Способы генетического контроля поражения растений насекомыми и применяемые для этого композиции

Способы генетического контроля поражения растений насекомыми и применяемые для этого композиции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Приведение в качестве ссылки списка последовательности, представленного на компакт-диске

Список последовательности представлен на одном компакт-диске (Копия 1), вместе с его дубликатом (Копия 2), каждый из которых создан 15 сентября 2006, и каждый из которых содержит один файл размером 669 КБ, имеющий имя "MNDE002.APP.TXT." Материал, содержащийся на компакт-диске, особым образом приведен здесь в качестве ссылки.

Испрашивание приоритета

Эта заявка испрашивает приоритет Предварительной заявки США Сер. № 60/718034, поданной 16 сентября 2005, которая приведена здесь в качестве ссылки в полном объеме.

Уровень техники

1. Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в основном к генетическому контролю поражения паразитами. А именно, настоящее изобретение относится к технологиям рекомбинантной ДНК для посттранскрипционного репрессинга или ингибирования экспрессии заданных кодирующих последовательностей в клетках паразитов для обеспечения защитного эффекта от паразитов.

2. Описание предшествующего уровня техники

Окружающая среда, в которой живут люди, насыщена паразитами. Паразиты, включая насекомых, паукообразных, ракообразных, грибки, бактерии, вирусы, нематоды, плоских червей, круглых червей, острицы, анкилостомы, ленточных червей, трипаносомы, шистосомы, оводов, блох, зудней, клещей и вшей и т.п. распространены в среде, окружающей человека. В попытке контроля над поражениями этими паразитами применяли множество средств. Композиции для контроля над поражениями микроскопическими паразитами, такими как бактерии, грибки и вирусы, предоставляли в форме антибиотических композиций, противовирусных композиций и противогрибковых композиций. Композиции для контроля над поражениями паразитами больших размеров, такими как нематоды, плоские черви, круглые черви, острицы, сердечные черви, солитеры, трипаносомы, шистосомы и т.п. обычно имели форму химических композиций, которые можно наносить на поверхности, на которых присутствуют паразиты, или вводить пораженным животным в форме гранул, порошков, таблеток, паст или капсул и т.п. В области техники существует большая потребность в улучшении этих способов и особенно в способах, которые будут оказывать благоприятное воздействие на окружающую среду по сравнению с предшествующими способами.

Коммерческие зерновые культуры часто являются объектами поражения насекомыми. В последние несколько десятилетий достигнут существенный прогресс в разработке более эффективных способов и композиций для управления поражением растений насекомыми. Химические пестициды были очень эффективны в ликвидации поражений паразитами. Однако, существует ряд недостатков применения химических пестицидных агентов. Химические пестицидные агенты являются неселективными. При применении химических пестицидов, предназначенных для контроля над беспозвоночными паразитами, такими как жесткокрылые насекомые, включая виды кукурузных жуков, которые губительны для различных зерновых культур и других растений, также оказывается воздействие на фауну, не являющуюся мишенью, что часто эффективно стерилизует область на период времени, в течение которого применяются пестицидные агенты. Химические пестицидные агенты персистируют в окружающей среде и в основном медленно подвергаются метаболизму, если это и имеет место. Они аккумулируются в цепи питания и особенно у видов высших хищников. Аккумулирование этих химических пестицидных агентов приводит к развитию устойчивости к агентам, и у видов, находящихся выше на эволюционной лестнице, агенты могут действовать как мутагены и/или канцерогены, вызывая необратимые и губительные генетические модификации. Таким образом, весьма длительно существует потребность в безвредных для окружающей среды способах контроля или искоренения паразитирования насекомых на или в растениях, т.е. в способах, которые являются селективными, инертными к окружающей среде, неустойчивыми, и биоразлагаемыми, и которые хорошо подходят для схем менеджмента устойчивости паразитов.

