF-бета, LT-бета, CD-40 лиганда, Fas-лиганда, TGF-бета, IL-1-альфа и IL-1-бета.

Более предпочтительно, указанный активный компонент является токсичным соединением, предпочтительно низкомолекулярным органическим соединением или полипептидом, предпочтительно токсичным соединением, выбранным из группы, состоящей из калихеамицина, неокарциностатина, эсперамицина, динемицина, кедарцидина, мадуропептина, доксорубицина, даунорубицина, ауристатина, А-цепи рицина, модеккина, укороченного экзотоксина Pseudomonas А, дифтерийного токсина и рекомбинантного гелонина.

В другом предпочтительном варианте осуществления слитый белок согласно изобретению представляет собой белок, в котором указанный активный компонент является хемокином, предпочтительно хемокином, выбранным из группы, состоящей из IL-8, GRO-альфа, GRO-бета, GRO-гамма, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 альфа/бета, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1-альфа, MIP-1-бета, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3-альфа, MIP-3-бета, MCP-1-5, эотаксина, эотаксина-2, 1-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, лимфотактина и фракталкина.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления связывающий белок этого изобретения содержит искусственные аминокислоты.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления слитого белка настоящего изобретения указанный активный компонент представляет собой флуоресцентный краситель, предпочтительно компонент выбран из группы, состоящей из Alexa Fluor или красителей Су (Berlier et al., «Quantitative Comparison of Long-wavelength Alexa Fluor Dyes to Cy Dyes: Fluorescence of the Dyes and Their Bioconjugates», J Histochem Cytochem. 51 (12): 1699-1712, 2003.); фотосенсибилизатора, предпочтительно бис(триэтаноламин)Sn(IV) хлорин е₆ (SnChe₆); прокоагулянтного фактора, предпочтительно тканевого фактора; фермента для активации пролекарства, предпочтительно фермента, выбранного из группы, состоящей из карбоксипептидаз, глюкуронидаз и глюкозидаз; радионуклида, либо из группы гамма-излучающих изотопов, предпочтительно, ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, или из группы излучателей позитронов, предпочтительно, ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y₁ ¹²⁴I, или из группы бета-излучателей, предпочтительно, ¹³¹I, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ⁶⁷Cu, или из группы альфа-излучателей, предпочтительно, ²¹³Bi₁ ²¹¹At; и/или функционального Fc-домена, предпочтительно функционального Fc-домена человека.

Вышеупомянутый функциональный Fc-домен позволит направлять иммунную реакцию млекопитающего к сайту специфического связывания мишени связывающего белкового компонента слитого белка, например, в терапевтических, профилактических и/или диагностических применениях.

Дополнительный предпочтительный вариант осуществления относится к слитым белкам согласно этому изобретению, указанным выше, дополнительно содержащим компонент, модулирующий время полужизни в сыворотке, предпочтительно компонент, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), иммуноглобулина и альбумин-связывающих пептидов.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления гибридный белок этого изобретения, как упоминалось выше, содержит связывающий белок этого изобретения, имеющий специфическую (in vivo и/или in vitro) аффинность связывания 10^-7-10^-12 М, предпочтительно 10^-8-10^-12 М, в отношении дополнительного домена онкофетального фибронектина (ED-B). Предпочтительно, указанный ED-B-специфический связывающий белок имеет один или несколько, предпочтительно два гидрофобных остатка в положениях 37 и/или 50 производного домена SH3, в частности Trp37 и/или Tyr50, причем Trp37 и Tyr50 являются наиболее предпочтительными.

Связывающие и слитые белки согласно этому изобретению могут быть получены любым из многих общепринятых и хорошо известных способов, таких как обычные органические синтетические приемы, твердофазные синтетические способы или способа с использованием коммерчески доступных автоматических синтезаторов. С другой стороны, они могут также быть получены только общепринятыми рекомбинантными способами или в сочетании с общепринятыми синтетическими способами.