Композиции, содержащие бактерии Bacillus thuringiensis (Bt), были коммерчески доступны и применялись в качестве экологически безопасных и приемлемых инсектицидов в течение более тридцати лет. Инсектицидный эффект бактерий Bt не сохраняется в окружающей среде, бактерии высокоселективны в отношении пораженных видов-мишеней, проявляют свои эффекты только при приеме внутрь паразитом-мишенью, и, как показано, являются безопасными для растений и других организмов, для которых они не предназначены, включая людей. Трансгенные растения, содержащие один или более генов, кодирующих инсектицидный белок Bt, также доступны в области техники и заметно эффективны в контроле поражения насекомыми паразитами. Реальным результатом применения рекомбинантных растений, экспрессирующих инсектицидные белки Bt, является заметное уменьшение количества химических пестицидных агентов, которые применяются в окружающей среде для контроля поражения паразитами на полях с сельскохозяйственными культурами в областях, в которых применяют подобные трансгенные зерновые культуры. Уменьшение применения химических пестицидных агентов привело к более чистым почвам и более чистой воде, стекающей из почвы в окружающие ручьи, реки, пруды и озера. В дополнение к этим преимуществам в отношении окружающей среды наблюдалось значительное увеличение числа полезных насекомых на полях с сельскохозяйственными культурами, на которых произрастают трансгенные сельскохозяйственные культуры, устойчивые к насекомым, вследствие уменьшения применения химических инсектицидных агентов.

Антисмысловые способы и композиции описаны в области техники и, как полагают, оказывают эффекты посредством синтеза одноцепочечной молекулы РНК, которая, в теории, гибридизируется in vivo с образованием в основном комплементарной смысловой цепочки молекулы РНК. Антисмысловую технологию было трудно применять во многих системах по трем основным причинам. Во-первых, антисмысловая последовательность, экспрессируемая в трансформированной клетке, является неустойчивой. Во-вторых, неустойчивость антисмысловой последовательности, экспрессируемой в трансформированной клетке, одновременно создает затруднение в доставке последовательности хозяину, типу клетки или биологической системе, находящейся на расстоянии от трансгенной клетки. В-третьих, затруднения, связанные с неустойчивостью и доставкой антисенсорной последовательности, создают затруднения в попытке предоставления в пределах рекомбинантной клетки, экспрессирующей антисенсорную последовательность, дозы, которая может эффективно модулировать уровень экспрессии заданной смысловой нуклеотидной последовательности.

Существуют немногочисленные улучшения в технологиях модулирования уровня экспрессии генов в клетках, тканях или организме, и, в частности, не хватает разработанных технологий для задержки, репрессинга или другого ослабления экспрессии специфичных генов с применением технологии рекомбинантной ДНК. Кроме того, как следствие непредсказуемости этих подходов, не доступны никакие коммерчески приемлемые средства для модулирования уровня экспрессии специфичного гена в эукариотическом или прокариотическом организме.

Ранее демонстрировалась двухцепочечная РНК, опосредующая ингибирование специфичных генов у различных паразитов. Подходы к генетическому контролю, опосредованные дцРНК, тестировали на плодовых мушках Drosophila melanogaster (Kennerdell и Carthew, 1998; Kennerdell и Carthew, 2000). Kennerdell и Carthew (1998) описывают способ доставки дцРНК, включающий создание трансгенных насекомых, которые экспрессируют двухцепочечные молекулы РНК, или введение растворов дцРНК в организм насекомого или в защитную оболочку яйца до, или во время эмбрионального развития.

Ранее исследователи доказали, что супрессии генов, опосредованной двухцепочечной РНК, можно достигнуть у нематод либо с помощью кормления, либо с помощью выдерживания нематод в растворах, содержащих двухцепочечные или малые интерферирующие молекулы РНК, и с помощью введения молекул дцРНК. Rajagopal и др. (2002) описали неудачные попытки супрессии эндогенного гена у личинок насекомого паразита Spodoptera litura с помощью кормления или выдерживания новорожденных личинок в растворах, содержащих дцРНК, специфичный для заданного гена, но успешную супрессию после введения в гемолимфу личинкам 5-й возрастной стадии дцРНК, применяя микроаппликатор. Недавно Yadav и др. (2006) сообщили, что произведенная хозяином дцРНК, образующаяся в растениях, может защищать такие растения от инфицирования нематодами. Точно так же в опубликованной заявке на патент США № 2003/0150017 описан предпочтительный локус ингибирования личинок чешуекрылого Helicoverpa armigera с помощью доставки дцРНК в личинки посредством поедания растения, трансформированного для продукции дцРНК. Согласно положениям WO 2005/110068 в пищевом рационе кукурузного жука (CRW) обеспечивается наличие CRW-специфичной дцРНК, направленной на жизненно-важные гены CRW. дцРНК предоставляется в пищевом рационе CRW in vitro и in planta, что в результате приводит к замедлению роста личинок CRW или их гибели после поедания продуктов из пищевого рациона, и этот эффект был продемонстрирован для нескольких различных генов.

Таким образом, существует потребность в выявлении эффективных нуклеотидных последовательностей для применения в улучшенных способах модуляции экспрессии генов с помощью репрессинга, задержки или другого ослабления экспрессии генов у конкретного жесткокрылого паразита с целью контроля поражения паразитом или для привнесения новых фенотипических признаков.

Сущность изобретения

В одном аспекте изобретение предоставляет способ ингибирования экспрессии гена-мишени у жесткокрылого паразита. В некоторых вариантах осуществления способ включает модуляцию или ингибирования экспрессии одного или более генов-мишеней у жесткокрылого паразита, что вызывает прекращение пищевой активности, роста, развития, репродукции и/или инфекционности и в конечном счете приводит к гибели насекомого. Способ включает введение частично или полностью стабилизированной двухцепочечной РНК (дцРНК), включая ее модифицированные формы, такие как последовательности малой интерферирующей РНК (siРНК), в клетки или во внеклеточное пространство, например в среднюю кишку, в организме жесткокрылого паразита, где дцРНК поступает в клетки и ингибирует экспрессию по крайней мере одного или более генов-мишеней, и при этом ингибирование оказывает губительный эффект на жесткокрылого паразита. Способы и сопутствующие композиции могут применяться для ограничения или устранения паразитирования жесткокрылого паразита в организме или на поверхности любого хозяина паразита, симбионта паразита или окружающей среде, в которой присутствует паразит, с помощью обеспечения наличия в диете паразита одной или более композиций, включающих дцРНК молекулы, описанные здесь. Способ будет иметь в частности преимущество в защите растений от поражения насекомыми. В одном варианте осуществления паразит определяется как имеющий pH пищеварительной системы в пределах диапазона от приблизительно 4,5 до приблизительно 9,5, от приблизительно 5 до приблизительно 9, от приблизительно 6 до приблизительно 8, и от приблизительно 7,0.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет примерные композиции нуклеиновой кислоты, которые являются гомологичными по крайней мере части одной или более нативных последовательностей нуклеиновой кислоты у паразита-мишени. В некоторых вариантах осуществления паразит выбран из числа Diabrotica sp., включая западного кукурузного жука (WCR, Diabrotica virgifera или Diabrotica virgifera virgifera), южного кукурузного жука (SCR, Diabrotica undecimpunctata howardi), мексиканского кукурузного жука (MCR, Diabrotica virgifera zeа), бразильского кукурузного жука (BZR, Diabrotica balteata, Diabrotica viridula, Diabrotica speciosa), северного кукурузного жука (NCR, Diabrotica barberi), Diabrotica undecimpunctata; а также картофельного колорадского жука (CPB, Leptinotarsa decemlineata), хрущака каштанового (RFB, Tribolium castaneum) и Мексиканскую зерновку бобовую (Epilachna varivestis). В других вариантах осуществления паразит выбран из числа чешуекрылых насекомых, включая Мотылька кукурузного (ECB, Ostrinia nubilalis], Черную совку (BCW, Agrotis ipsilon), Совку хлопковую (CEW, Helicoverpa zeа), совку травяную (FAW, Spodoptera frugiperda), хлопкового долгоносика (BWV, Anthonomus grandis) тутового шелкопряда (Bombyx mori) и Manduca sexta, и из двукрылых насекомых, включая Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae и Aedes aegypti. Специфичные примеры таких нуклеиновых кислот, предоставляемых в соответствии с изобретением, даны в приложенном списке последовательностей с SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906.

В еще одном аспекте изобретение предоставляет способ супрессии экспрессии гена у жесткокрылого паразита, такого как кукурузный жук или у родственных видов, который включает шаг обеспечения в пищевом рационе паразита в количестве, вызывающем супрессию гена, по крайней мере одной молекулы дцРНК, транскрибированной от нуклеотидной последовательности, как описано здесь, по крайней мере один сегмент которой является комплементарным последовательности мРНК в клетках паразита. Способ может далее включать наблюдение гибели, ингибирования, остановки роста или прекращения пищевой активности паразита. Молекула дцРНК, включая ее модифицированную форму, такую как молекула siРНК, скармливаемая паразиту в соответствии с изобретением, может быть по крайней мере от приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или приблизительно 100% идентичной молекуле РНК, транскрибированной от нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей с SEQ ED NO:1 по SEQ ID NO:906. В отдельных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:697, SEQ ID NO:813-819, SEQ ID NO:841 и SEQ ID NO:874.

Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения предоставляется набор изолированных и очищенных нуклеотидных последовательностей, как указано с SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906. Настоящее изобретение предоставляет стабилизированную дцРНК молекулу или экспрессию одной или более miРНКs для ингибирования экспрессии гена-мишени у жесткокрылого паразита, экспрессируемого от этих последовательностей и их фрагментов. Стабилизированная молекула дцРНК, включая miРНК или siРНК, может включать по крайней мере две кодирующих последовательности, которые расположены в смысловой и антисмысловой ориентации относительно по крайней мере одного промотора, при этом нуклеотидная последовательность, которая включает смысловую цепь и антисмысловую цепь, связывает или соединяет с помощью спейсерной последовательности по крайней мере от приблизительно пяти до приблизительно одной тысячи нуклеотидов, при этом смысловая цепь и антисмысловая цепь могут быть различной длины, и при этом каждая из двух кодирующих последовательностей имеет по крайней мере 80% идентичность последовательности, по крайней мере 90%, по крайней мере 95%, по крайней мере 98%, или 100% идентичность последовательности любой одной или более нуклеотидной последовательности(ям), указанным с SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906.

Далее изобретение предоставляет фрагмент или конкатемер последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, включающей от SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906. В специфических вариантах осуществления нуклеотидная последовательность может включать фрагмент или конкатемер последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:697, SEQ ID NOs:813-819, SEQ ID NO:841, и SEQ ID NO:874.

Фрагмент может быть определен как вызывающий гибель, ингибирование, остановку роста или прекращение пищевой активности паразита при экспрессии в виде дцРНК и предоставлении паразиту. Фрагмент может, например, включать по крайней мере приблизительно 19, 21, 23, 25, 40, 60, 80, 100, 125 или более смежных нуклеотидов из любой одной или более последовательностей с SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, или их комплементов. Один полезный сегмент ДНК для применения в настоящем изобретении имеет длину по крайней мере от приблизительно 19 до приблизительно 23, или от приблизительно 23 до приблизительно 100 нуклеотидов, до приблизительно 2000 нуклеотидов или более. Особенно эффективными будут последовательности дцРНК, включающие от приблизительно 23 до приблизительно 300 нуклеотидов, гомологичных заданной последовательности паразита. Изобретение также предоставляет рибонуклеиновую кислоту, экспрессируемую от любой из таких последовательностей, включая дцРНК. Последовательность, выбранная для применения в экспрессии агента супрессии гена, может быть создана из одной последовательности, полученной от одного или более паразитов-мишеней и предназначенной для применения в экспрессии РНК, которая участвует в супрессии одного гена или семейства генов в одном или более паразите-мишени, или эта последовательность ДНК может быть создана в виде химеры из множества последовательностей ДНК.

В еще одном аспекте изобретение предоставляет рекомбинантные конструкты ДНК, включая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую описанную здесь молекулу дцРНК. дцРНК может быть сформирована с помощью транскрипции одной цепи молекулы дцРНК от нуклеотидной последовательности, которая является по крайней мере от приблизительно 80% до приблизительно 100%, идентичной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей от SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906. Такие рекомбинантные конструкты ДНК могут быть определены как продуцирующие молекулы дцРНК, способные ингибировать экспрессию эндогенного гена(ов)-мишени в клетке паразита после приема внутрь. Конструкт может включать нуклеотидную последовательность изобретения, операбельно связанную с промоторной последовательностью, которая функционирует в клетке хозяина. Такой промотор может быть тканеспецифичным и может, например, быть специфичным к типу ткани, которая является объектом поражения паразитом. Например, в случае жуков, паразитирующих на корнях растений, может быть желательно применение промотора, обеспечивающего корнеспецифичную экспрессию.

Конструкты нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением могут включать по крайней мере одну нуклеотидную последовательность не природного происхождения, которая может быть транскрибирована в одноцепочечную РНК, способную к образованию молекулы дцРНК in vivo посредством гибридизации. Такие последовательности дцРНК собираются самостоятельно и могут обеспечиваться в пищевом рационе жесткокрылого паразита для достижения желательного ингибирования.