Связывающие белки настоящего изобретения также могут быть выделены путем селекции из белковой библиотеки, полученной на основе Fyn SH3, как это описано в примерах. Существует множество способов получения библиотек и они, в том числе, включают получение библиотек путем рандомизации определенных участков. Получение библиотек с помощью данной методики описано в статьях Silacci et al. ("Design, construction, and characterization of a large synthetic human antibody phage display library" Proteomics 5: 2340-50, 2005), Hoogenboom & Winter ("By-passing Immunisation Human antibodies from synthetic repertoires of germline V_H gene segments rearranged in vitro" J. Mol. Biol 227: 381-88, 1992), Nissim et al. ("Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents" The EMBO Journal 13(3); 692-98, 1994), Hoogenboom ("Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibodies" TIBTECH 15: 62-70, 1997), Beste et al (Small antibody-like proteins with prescribed ligand specificities derived from lipocalpin fold" Proc. Natl. Sci USA 96: 1898-903, 1999) и Nygren & Skerra ("Binding proteins from alternative scaffolds" Journal of immunological methods 290: 3-28, 2004). В настоящем изобретении для получения библиотеки проводилась рандомизация участков, относящихся к Src- и RT-петле. Дополнительные аспекты настоящего изобретения относятся к (i) полинуклеотиду, кодирующему связывающий белок или слитый белок согласно этому изобретению, (ii) вектору, содержащему указанный нуклеотид, (iii) клетке-хозяину, содержащей указанный нуклеотид и/или указанный вектор.

Полинуклеотидами могут быть ДНК, РНК, ПНК и их любые аналоги. Векторы и клетки-хозяева могут относиться к любому обычному типу, который соответствует данной цели, например получению связывающих и слитых белков этого изобретения, терапевтически применимых векторов и клеток-хозяев, например, для генной терапии. Квалифицированный специалист в данной области сможет выбрать такие полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева из изобилующего известного уровня техники и подтвердить их индивидуальную пригодность для желаемой цели с использованием рутинных способов и без чрезмерных затрат.

Связывающие и гибридные белки настоящего изобретения не вызывают сильной иммунной реакции и предпочтительно по существу не вызывают иммунной реакции в млекопитающих, в людях и мышах, как было показано на мышах, и по аналогии ожидается, что это будет справедливо также и для людей, потому что Fyn SH3 идентичен в обоих типах млекопитающих. Неожиданно было показано, что ни нативный домен Fyn SH3, ни мутированный домен Fyn SH3 не вызывает иммунной реакции в мышах, инъецированных любым из них. Это было неожиданно, потому что киназа Fyn является внутриклеточным белком и не участвует в неонатальной селекции В-клеток. Таким образом, произведенные из Fyn SH3 связывающие и гибридные белки со сконструированной специфичностью и аффинностью относительно клеток-мишеней особенно хорошо подходят для терапевтических, профилактических и/или диагностических применений in vivo.

Таким образом, особенно значимый аспект настоящего изобретения относится к применению связывающих или слитых белков согласно этому изобретению для получения лекарственного средства.

В дополнительном аспекте связывающий или слитый белок настоящего изобретения используют для получения диагностических средств, в частности для применения in vivo. Предпочтительно. ED-B-специфический связывающий или гибридный белок, описанный выше, используют для получения лекарственных или диагностических средств для лечения и диагностики рака.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей связывающий или слитый белок настоящего изобретения и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент.

Другой аспект настоящего изобретения относится к диагностической композиции, предпочтительно, для применений in vivo, содержащей связывающий или слитый белок настоящего изобретения и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент.

Предпочтительно, фармацевтическая или диагностическая композиция содержит ED-B-специфический связывающий или слитый белок настоящего изобретения и необязательно фармацевтически приемлемый эксципиент.

Фармацевтические композиции или диагностические средства для применений in vivo в настоящем изобретении обычно содержат терапевтически или диагностически эффективное количество связывающего и/или слитого белка согласно настоящему изобретению и необязательно вспомогательные вещества, такие как фармацевтически приемлемый эксципиент (эксципиенты). Указанные фармацевтические композиции готовят способами, хорошо известными в фармацевтической области. Носитель или эксципиент могут быть жидким материалом, который может служить в качестве носителя или среды для активного ингредиента. Подходящие носители или эксципиенты хорошо известны в данной области и включают в себя, например, стабилизаторы, антиоксиданты, вещества, регулирующие рН, эксципиенты для контролируемого высвобождения. Фармацевтический препарат этого изобретения может быть применен, например, для парентерального применения и может быть введен пациенту в форме растворов или т.п.

Наконец, другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или диагностики, в котором эффективное количество вышеописанной фармацевтической или диагностической композиции вводят пациенту, нуждающемуся в этом, предпочтительно пациенту, страдающему или предположительно страдающему от рака и/или воспалительных заболеваний.