Рекомбинантный конструкт ДНК может включать две различные последовательности не природного происхождения, которые при экспрессии in vivo в виде последовательности дцРНК и нахождении в пищевом рационе жесткокрылого паразита ингибируют экспрессию по крайней мере двух различных генов-мишеней в клетке жесткокрылого паразита. В некоторых вариантах осуществления в клетке или растении, включающем клетку, продуцируются по крайней мере 3, 4, 5, 6, 8 или 10 или более различных дцРНК, которые обладают эффектом ингибирования паразита. дцРНК может экспрессироваться от множества конструктов, включенных в различные объекты трансформации, или может быть включена одиночную молекулу нуклеиновой кислоты. дцРНК могут экспрессироваться с помощью одиночного промотора или множества промоторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения продуцируются одиночные дцРНК, которые включают нуклеиновые кислоты, гомологичные множеству локусов у паразита.

В еще одном аспекте изобретение предоставляет рекомбинантное клетки хозяина, имеющие в своем геноме по крайней мере одну рекомбинантную последовательность ДНК, которая транскрибируется для продукции по крайней мере одной молекулы дцРНК, которая после принятия внутрь жесткокрылым паразитом осуществляет ингибирование экспрессии гена-мишени у паразита. Молекула дцРНК может быть закодирована любой из нуклеиновых кислот, описанных здесь и указанных в списке последовательностей. Настоящее изобретение также предоставляет трансформированную клетку растения, имеющую в своем геноме по крайней мере одну описанную здесь рекомбинантную последовательность ДНК. Также предоставляются трансгенные растения, включающие такую трансформированную клетку растения, включая потомство растений любого поколения, семена и продукты растений, каждое из которых включает рекомбинантную ДНК.

Способы и композиции настоящего изобретения могут быть применимы к любому однодольному и двудольному растению, в зависимости от желаемого контроля жесткокрылого паразита. В частности, к растениям относятся, не ограничиваясь ими, люцерна, укроп, яблоко, абрикос, артишок, рукола, спаржа, авокадо, банан, ячмень, бобы, свекла, ежевика, черника, брокколи, брюссельская капуста, капуста кочанная, канола, канталупа, морковь, маниока, цветная капуста, сельдерей, вишня, кинза, цитрусовые, климентины, кофе, кукуруза, хлопок, огурцы, дугласова пихта, баклажан, эндивий, эскариоль, эвкалипт, фенхель, фикус, тыква, виноград, грейпфрут, дыня мускатная белая, хикама, киви, салат-латук, лук-порей, лимон, лайм, сосна ладанная, манго, дыня, грибы, орех, овес, окра, лук, апельсин, декоративные растения, папайя, петрушка, горох, персик, арахис, груша, перец, хурма, сосна, ананас, банан, слива, гранат, тополь, картофель, тыква, айва, сосна лучистая, радиккио, редька, малина, рис, рожь, сорго обыкновенное, южная сосна, соя, шпинат, патиссон, земляника, сахарная свекла, сахарный тростник, подсолнечник, сладкий картофель, амбровое дерево, мандарин, чай, табак, томаты, дерн, виноградная лоза, арбуз, пшеница, ямс и цукини. Таким образом, изобретение также представляет растение, трансформированное с помощью рекомбинантной последовательности ДНК, как указано с SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:906, или ее конкатемера, фрагмента, или комплемента, который транскрибируется для продукции по крайней мере одной молекулы дцРНК, которая после приема внутрь жесткокрылым паразитом приводит к ингибированию экспрессии гена-мишени у паразита. В специфических вариантах осуществления рекомбинантная последовательность ДНК может быть выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:697, SEQ ID NO:813-819, SEQ ID NO:841, и SEQ ID NO:874, или их фрагмента, комплемента или конкатемера.

Изобретение также предоставляет комбинации способов и композиций для контроля поражения жесткокрылыми паразитами. Тогда как в методах предоставляется способ дцРНК, как описано здесь, для защиты растения от поражения насекомым наряду с одним или более инсектицидными агентами, который обладает свойствами, отличными от свойств, характерных для способов и композиций дцРНК. Например, один или более Bt белков можно включить в пищевой рацион насекомых паразитов в комбинации с одной или более дцРНК, как описано здесь. Композицию, сформулированную для местного нанесения или получаемую с помощью трансгенного подхода, который объединяет способы и композиции дцРНК с Bt, можно применять для обеспечения синергий, которые ранее не были известны в области техники для контроля поражения насекомыми. При этом синергия является сокращением уровня экспрессии, требуемой либо для дцРНК, либо для белка(ов) Bt. При объединении вместе для контроля вредителей может применяться наименьшая эффективная доза каждого агента. Полагают, что инсектицидные белки Bt создают входные поры, через которые молекулы дцРНК способны более эффективно проникать в места, находящиеся на расстоянии от кишечника насекомого-паразита, или более эффективно проникать в клетки, находящиеся вблизи участков повреждения, созданных белками Bt, таким образом, требуется меньшее количество либо Bt, либо дцРНК для достижения желаемого инсектицидного результата или желаемого ингибирования или супрессии заданной биологической функции у паразита-мишени.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет композицию, которая содержит два или более различных пестицидных агента, каждый из которых является токсичным для одного и того же вида паразита или насекомого, по крайней мере один из которых включает описанную здесь дцРНК. В некоторых вариантах осуществления второй агент может быть агентом, выбранным из группы, состоящей из пататина, инсектицидного белка Bacillus thuringiensis, инсектицидного белка Xenorhabdus, инсектицидного белка Photorhabdus, инсектицидного белка Bacillus laterosporous, инсектицидного белка Bacillus sphaericus и лигнина. Инсектицидный белок Bacillus thuringiensis может быть любым из множества инсектицидных белков, включая, но не ограничиваясь ими, Cry1, Cry3, TIC851, CryETTO, Cry22, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417, бинарный инсектицидный белок CryET33 и CryET34, бинарный инсектицидный белок CryETSO и CryET76, бинарный инсектицидный белок TIC100 и TIC101, бинарный инсектицидный белок PS149B1, инсектицидный белок VIP, TIC900 или родственный белок, или комбинации инсектицидных белков ET29 или ET37 с инсектицидными белками TIC810 или TIC812, и инсектицидными химерами любого из вышеуказанных инсектицидных белков.

Рибонуклеиновую кислоту, которую вносят в пищевой рацион, можно вносить в искусственный пищевой субстрат, составленный для обеспечения специфических потребностей в питательных веществах для содержания паразита на таком пищевом субстрате. Пищевой субстрат может быть подкреплен контролирующим паразита количеством РНК, очищенной от системы отдельной экспрессии, для определения количества композиции РНК, контролирующего паразита, или определения степени супрессивной активности после приема внутрь подкрепленного пищевого субстрата паразитом. Пищевой субстрат может также быть рекомбинантной клеткой, преобразованной с помощью последовательности ДНК, созданной для экспрессии агента, РНК, или агента супрессии гена. После приема внутрь паразитом одной или более таких трансформированных клеток наблюдается желаемый фенотипический результат, указывающий на то, что агент функционирует, ингибируя экспрессию заданной нуклеотидной последовательности, которая присутствует в клетках паразита.

Ген, на который направлена супрессия, может кодировать жизненно-необходимый белок, определенная функция которого выбрана из группы, включающей образование мышц, образование ювенильных гормонов, ювенильную гормональную регуляцию, ионную регуляцию и транспорт, синтез и транспорт белка, синтез пищеварительных ферментов, поддержание мембранного потенциала клетки, биосинтез аминокислот, распад аминокислот, образование мужских половых клеток, синтез феромонов, чувствительность к феромонам, образование щупалец, образование крыльев, образование конечностей, развитие и дифференцировку, образование яиц, созревание личинок, образование пищеварительных ферментов, синтез гемолимфы, поддержание гемолимфы, передачу нервных импульсов, деление клетки, энергетический метаболизм, дыхание, неизвестную функцию и апоптоз.

Другой аспект настоящего изобретения также предоставляет способы повышения размера урожая, получаемого от сельскохозяйственной культуры, подвергнутой поражению насекомыми-паразитами, указанный способ включает шаги a) введения полинуклеотида, включающего последовательность, выбранную от SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906, или ее комплемент, или конкатемер, или фрагмент, в указанную сельскохозяйственную культуру; и b) выращивания сельскохозяйственной культуры для возможности экспрессии указанного полинуклеотида, при этом экспрессия полинуклеотида ингибирует поедание насекомыми-паразитами и потерю урожая вследствие поражения паразитами.