При проведении лечения или диагностики субъекта, страдающего от этих заболеваний, связывающий или слитый белок настоящего изобретения может быть введен в любой форме или любым способом, который делает терапевтическое или диагностическое соединение биодоступным в эффективном количестве, в том числе пероральными или парентеральным способами. Например, композиции настоящего изобретения можно вводить подкожно, внутримышечно, внутривенно и т.п. Специалист в области приготовления композиций может легко выбрать нужную форму и способ введения в зависимости от конкретных свойств выбранного продукта, заболевания или состояния, подлежащего лечению или диагностике, стадии заболевания и других релевантных обстоятельств (см., например, Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (1990)). Композиции настоящего изобретения можно вводить отдельно или в форме фармацевтического или диагностического препарата в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами, соотношение и природа которых определяются растворимостью и химическими свойствами выбранного продукта, выбранным способом введения и стандартной фармацевтической и диагностической практикой. Продукты настоящего изобретения, будучи сами эффективными, могут быть приготовлены в виде смеси и введены в форме их фармацевтически приемлемых солей, например кислотно-аддитивных солей или основно-аддитивных солей, для целей стабильности, удобства кристаллизации, повышения растворимости и т.п.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует дот-блот анализ. Процент клонов, экспрессирующих детектируемое количество растворимых SH3-мутантов Fyn, определяли дот-блот анализом лизатов бактериальных клеток с использованием конъюгата анти-HIS-HRP антитела (Sigma) в качестве детектирующего реагента. Пероксидазную активность детектировали с использованием системы детектирования для Вестерн-блоттинга ECL plus (Amersham).

A) Fyn SH3-мутанты с рандомизированной RT-Src-петлей.

B) Fyn SH3-мутанты с удлиненной (4->6) и рандомизированной n-Src-петлей.

C) FynSH3 с RT- и n-Src-рандомизированными петлями.

Фиг.2 иллюстрирует ELISA моноклональных фагов. После третьего цикла пэннинга против MSA моноклональные бактериальные супернатанты, содержащие фаги, представляющие Fyn SH3-мутанты, тестировали при помощи ELISA с использованием планшетов MaxiSorp (Nunc), покрытых MSA (100 мкг/мл в течение ночь, 100 мкл на лунку). Связанные фаги детектировали с использованием конъюгатов антител против М-13 с hrp (Amersham).

Фиг.3 иллюстрирует ELISA (против MSA) моноклональных фагов после одного цикла селекции созревания аффинности с использованием планшетов MaxiSorp (Nunc), покрытых MSA (100 мкг/мл в течение ночи, 100 мкл на лунку).

A) ELISA фагов первой суббиблиотеки G4 (рандомизированная n-Src-петля и Trp37 и Tyr50). Исходный клон G4 указан стрелкой.

B) ELISA фагов второй суббиблиотеки G4 (рандомизированная и удлиненная n-Src-петля). Исходный клон G4 указан стрелкой.

C) ELISA фагов первой и второй суббиблиотеки после одного цикла пэннинга, выполненного в условиях, благоприятствующих действию связывающих агентов с длинной k_off. Исходный клон G4 указан стрелкой.

Фиг.4 показывает данные ELISA растворимых фракций (с использованием планшетов MaxiSorp (Nunc), покрытых MSA (100 мкг/мл в течение ночи, 100 мкл на лунку) нескольких MSA-связывающих клонов, после клонирования (pQE-12 вектор), экспрессии и очистки растворимого белка в соответствиями с инструкциями производителя (Qiagen, нативные условия). В качестве детектирующих агентов использовали конъюгаты антител против HIS с HRP. В качестве контроля те же связывающие белки добавляли в лунки, блокированные только 4% MPBS.

Фиг.5 - ELISA растворимого белка на специфичность. Отобранные MSA-связывающие Fyn SH3-мутанты были тестированы на связывание против сывороточного альбумина человека (HSA), сывороточного альбумина крысы (RSA), бычьего сывороточного альбумина (BSA) и овальбумина с использованием планшетов MaxiSorp (Nunc), покрытых различными альбуминами (каждым по 100 мкг/мл в течение ночи, 100 мкл на лунку).

Фиг.6 - BIACore-анализ D3. Используемые концентрации: 4, 2, 1, и 0,5 мкМ (сверху вниз).

Фиг.7 - ELISA-анализ проб крови на присутствие мышиных антител.

A) Планшеты MaxiSorp (Nunc) покрывали Fyn SH3 (20 мкг/мл в течение н