В некоторых вариантах осуществления экспрессия полинуклеотида приводит к образованию молекулы РНК, которая вызывает супрессию по крайней мере первого гена-мишени у насекомого-паразита, который поедал часть указанного сельскохозяйственного растения, при этом ген-мишень выполняет по крайней мере одну существенную функцию, выбранную из группы, включающей пищевую функцию паразита, жизнеспособность паразита, апоптоз клеток паразита, дифференцировку и развитие паразита или любой клетки паразита, половое размножение паразита, образование мышц, возбуждение мышц, сокращение мышц, образование и/или уменьшение содержания ювенильных гормонов, ювенильную гормональную регуляцию, ионную регуляцию и транспорт, поддержание мембранного потенциала клетки, биосинтез аминокислот, распад аминокислот, образование мужских половых клеток, синтез феромонов, чувствительность к феромонам, образование щупалец, образование крыльев, образование конечностей, образование яиц, созревание личинок, образование пищеварительных ферментов, синтез гемолимфы, поддержание гемолимфы, передачу нервных импульсов, переход в личиночную стадию, окукливание, выход из состояния окукливания, деление клеток, энергетический метаболизм, дыхание, синтез и поддержание структуры цитоскелета, метаболизм нуклеотидов, азотистый обмен, потребление воды, задержку воды и сенсорное восприятие.

В других вариантах осуществления насекомое-паразит является кукурузный жуком паразитом, выбранным из группы, включающей Diabrotica undecimpunctata howardi (Южный кукурузный жук (SCR)), Diabrotica virgifera virgifera (Западный кукурузный жук (WCR)), Diabrotica barberi (Северный кукурузный жук (NCR)), Diabrotica virgifera zea (Мексиканский кукурузный жук (MCR)), Diabrotica balteata (Бразильский кукурузный жук (BZR)), Diabrotica viridula (Бразильский кукурузный жук (BZR)) и Diabrotica speciosa (Бразильский кукурузный жук (BZR)).

Также предоставляются способы улучшения устойчивости к засухе сельскохозяйственной культуры, полученной из сельскохозяйственной культуры, подвергнутой поражению насекомым-паразитом, указанный способ включает шаги a) включения полинкулеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906, или их фрагмента, в указанную сельскохозяйственную культуру; и b) культивирования сельскохозяйственной культуры для возможности экспрессии указанного полинуклеотида, при этом экспрессия полинуклеотида ингибирует поедание насекомыми-паразитами и потерю устойчивости к засухе вследствие поражения паразитом.

Еще один аспект изобретения далее предоставляет агрономически и коммерчески важные продукты и/или химические композиции, включая, но не ограничиваясь ими, корм для животных, сырье, продукты и побочные продукты, которые предназначены для применения в качестве пищи для потребления человеком или для применения в композициях и сырьевых продуктах, которые предназначены для потребления человеком, включая, но не ограничиваясь ими, кукурузный порошок, кукурузную муку, кукурузную патоку, кукурузное масло, кукурузный крахмал, попкорн, кукурузный жмых, зерновые продукты и т.п. Такие композиции могут быть определены как содержащие поддающиеся обнаружению количества приведенной здесь нуклеотидной последовательности и, таким образом, также являются диагностическими для любого трансгенного объекта, содержащего такие нуклеотидные последовательности. Эти продукты полезны по крайней мере, потому что их предполагается получать из сельскохозяйственных культур, выращенных с меньшим количеством пестицидов и органофосфатов в результате включения в них нуклеотидов настоящего изобретения, для контроля поражения растений жесткокрылыми паразитами. Такое сырье и сырьевые продукты могут быть получены из семян, полученных от трансгенных растений, при этом трансгенное растение экспрессирует РНК от одного или более смежных нуклеотидов настоящего изобретения или нуклеотидов одного или более жесткокрылых паразитов и их комплементов. Такое сырье и сырьевые продукты могут также быть эффективны в контроле жесткокрылых паразитов такого сырья и сырьевых продуктов, таком как, например, контроль мучного хрущака, благодаря наличию в сырье или сырьевом продукте РНК, подавляющей ген паразита, экспрессируемой из генной последовательности, укзанной в настоящем изобретении.

Также предоставляется способ получения такого сырьевого продукта, включающий получение растения, трансформированного с помощью полинуклеотида, включающего последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906, или их конкатемер, или фрагмент, или комплемент, и получения сырьевого продукта из растения или его части. Далее, другим аспектом изобретения является способ изготовления пищевого или кормового продукта, включающий получение растения, трансформированного с помощью полинуклеотида, выбранного из группы, включающей SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906 или их фрагмент или часть, и изготовление пищевого или кормового продукта из указанного растения или его части.

Изобретение также предоставляет машиночитаемый носитель с записанными на него одной или более нуклеотидными последовательностями, указанной в SEQ ID NO:1 до SEQ ID NO:906, или их комплементами, для применения в множестве компьютерных приложений, включая, но не ограничиваясь, поиск идентичности и подобия ДНК, поиск идентичности и подобия белка, определение характеристик транскрипционного профилирования, проведение сравнения между геномами и исследование искусственной гибридизации.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: Биоанализ растительных объектов кукурузы F1, трансформированных с помощью pMON98503 (SEQ ID NO:820) и обследованных на наличие Западного кукурузного жука (WCR).

Фиг. 2: Биоанализ растительных объектов кукурузы F1, трансформированных с помощью pMON98504, включающих конкатемер C1 (SEQ ID NO:821) и обследованных на наличие Западного кукурузного жука (WCR).

Фиг. 3: Выбор фрагментов Dv49 и Dv248 и схематическая структура конкатемера C38 Dv49-Dv248.

Фиг. 4: дцРНК F1-F13, синтезированные на основе конкатемера C38.

Фиг. 5: Дозозависимая реакция на конкатемер 38 DV49-DV248 (Фрагменты F1-F6).

Фиг. 6: Дозозависмая реакция на конкатемер 38 DV49-DV248 (Фрагменты F7-F10).

Фиг. 7: Дозозависмая реакция на конкатемер 38 DV49-DV248 (Фрагменты F11-F13).

Подробное описание изобретения

Далее представлено подробное описание изобретения для помощи специалистам в области техники в осуществлении настоящего изобретения. Обычный специалист в области техники может вносить модификации и изменения в описанные здесь варианты осуществления, не отступая от сущности или объема настоящего изобретения.

Настоящее изобретение предоставляет способы и композиции для генетического контроля поражения паразитами. Например, настоящее изобретение предоставляет технологии рекомбинантной ДНК для посттранскрипционного репрессинга или ингибирования экспрессии заданной кодирующей последовательности в клетке паразита для обеспечения защитного эффекта от паразита с помощью скармливания паразиту одной или более молекул двухцепочечных или малых интерферирующих рибонуклеиновых кислот (РНК), считанных со всей или части заданной кодирующей последовательности, таким образом контролируя поражение. Поэтому настоящее изобретение относится к последовательность-специфичному ингибированию экспрессии кодирующих последовательностей с помощью двухспиральной РНК (дцРНК), включая малую интерферирующую РНК (siРНК), для достижения заданных уровней контроля паразита.

Предполагается, что изолированные и в основном очищенные молекулы нуклеиновой кислоты, включая, но не ограничиваясь ими, не встречающиеся в природе нуклеотидные последовательности и рекомбинантные конструкции ДНК, для транскрипции молекул дцРНК настоящего изобретения вызывают супрессию или ингибирование экспрессии эндогенной кодирующей последовательности или заданной кодирующей последовательности у паразита при введении в последнего. Также предоставляются трансгенные растения, которые (a) содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие изолированные и в основном очищенные молекулы нуклеиновой кислоты, и не встречающиеся в природе рекомбинантные конструкции ДНК для транскрипции молекул дцРНК для контроля поражения растения паразитами, и (b) проявляют устойчивость и/или повышенную толерантность к поражению насекомыми. Также описаны композиции, содержащие дцРНК нуклеотидные последовательности настоящего изобретения, для применения в виде местного нанесения на растения или на животных, или внесения в среду, окружающую животное, для достижения устранения или уменьшения поражения паразитами.

В данном изобретении изобретатели обнаружили, что вопреки положениям предшествующего уровня техники скармливание композиции, содержащей двухцепочечные молекулы РНК, состоящие из последовательностей, обнаруживаемых в одной или более экспрессируемых нуклеотидных последовательностях вида жесткокрылых, видам, от которых были получены нуклеотидные последовательност